基于網絡藥理學方法探討地榆治療結直腸癌的作用機制▲

繆濤聲 黃夢芬 陳明榆 鄭鴻銘 李逸婷 胡芝凡 莫喬蘭 邱澤鑫 陳 斌

(1 廣州中醫(yī)藥大學第一臨床醫(yī)學院,廣東省廣州市 510006;2 廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院脾胃科,廣東省廣州市 510405)

結直腸癌是全球第三大癌癥,也是癌癥相關死亡的主要原因之一[1]。我國2015年癌癥中心數據顯示,結直腸癌位于惡性腫瘤死亡譜第五位、發(fā)病譜第三位[2]。近年來,我國70歲以上人群的結直腸癌疾病負擔明顯增加,中國老年人群的結直腸癌防控形勢嚴峻,需要采取相關措施以減輕其疾病負擔[3]。結直腸癌的早期癥狀主要表現為腹痛、便血[4-5],在中醫(yī)中證屬“血證”中的下焦出血,在中醫(yī)古籍中常被稱為“下血”“痣血”等。如今中醫(yī)藥已被廣泛應用于結直腸癌的治療[6],從清熱解毒、益氣健脾、滋補肝腎等多角度提供新的治療方案[7]。地榆記載于《神農本草經》,有涼血止血、解毒斂瘡之效,主要用于治療便血、痣血等,目前已有研究表明地榆的水提取物可通過阻滯Wnt/β-連環(huán)蛋白(β-catenin)信號通路起到治療結直腸癌的作用[8]。然而,關于地榆治療結直腸癌的主要成分、作用靶點及其他的潛在調節(jié)機制尚未完全明確。網絡藥理學可通過預測中藥所含化合物的靶點和藥理作用,構建藥物-基因-疾病網絡,挖掘其可能的調節(jié)機制[9]。本研究基于網絡藥理學探索地榆治療結直腸癌的作用機制,為地榆的臨床應用提供參考。

1 資料與方法

1.1 平臺資料與軟件 中藥系統(tǒng)藥理學數據庫與分析平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform,TCMSP;https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php),UniProt蛋白質數據庫(https://www.uniprot.org/),藥物靶標數據庫(Therapeutic Target Database,TTD;http://db.idrblab.net/ttd/),OMIM?數據庫(https://omim.org/),GeneCards?數據庫(https://www.genecards.org/),STRING數據庫(https://cn.string-db.org/),Metascape線上軟件(https://metascape.org/),Cytoscape 3.7.2軟件,GraphPad Prism 9軟件。

1.2 研究方法

1.2.1 地榆有效活性成分的篩選及其作用靶點的預測:登錄TCMSP數據庫,以“地榆”為關鍵詞,設置篩選條件為口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%和類藥性(drug likeness,DL)≥0.18,檢索地榆的有效活性成分。再利用TCMSP數據庫檢索有效活性成分對應的作用靶點。最后在UniProt數據庫中,將“Popular organisms”限定為“Human”,“Status”選擇“Reviewed(Swiss-Prot)”,將相關靶點轉化為標準基因名,并使用Cytoscape 3.7.2軟件繪制“中藥-成分-靶點”網絡。

1.2.2 收集結直腸癌的相關靶點:以“Colorectal Cancer”為關鍵詞,在TTD、OMIM?數據庫和GeneCards?數據庫檢索結直腸癌相關靶點,將靶點導入Microsoft Excel表格匯總,刪除重復靶點并進行標準化處理。

1.2.3 地榆有效活性成分作用靶點與結直腸癌相關靶點共同靶點的獲取:將地榆有效活性成分的作用靶點與結直腸癌相關靶點取交集,即為地榆治療結直腸癌的作用靶點,利用UniProt數據庫將共同靶點名稱轉換為標準基因名,繪制韋恩圖。

1.2.4 “中藥-成分-靶點-疾病”網絡和“中藥-共同靶點-疾病”網絡的構建與分析:將篩選得到的地榆有效活性成分及其作用靶點信息導入Cytoscape 3.7.2軟件構建“中藥-成分-靶點-疾病”網絡,并分析地榆有效活性成分的度值。將共同靶點信息輸入STRING數據庫,蛋白種屬設置為“Homo Sapiens”,得到蛋白-蛋白相互作用(protein-protein interaction,PPI)網絡數據,再將數據導入Cytoscape 3.7.2軟件進行可視化處理,得到PPI網絡,即“中藥-共同靶點-疾病”網絡。

1.2.5 富集分析:針對共同靶點,采用Metascape線上軟件進行基因本體論(Gene Ontology,GO)功能富集分析及京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路富集分析,將蛋白種屬設置為“Homo Sapiens”,其中GO通路包括生物學過程、細胞組分、分子功能。將數據進行可視化處理后得到氣泡圖。

2 結 果

2.1 地榆的有效活性成分及其作用靶點 利用TCMSP數據庫檢索到地榆有效活性成分共41個,根據篩選條件最終篩選得到有效活性成分13個。在TCMSP數據庫中搜索上述13個成分的作用靶點(表1),因甜茶皂甙R1、3-O-沒食子酰原花青素、棕兒茶素B-3、4,甲基-6-O-沒食子酰-β-D-吡喃葡萄糖苷在TCMSP數據庫中無相關作用靶點信息,為減少數據異質性,最終納入地榆9個有效活性成分,包括槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇等。通過UniProt數據庫將相關作用靶點轉化為標準基因名并刪除重復項后,最終得到154個地榆有效活性成分的作用靶點。構建“中藥-成分-靶點”網絡(圖1),其中紅色菱形節(jié)點為地榆的有效活性成分,節(jié)點越大代表度值越大,根據度值從大到小將成分按逆時針順序排列,藍色圓形節(jié)點為有效活性成分的作用靶點,外環(huán)是度值為0～1的靶點,中環(huán)是度值為2～3的靶點,內環(huán)是度值>3的靶點。

表1 地榆的有效活性成分信息

圖1 “中藥-成分-靶點”網絡

2.2 結直腸癌相關靶點及地榆治療結直腸癌的靶點 通過檢索TTD數據庫、OMIM?數據庫、GeneCards?數據庫,共篩選出結直腸癌相關靶點1 908個。將其與地榆有效活性成分的154個作用靶點取交集,共獲得94個共同靶點,繪制韋恩圖(圖2),其中藍紫色圓圈代表地榆有效活性成分的作用靶點,黃色圓圈為結直腸癌相關靶點,交集部分為地榆治療結直腸癌的靶點。

圖2 韋恩圖

2.3 “中藥-成分-靶點-疾病”網絡 利用Cytoscape 3.7.2軟件構建“中藥-成分-靶點-疾病”網絡,直觀展示地榆有效活性成分與結直腸癌靶點之間的關聯程度與相互作用關系,見圖3。圖中橙色六邊形節(jié)點代表地榆,黃色正方形節(jié)點代表結直腸癌,紅色菱形節(jié)點代表地榆的有效活性成分,藍色圓形節(jié)點代表共同靶點。通過Cytoscape 3.7.2軟件對“中藥-成分-靶點-疾病”網絡進行分析,得到度值排名前3的有效活性成分為槲皮素、山柰酚與β-谷甾醇。

圖3 “中藥-成分-靶點-疾病”網絡圖

2.4 PPI網絡 通過STRING數據庫和Cytoscape 3.7.2軟件構建地榆治療結直腸癌的作用靶點的PPI網絡(見圖4)。在該PPI網絡中,節(jié)點的顏色越深、越靠近中心、直徑越大代表其度值越高,且同一圓圈上度值從大到小按逆時針順序排列;每條邊代表節(jié)點之間的關系,線條越多提示關聯度越大。該PPI網絡的平均度值為37,度值位于前20的靶點包括腫瘤蛋白p53(tumor protein p53,TP53)、蘇氨酸蛋白激酶(threonine protein kinase,AKT)1、Caspase-3、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)、表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)、白細胞介素(interleukin,IL)-6、血管內皮生長因子A(vascular endothelial growth factor A,VEGFA)等(見圖5),這些靶點可能是地榆治療結直腸癌的關鍵作用靶點。

圖4 PPI網絡圖

圖5 PPI網絡中度值位于前20的靶點

2.5 富集分析結果 采用Metascape網站對94個地榆治療結直腸癌的作用靶點進行GO功能富集分析與KEGG通路富集分析。94個共同靶點共涉及1 387個生物學過程、55個細胞組分、116個分子功能,按-lgP值從小到大進行排序,選取排名前20的條目進行可視化分析,其中涉及的生物學過程主要有細胞群增殖的負調控、凋亡信號通路的調控、蛋白質磷酸化的正向調節(jié)等,涉及的細胞組分主要有膜筏、細胞外基質、內質網腔、染色體區(qū)域等,涉及的分子功能主要有激酶結合、蛋白激酶活性、內肽酶活性、核受體活性等。94個共同靶點共富集至173條通路,根據-lgP值大小篩選排名前20的主要通路,包括癌癥信號通路、磷脂酰基醇3-激酶(phosphoinositide 3-kinase,PI3K)/AKT信號通路等。見圖6。

圖6 KEGG通路富集分析與GO功能富集分析結果圖

3 討 論

結直腸癌是常見的惡性腫瘤,其發(fā)病率逐年升高,已成為全球第三大高發(fā)癌癥,是全球癌癥死亡的主要原因之一[1]。近年來,隨著生活習慣的改變,亞洲人群結直腸癌的發(fā)病率也越來越高[10],我國結直腸癌的發(fā)病率與病死率均呈上升趨勢,是威脅我國人民健康的重要因素之一[11]。目前,結直腸癌的主要治療方法有手術治療、放療、化療等,但這些治療方法存在治療費用較高、副作用較大、患者依從性較差等缺點。中醫(yī)藥因其具有簡便性、安全性等特點,已成為結直腸癌的治療方法之一。朱月伊等[12]發(fā)現,四君子湯可通過降低程序性死亡受體1/程序性死亡配體1的表達,抑制自然殺傷細胞的活性與結腸癌細胞的增殖。還有研究顯示,復方苦參注射液對結腸癌細胞的增殖具有抑制作用,并可誘導結腸癌細胞發(fā)生凋亡[13]。

地榆藥性苦、酸、澀,微寒,有涼血止血、收斂止血、解毒斂瘡之功效?！侗静菁s言》中提到地榆“性沉寒,惟治下焦”,因此地榆常被用于治療下焦出血。結直腸癌的主要癥狀為腹痛、便血,因此有醫(yī)家提出采用中藥治療結直腸癌時可配伍地榆[14]?，F代藥理學研究表明地榆的水提取物可通過阻滯Wnt/β-catenin信號通路起到治療結直腸癌的作用[8],但其潛在的作用機制尚未完全明確。本研究采用網絡藥理學方法對地榆治療結直腸癌的有效活性成分及其作用機制進行研究,最終共篩選出9個地榆有效活性成分,其中度值排名前3的有效活性成分為槲皮素、山柰酚與β-谷甾醇。研究表明,槲皮素可通過調節(jié)轉化生長因子-β1/Smad3蛋白信號通路,抑制下游8號染色體上的MYC的表達,從而抑制結腸癌LOVO細胞的生長[15]。在結直腸癌Kirsten大鼠中,肉瘤病毒癌基因同源物(Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog,KRAS)和B-Raf原癌基因絲氨酸/蘇氨酸激酶(B-Raf proto-oncogene,serine/threonine kinase,BRAF)基因發(fā)生突變,槲皮素可同時作用于KRAS和BRAF,從而抑制結直腸癌細胞增殖,促進其凋亡[16]。山柰酚為黃酮醇類化合物,提高山柰酚的攝入量可以降低結腸癌、胃癌、胰腺癌的發(fā)生率[17-18]。有學者利用下一代測序等技術發(fā)現山柰酚可抑制結腸癌細胞增殖、轉移和侵襲,同時促進結腸癌細胞發(fā)生凋亡和自噬[19]。

通過PPI網絡分析得到地榆治療結直腸癌的關鍵作用靶點,包括TP53、AKT1、TNF等。TP53基因是17號染色體上的抑癌基因,其編碼的蛋白質在調節(jié)細胞周期、DNA修復和細胞凋亡方面,以及在癌癥易感性及癌癥的進展中發(fā)揮重要作用[20-21]。TP53基因突變可引起高頻率的DNA損傷,造成微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(microsatellite instability,MSI),促進癌癥的發(fā)生[22]。TP53功能的喪失還可以促進腸道細胞的增殖,并使其細胞周期調節(jié)失控,這也是結直腸癌發(fā)生的核心機制[23]。有研究顯示,TP53基因的突變與結直腸癌的發(fā)生顯著相關[24]。Nakayama等[25]發(fā)現,TP53基因的突變可通過多種機制誘導核因子κB及癌癥相關通路的激活,促進腸上皮-間質轉化和炎癥反應的發(fā)生,加速結直腸癌的進展,提示TP53功能缺失是結直腸癌發(fā)生的潛在危險因素之一。AKT1是PI3K信號通路的關鍵節(jié)點,PI3K/AKT信號通路可傳遞抗凋亡信號,并與癌細胞的生長、代謝及腸上皮-間質轉化等密切相關[26]。有研究顯示AKT1的過度活化可導致細胞增殖、分化及代謝等正常生理功能紊亂,而腫瘤細胞的過度增殖有助于其浸潤和轉移[27]。Agarwal等[26]的研究表明,結直腸癌小鼠中可伴隨AKT1的活化及下游致癌信號通路的激活,抑制AKT1的磷酸化可能是抑制結直腸癌發(fā)生與發(fā)展的重要途徑。TNF是參與核因子κB 信號通路的重要轉錄調節(jié)因子,核因子-κB信號通路廣泛參與癌癥的發(fā)生和發(fā)展,在結直腸癌細胞的增殖、凋亡、轉移等過程中發(fā)揮著關鍵作用[28-29],因此TNF也是防治結直腸癌的重要靶點[29]。

本研究的GO功能富集分析結果顯示,地榆治療結直腸癌的作用靶點涉及的生物學過程主要有細胞群增殖的負調控、凋亡信號通路的調控、蛋白質磷酸化的正向調節(jié)等;涉及的細胞組分主要有細胞外基質、內質網腔、染色體區(qū)域等;涉及的分子功能主要有激酶結合、蛋白激酶活性、內肽酶活性、核受體活性等。腫瘤細胞遷移是腫瘤侵襲和轉移的關鍵環(huán)節(jié),膜筏、細胞外基質、染色體區(qū)域等皆是細胞信號傳遞的重要位點,其可能與結直腸癌的侵襲轉移相關[30]。蛋白激酶活性、激酶結合與蛋白質的磷酸化密切相關,結合PPI網絡分析與GO中的生物學過程分析,我們推測地榆可能通過調節(jié)TP53、AKT等蛋白的磷酸化,激活PI3K/AKT等信號通路,調控細胞增殖、分化、凋亡等,從而達到治療結直腸癌的目的。

本研究的KEGG通路富集分析結果顯示,地榆治療結直腸癌涉及的通路主要有癌癥信號通路、PI3K/AKT信號通路等。PI3K/AKT信號通路是結直腸癌發(fā)生與發(fā)展的關鍵通路。Duan等[31]發(fā)現,次黃苷單磷酸脫氫酶2可通過調節(jié)PI3K/AKT信號通路促進結直腸癌細胞的增殖、侵襲、遷移和上皮-間質轉化。Jiang等[32]的研究表明,結直腸癌患者血清環(huán)狀RNA IL4R水平較正常人升高且與結直腸癌的不良預后相關,進一步研究發(fā)現環(huán)狀RNA IL4R可通過PI3K/AKT信號通路發(fā)揮促進結直腸癌發(fā)生與發(fā)展的作用?；谏鲜鲅芯拷Y果,有學者嘗試通過調節(jié)PI3K/AKT信號通路治療結直腸癌,如Wei等[33]發(fā)現腫瘤抑制因子同源物4可抑制PI3K/AKT信號通路,從而抑制結直腸癌細胞的上皮-間質轉化并促使其發(fā)生自噬。本研究結果顯示,地榆治療結直腸癌的關鍵作用靶點AKT1、EGFR及IL-6等均是PI3K/AKT信號通路中的一部分,因此PI3K/AKT信號通路可能是地榆治療結直腸癌的關鍵通路。有學者發(fā)現,地榆的有效活性成分之一槲皮素可以通過抑制PI3K/AKT信號通路來發(fā)揮抗癌作用[34-35]。Na等[36]發(fā)現,槲皮素在抑制PI3K/AKT磷酸化的同時可上調Caspase-3和B細胞淋巴瘤2相關X蛋白的表達,從而促進小鼠結腸癌細胞凋亡,進而發(fā)揮治療結腸癌的作用。

綜上所述,地榆中的多種有效活性成分可能通過TP53、AKT1、TNF、EGFR、IL-6等靶點來作用于膜筏、細胞外基質、內質網腔、染色體區(qū)域等細胞組分,實現蛋白質的磷酸化、細胞增殖及凋亡等分子功能,以及調節(jié)PI3K/AKT信號通路等生物過程,從而發(fā)揮治療結直腸癌的作用。本研究基于網絡藥理學方法對地榆治療結直腸癌的潛在機制進行研究,預測地榆治療結直腸癌的可能作用通路,為地榆治療結直腸癌的實驗研究提供了方向。