佛手散改善谷氨酸鈉誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的作用機(jī)制▲

馮麗旋 郭學(xué)軍 張永斌 陳 苑

(廣州中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心,廣東省廣州市 510405)

阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease,AD)是一種神經(jīng)退行性疾病,可引起一系列的神經(jīng)病變,導(dǎo)致記憶、認(rèn)知、行為異常,甚至引發(fā)癡呆[1-2]。谷氨酸作為一種興奮性神經(jīng)遞質(zhì),細(xì)胞外谷氨酸水平過高可導(dǎo)致神經(jīng)元死亡和神經(jīng)退行性疾病。谷氨酸誘導(dǎo)的興奮性毒性一方面可通過釋放大量的谷氨酸和Ca2+內(nèi)流實現(xiàn),另一方面也可通過氧化應(yīng)激介導(dǎo)[3]。細(xì)胞外過量的谷氨酸受體可增加細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度,高濃度的細(xì)胞內(nèi)Ca2+可誘導(dǎo)活性氧簇大量產(chǎn)生,導(dǎo)致線粒體凋亡[4-6]。此外,胱氨酸是谷胱甘肽的前體,而細(xì)胞外的谷氨酸鹽可通過抑制細(xì)胞對胱氨酸的吸收,導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽水平下降,誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激并導(dǎo)致細(xì)胞死亡[3,7]。因此本研究推測氧化應(yīng)激是谷氨酸誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的主要原因。

隨著傳統(tǒng)中醫(yī)藥在頑固性疾病治療中的應(yīng)用日益增多[8-10],中醫(yī)藥治療AD的研究也得到快速發(fā)展,其中由當(dāng)歸和川芎組成的佛手散已被廣泛應(yīng)用于神經(jīng)退行性疾病的治療[11-14]。體外實驗顯示,佛手散中的當(dāng)歸、川芎可通過協(xié)同作用發(fā)揮防治帕金森病的作用[15]。佛手散水煎劑可改善實驗性腦缺血所致的大鼠神經(jīng)行為學(xué)障礙、腦水腫程度及腦梗死體積[16]。此外,佛手散可通過調(diào)節(jié)腸-肝-腦軸來改善表達(dá)嵌合小鼠/人淀粉樣蛋白前體蛋白和突變的人早老素1的雙轉(zhuǎn)基因小鼠腸道微生物群失調(diào),調(diào)節(jié)堿性磷酸酶活性、脂多糖和丙二醛水平,從而改善AD小鼠的認(rèn)知功能[17]。而本課題組早期也通過系統(tǒng)藥理學(xué)研究和初步的細(xì)胞實驗驗證了佛手散治療AD的分子機(jī)制與其抑制細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流、減少細(xì)胞內(nèi)一氧化氮含量有關(guān)[18]。然而,佛手散治療AD的抗氧化和抗細(xì)胞凋亡機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。因此,本研究探討佛手散改善谷氨酸鈉誘導(dǎo)PC12 細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的作用機(jī)制,為佛手散的臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗儀器:SW-CJ-1FD超凈工作臺購自蘇州凈化設(shè)備公司,Multiskan MK3酶標(biāo)儀購自Thermo Fisher Scientific公司, FACSCalibur型流式細(xì)胞儀購自Becton,Dickinson and company公司,INC108型細(xì)胞培養(yǎng)箱購自Memmert公司。

1.1.2 實驗藥品與試劑:當(dāng)歸飲片(批號:161101)和川芎飲片(批號:170401)均購自廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院,并經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)喻良文副教授鑒定分別為傘形科植物當(dāng)歸的干燥根和傘形科植物川芎的干燥根莖。

谷氨酸鈉購自上海麥克林生化科技股份有限公司(CAS編號:142-47-2;批號:L810495-100g);超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)檢測試劑盒、谷胱甘肽檢測試劑盒、丙二醛檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所(批號:A001-3-1、A003-1-1、A006-2-1);活性氧簇檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司(批號:S0033S);Caspase-3抗體和B細(xì)胞淋巴瘤2(B-cell lymphoma 2,Bcl-2)抗體購自武漢博士德生物工程有限公司(批號:BA2142、BA0412);Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax)抗體購自Abcam公司(批號:Ab32503);胎牛血清購自Thermo Fisher Scientific公司(批號:10099-141);RPMI-1640培養(yǎng)基購自HyClone公司(批號:SH30809.01B);胰蛋白酶購自GENVIEW公司(批號:9002-07-7);RIPA裂解液、脫脂奶粉、TWEEN?20、GAPDH抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠、ECL液購自武漢賽維爾生物科技有限公司(批號:G2002、G5002、WGT8220、GB12002、GB23303、GB23301、G2014);二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)蛋白定量試劑盒購自Thermo Fisher Scientific公司(批號:23227);其他試劑均為分析純,水為蒸餾水。

1.1.3 實驗細(xì)胞:PC12細(xì)胞購自美國菌種保藏中心。

1.2 實驗方法

1.2.1 佛手散的制備:按照2010年版《中華人民共和國藥典》[19]配制佛手散。具體煎煮方法:當(dāng)歸、川芎按3 ∶2的質(zhì)量比稱重,加入8倍體積的水煎煮2 h,收集藥液,再加入6倍體積的水繼續(xù)煎煮2 h,收集藥液,混合兩次藥液,60 ℃濃縮藥液至最終濃度為0.64 g/mL,-20 ℃保存?zhèn)溆谩；谝延械难芯糠椒╗16],使用前再將濃縮藥液從冰箱中取出,解凍后用蒸餾水稀釋至所需濃度。

1.2.2 分組及細(xì)胞造模:PC12細(xì)胞用含有10%胎牛血清和1%雙抗(鏈霉素+青霉素)的RPMI-1640培養(yǎng)基,在37 ℃、5% CO2、相對飽和濕度的條件下培養(yǎng),每2～3 d更換一次培養(yǎng)基。當(dāng)細(xì)胞長至融合度為80%時,用胰酶消化后制備成單細(xì)胞懸液。將細(xì)胞接種到6孔板,密度調(diào)整為每孔2×105個,置于37 ℃、5% CO2、相對飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),并將細(xì)胞隨機(jī)分為對照組、模型組、佛手散低劑量組、佛手散中劑量組、佛手散高劑量組,每組設(shè)置3個復(fù)孔。根據(jù)本課題組的前期研究結(jié)果[20],以及有關(guān)細(xì)胞活性和凋亡的研究結(jié)果[18],將佛手散低、中、高劑量分別設(shè)定為32 mg/mL、64 mg/mL和128 mg/mL。

在佛手散低劑量、中劑量、高劑量組細(xì)胞中分別加入500 μL終濃度分別為32 mg/mL、64 mg/mL和128 mg/mL的佛手散預(yù)處理1 h,對照組和模型組用等體積PBS預(yù)處理1 h,除對照組外,其余各組均加入80 μL終濃度為 40 mmol/L谷氨酸鈉孵育24 h,構(gòu)建PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷模型,用于后續(xù)實驗。

1.2.3 SOD、丙二醛、谷胱甘肽和活性氧簇含量的檢測:收集各組細(xì)胞,根據(jù)檢測試劑盒說明書的操作方法測定各組PC12細(xì)胞SOD、丙二醛、谷胱甘肽和活性氧簇含量。

1.2.4 Caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)水平的檢測:收集各組細(xì)胞,用PBS反復(fù)沖洗,采用RIPA裂解液(含蛋白酶抑制劑)在冰上裂解細(xì)胞30 min,隨后4 ℃下以12 000 r/min離心10 min,收集上清液,即為細(xì)胞的總蛋白。采用BCA蛋白定量試劑盒檢測蛋白濃度。將蛋白質(zhì)樣品煮沸變性后采用SDS-PAGE分離蛋白,然后轉(zhuǎn)至PVDF膜上。用5%脫脂奶粉- TWEEN?20在室溫下封閉PVDF膜1 h。使用TBST洗膜3次,5 min/次。然后分別加入3 mL稀釋后的Caspase-3抗體(1 ∶1 000)、Bax抗體(1 ∶1 000)、Bcl-2抗體(1 ∶1 000),4 ℃孵育過夜。使用TBST洗膜3次,5 min/次。然后加入3 mL稀釋后的辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔抗體(1 ∶5 000),在室溫下孵育40 min,使用TBST洗膜3次,7 min/次。以GAPDH(1 ∶5 000)為內(nèi)參,用ECL顯色,暗室曝光顯影,采用凝膠圖像分析系統(tǒng)測定目的蛋白條帶的灰度值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。符合正態(tài)分布的計量資料以(x±s)表示,多組間比較采用單因素方差分析,方差齊時兩兩比較采用 LSD-t檢驗,方差不齊時兩兩比較采用Dunnett′s T3檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 5組PC12細(xì)胞SOD、丙二醛、谷胱甘肽和活性氧簇含量的比較 模型組PC12細(xì)胞的SOD、谷胱甘肽含量低于對照組,丙二醛和活性氧簇含量高于對照組(均P<0.05)。佛手散低劑量組、佛手散中劑量組、佛手散高劑量組PC12細(xì)胞的SOD和谷胱甘肽含量高于模型組,丙二醛和活性氧簇含量低于模型組,且上述指標(biāo)的變化呈劑量依賴性(均P<0.05)。見表1。

表1 5組PC12細(xì)胞SOD、丙二醛、谷胱甘肽和活性氧簇含量的比較(x±s)

2.2 5組PC12細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)水平的比較 模型組PC12細(xì)胞的Caspase-3和Bax表達(dá)水平高于對照組,Bcl-2蛋白表達(dá)水平低于對照組(均P<0.05)。佛手散低劑量組、佛手散中劑量組、佛手散高劑量組PC12細(xì)胞的Caspase-3和Bax表達(dá)水平低于模型組,Bcl-2蛋白表達(dá)水平高于模型組(均P<0.05),其中Caspase-3和Bax蛋白表達(dá)水平的變化呈劑量依賴性(均P<0.05),Bcl-2蛋白表達(dá)水平總體上隨佛手散濃度的升高而升高。見表2和圖1。

圖1 5組PC12細(xì)胞中細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的電泳圖

表2 5組PC12細(xì)胞凋亡蛋白相對表達(dá)水平的比較(x±s)

3 討 論

研究顯示,當(dāng)歸和川芎的主要成分對受損PC12細(xì)胞有保護(hù)作用[21-22],因此推測由當(dāng)歸和川芎組成的佛手散也可能對谷氨酸誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷具有改善作用。本課題組前期的系統(tǒng)藥理學(xué)研究結(jié)果顯示,佛手散可通過抗氧化途徑治療AD[18],而且動物實驗表明佛手散具有抗氧化作用[17],細(xì)胞實驗也表明佛手散可通過抗氧化途徑調(diào)節(jié)受損PC12細(xì)胞內(nèi)的Ca2+和一氧化氮的濃度以起到細(xì)胞保護(hù)作用[18]。本研究進(jìn)一步探討佛手散改善谷氨酸鈉誘導(dǎo)PC12 細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的作用機(jī)制。

多項研究表明,AD患者大腦β淀粉樣蛋白(amyloid beta-protein,Aβ)異常積累和神經(jīng)纖維纏結(jié)沉積與氧化應(yīng)激損傷有關(guān)[23-26]。Aβ的產(chǎn)生與氧化應(yīng)激反應(yīng)呈正相關(guān),當(dāng)大腦發(fā)生氧化應(yīng)激損傷后,Aβ前體蛋白過表達(dá),導(dǎo)致Aβ的形成和積累,同時伴隨大量活性氧簇的產(chǎn)生,因此活性氧簇是AD發(fā)病的誘因之一[27],也是導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)受損、各種疾病狀態(tài)和衰老的重要原因之一[28]?；钚匝醮厮竭^高可能會導(dǎo)致自由基介導(dǎo)的連鎖反應(yīng),如破壞細(xì)胞脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、多糖甚至DNA[28]?；钚匝醮卣T發(fā)的氧化應(yīng)激損傷使丙二醛水平升高,SOD和谷胱甘肽水平下降[29]。提高SOD和谷胱甘肽水平后,其可通過分解活性氧簇來降低細(xì)胞中活性氧簇的含量,抑制活性氧過量形成,減輕氧化應(yīng)激損傷,同時抑制丙二醛的產(chǎn)生。因此,可通過檢測這三種氧化應(yīng)激副產(chǎn)物的水平來評價氧化應(yīng)激損傷的程度[28,30]。本研究結(jié)果顯示,模型組PC12細(xì)胞的SOD和谷胱甘肽含量低于對照組,丙二醛和活性氧簇含量高于對照組(均P<0.05)。這提示PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷模型構(gòu)建成功。高濃度的谷氨酸鈉可能通過抑制細(xì)胞對胱氨酸的攝取,使細(xì)胞無法維持一定的谷胱甘肽水平以保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷,導(dǎo)致細(xì)胞產(chǎn)生過多的活性氧簇,從而促使細(xì)胞內(nèi)丙二醛水平升高,SOD和谷胱甘肽水平下降[7]。而給予不同濃度佛手散預(yù)處理的PC12細(xì)胞丙二醛和活性氧簇含量低于模型組,SOD和谷胱甘肽含量高于模型組(均P<0.05),且指標(biāo)變化呈劑量依賴性,表明佛手散可以減輕谷氨酸鈉誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷,且濃度越高,佛手散的抗氧化作用越顯著,與既往研究[17,31]結(jié)論相似,提示佛手散或可對AD具有很好的抗氧化作用。

氧化應(yīng)激可引起線粒體功能紊亂,促進(jìn)細(xì)胞凋亡[32]。Bax和Bcl-2是兩種與細(xì)胞凋亡相關(guān)的蛋白,二者均屬于Bcl-2家族蛋白,Bcl-2家族蛋白與氧化應(yīng)激密切相關(guān),在調(diào)控線粒體凋亡通路中發(fā)揮重要作用。促凋亡蛋白Bax與Bak形成寡聚體后作用于線粒體外膜,導(dǎo)致線粒體外膜的通透性降低,使線粒體中的細(xì)胞色素C釋放到細(xì)胞質(zhì)中,激活凋亡因子Caspase-3,促進(jìn)細(xì)胞凋亡;抗凋亡蛋白Bcl-2可與Bax競爭結(jié)合于線粒體細(xì)胞膜上,形成Bcl-2/Bax二聚體,使線粒體通透性降低,細(xì)胞色素C釋放減少,從而抑制細(xì)胞凋亡[33-34]。因此,當(dāng)Bax和Caspase-3表達(dá)增加,Bcl-2表達(dá)降低時,細(xì)胞凋亡增加[35]。研究顯示,在哺乳動物和異體模型中Bax的表達(dá)升高可導(dǎo)致活性氧簇的產(chǎn)生和氧化損傷[36],而Bcl-2的表達(dá)升高可抑制由地塞米松和生長因子缺失引起的脂質(zhì)過氧化[37]。當(dāng)谷胱甘肽耗盡時,Bcl-2可通過增加或者改變細(xì)胞中谷胱甘肽的分布間接降低細(xì)胞中活性氧簇水平[36]。因此,Bcl-2家族蛋白可通過氧化應(yīng)激通路調(diào)控細(xì)胞的氧化損傷。本研究結(jié)果顯示,模型組PC12細(xì)胞的Caspase-3和Bax表達(dá)水平高于對照組,Bcl-2蛋白表達(dá)水平低于對照組(均P<0.05),說明谷氨酸鈉可通過調(diào)控Bax、Caspase-3和Bcl-2的表達(dá)來調(diào)控細(xì)胞凋亡,這種凋亡可能與谷胱甘肽水平下降引起的氧化應(yīng)激有關(guān)[7]。而給予不同濃度佛手散預(yù)處理的PC12細(xì)胞Caspase-3和Bax表達(dá)水平低于模型組PC12細(xì)胞,Bcl-2蛋白表達(dá)水平高于模型組PC12細(xì)胞(均P<0.05),其中Caspase-3和Bax表達(dá)水平的變化呈劑量依賴性,Bcl-2蛋白表達(dá)水平總體上隨佛手散濃度的升高而升高,說明佛手散具有很好的抗凋亡作用,且濃度越高,其抗凋亡作用越顯著。

綜上所述,佛手散可以通過提高細(xì)胞的抗氧化能力和減少細(xì)胞凋亡,來抑制谷氨酸鈉誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷,從而發(fā)揮保護(hù)神經(jīng)的作用。