肺結(jié)核患兒外周血單個(gè)核細(xì)胞miRNA-31、miRNA-146a表達(dá)水平檢測(cè)價(jià)值

宋 煜,王雅楠,徐 於,王聿佳,熊 英△

陜西省康復(fù)醫(yī)院:1.檢驗(yàn)科;2.兒科,陜西西安 710065

肺結(jié)核(PTB)是由結(jié)核分枝桿菌感染人體肺部引起的一種慢性傳染病,病情嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致人死亡,是威脅人類(lèi)生命健康安全的重大公共衛(wèi)生問(wèn)題之一[1]。相關(guān)調(diào)查數(shù)據(jù)顯示,兒童PTB在所有PTB患者中比例為10%,且兒童存在不同于成年人的發(fā)病特點(diǎn),包括免疫學(xué)發(fā)病機(jī)制、臨床癥狀及預(yù)后轉(zhuǎn)歸等[2]。由于兒童PTB臨床表現(xiàn)普遍不典型,且目前診斷技術(shù)有限,難以實(shí)現(xiàn)早期準(zhǔn)確診斷,易導(dǎo)致病情延誤,不利于患兒預(yù)后[3]。因此,尋找一種新型的標(biāo)志物進(jìn)行PTB早期診斷成為亟待解決的難題。微小核糖核酸(miRNA)是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一類(lèi)非編碼單鏈內(nèi)源性小分子RNA,主要通過(guò)與相關(guān)堿基配對(duì)來(lái)調(diào)節(jié)靶基因或(和)調(diào)控蛋白表達(dá),進(jìn)一步參與疾病的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程[4]。目前,國(guó)內(nèi)外已有不少關(guān)于miRNA和PTB的研究[5-6],但主要集中在成人PTB中,關(guān)于兒童PTB和miRNA的關(guān)系研究鮮見(jiàn)報(bào)道。鑒于此,本研究通過(guò)分析PTB兒童外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)miRNA-31、miRNA-146a表達(dá)水平,以及上述指標(biāo)與免疫細(xì)胞和炎癥因子的相關(guān)性,以期為兒童PTB的診斷和治療提供新的靶點(diǎn)和思路,現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取本院2019年2月至2022年2月收治的75例PTB患兒作為觀察組,其中男45例,女30例;年齡3～12歲,平均(6.12±1.30)歲。另選取本院同期健康體檢的70例兒童作為對(duì)照組,其中男42例,女28例;年齡3～12歲,平均(6.09±1.32)歲。兩組年齡、性別比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)觀察組所有患兒均符合《兒童肺結(jié)核的臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)和治療方案(試行)》[7]中的診斷標(biāo)準(zhǔn),對(duì)照組兒童體檢各項(xiàng)指標(biāo)和檢查結(jié)果均無(wú)異常;(2)年齡≤12歲;(3)入組前未接受相關(guān)治療;(4)臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)神志異常;(2)合并重要臟器疾病;(3)伴有重大感染或免疫性疾病。所有研究對(duì)象監(jiān)護(hù)人均知情本研究,并簽署知情同意書(shū)。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

1.2方法 (1)PBMC miRNA-31、miRNA-146a表達(dá)水平檢測(cè):采用無(wú)菌肝素抗凝真空采血管采集所有兒童靜脈血3 mL,以密度梯度離心法分離PBMC。采用Trizol法提取標(biāo)本總RNA,遵循miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(購(gòu)自北京Invitrogen公司)獲取cDNA保存至—80℃冰箱中備用,采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測(cè)PBMC miRNA-31、miRNA-146a表達(dá)水平。miRNA-31引物序列如下:上游引物為5′-GCCGCAGGCAGATGCTG-3′;下游引物為5′-CAGTGCTGGGTCCGAGTGA-3′。miRNA-146a引物序列如下:上游引物為5′-CATGATTGTATGACTGCACTC-3′;下游引物為5′-TCTTGCTAGGACTGACCA-3′。以U6作為miRNA內(nèi)參,上游引物為5′-AGCGAGCATCCCCCAAAGTT-3′;下游引物為5′-GGGCACGAAGGCTCATCATT-3′。所有引物均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。采用2-ΔΔCt法計(jì)算miRNA-31、miRNA-146a表達(dá)水平。(2)免疫細(xì)胞檢測(cè):采用FCM型流式細(xì)胞儀(購(gòu)自常州必達(dá)科生物科技有限公司)檢測(cè)T淋巴細(xì)胞亞群,指標(biāo)包括CD3+、CD4+、CD8+比例,并計(jì)算CD4+/CD8+比值。相關(guān)抗體均購(gòu)自金斯瑞生物科技股份有限公司。(3)炎癥因子檢測(cè):抽取所有受試者空腹靜脈血3 mL,離心半徑8 cm,3 500 r/min離心10 min獲取血清,采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)白細(xì)胞介素(IL)-2、IL-6、IL-8水平。所有操作均按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行,試劑盒均購(gòu)自深圳晶美生物科技有限公司。

1.3觀察指標(biāo) 比較兩組PBMC miRNA-31、miRNA-146a表達(dá)水平,以及T淋巴細(xì)胞亞群、炎癥因子水平;分析PBMC miRNA-31、miRNA-146a表達(dá)水平與T淋巴細(xì)胞亞群、炎癥因子的相關(guān)性,評(píng)估PBMC miRNA-31、miRNA-146a表達(dá)水平單獨(dú)及聯(lián)合檢測(cè)診斷兒童PTB的效能。

2 結(jié) 果

2.1兩組PBMC miRNA-31、miRNA-146a表達(dá)水平比較 與對(duì)照組比較,觀察組PBMC miRNA-31、miRNA-146a表達(dá)水平均升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 兩組PBMC miRNA-31、miRNA-146a表達(dá)水平比較

2.2兩組T淋巴細(xì)胞亞群水平比較 與對(duì)照組比較,觀察組CD3+比例、CD4+比例、CD4+/CD8+比值均降低,而CD8+比例升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 兩組T淋巴細(xì)胞亞群水平比較

2.3兩組炎癥因子水平比較 與對(duì)照組比較,觀察組IL-2、IL-6及IL-8水平均升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 兩組炎癥因子水平比較

2.4PTB患兒PBMC miRNA-31、miRNA-146a表達(dá)水平與T淋巴細(xì)胞亞群、炎癥因子水平的相關(guān)性分析 Pearson相關(guān)分析發(fā)現(xiàn),PTB患兒PBMC miRNA-31、miRNA-146a表達(dá)水平與CD3+、CD4+比例及CD4+/CD8+比值均呈負(fù)相關(guān)(P<0.05),與CD8+比例及IL-2、IL-6、IL-8水平均呈正相關(guān)(P<0.05)。見(jiàn)表4。

表4 PTB患兒PBMC miRNA-31、miRNA-146a表達(dá)水平與T淋巴細(xì)胞亞群、炎癥因子的相關(guān)性分析

2.5PTB患兒PBMC miRNA-31、miRNA-146a表達(dá)水平檢測(cè)診斷兒童PTB的效能 ROC曲線分析結(jié)果顯示,PBMC miRNA-31、miRNA-146a表達(dá)水平聯(lián)合檢測(cè)診斷兒童PTB的曲線下面積(AUC)均大于單項(xiàng)檢測(cè),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表5、圖1。

圖1 PBMC miRNA-31、miRNA-146a表達(dá)水平檢測(cè)診斷兒童PTB的ROC曲線

表5 PBMC miRNA-31、miRNA-146a表達(dá)水平檢測(cè)診斷兒童PTB的效能

3 討 論

結(jié)核病為常見(jiàn)的慢性傳染病之一,伴隨著病情的日益進(jìn)展,可累及多個(gè)器官,且以PTB最多見(jiàn),患者往往存在嚴(yán)重的肺組織損傷,進(jìn)而導(dǎo)致肺功能降低,嚴(yán)重威脅健康及生命[8-10]。因此,早期實(shí)現(xiàn)有效診斷與及時(shí)治療PTB是國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。miRNA不但扮演細(xì)胞內(nèi)基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)關(guān)鍵分子的角色,亦是多種病理狀態(tài)下的重要生物標(biāo)志物。近年來(lái),已有不少研究報(bào)道證實(shí),血液循環(huán)中的多種miRNA均可作為肺癌及肺炎等疾病的生物標(biāo)志物[11-13]。血清中PBMC或PBMC中的miRNA檢測(cè)為疾病診斷、療效評(píng)估及個(gè)性化治療均提供了操作簡(jiǎn)便的無(wú)創(chuàng)性檢測(cè)手段。因此,本研究通過(guò)分析兒童PTB PBMC miRNA-31、miRNA-146a表達(dá)水平,以及上述指標(biāo)與T淋巴細(xì)胞亞群和炎癥因子的相關(guān)性,對(duì)兒童PTB的診斷價(jià)值,旨在為上述兩項(xiàng)指標(biāo)作為兒童PTB的臨床診斷標(biāo)志物提供理論依據(jù)。

本研究結(jié)果表明,觀察組PBMC miRNA-31、miRNA-146a表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組,這提示兒童PTB PBMC miRNA-31、miRNA-146a均存在異常高表達(dá)?？赡苁怯捎趍iRNA-31主要介導(dǎo)Janus激酶/信號(hào)與轉(zhuǎn)錄激活子(JAK/STAT)及絲裂原激活的蛋白激酶(MAPK)等多種結(jié)核感染有關(guān)信號(hào)通路,并通過(guò)對(duì)上述相關(guān)信號(hào)通路活性的調(diào)控,進(jìn)一步抑制機(jī)體的免疫應(yīng)答,最終引發(fā)結(jié)核分枝桿菌的感染[14]。miRNA-146a高表達(dá)會(huì)提升巨噬細(xì)胞對(duì)細(xì)胞內(nèi)結(jié)核分枝桿菌的滅殺能力,進(jìn)而抑制該致病菌的生長(zhǎng)、繁殖,是機(jī)體應(yīng)對(duì)結(jié)核分枝桿菌感染時(shí)的自然應(yīng)答[15]。ROC曲線分析結(jié)果顯示,PBMC miRNA-31、miRNA-146a表達(dá)水平聯(lián)合檢測(cè)診斷兒童PTB的AUC均高于單項(xiàng)檢測(cè),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),提示臨床工作中可通過(guò)對(duì)上述兩項(xiàng)指標(biāo)表達(dá)水平進(jìn)行聯(lián)合檢測(cè)實(shí)現(xiàn)對(duì)兒童PTB的輔助診斷。此外,與對(duì)照組比較,觀察組CD3+、CD4+比例及CD4+/CD8+比值均降低,而CD8+比例升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),提示結(jié)核免疫屬于細(xì)胞免疫,主要是由單核巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的復(fù)雜免疫應(yīng)答過(guò)程,而CD3+、CD4+、CD8+比例及CD4+/CD8+比值均是細(xì)胞免疫的重要指標(biāo)。而PTB的發(fā)生會(huì)對(duì)患兒肺組織產(chǎn)生一定的損傷,進(jìn)而影響免疫應(yīng)答,最終導(dǎo)致上述指標(biāo)的異常表達(dá)[16]。另外,與對(duì)照組比較,觀察組IL-2、IL-6及IL-8水平均升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),提示IL-2、IL-6及IL-8均是臨床上應(yīng)用較為廣泛的炎癥因子,在機(jī)體出現(xiàn)創(chuàng)傷、感染等狀況時(shí),其在血清中水平急劇升高,可能對(duì)兒童PTB具有一定的輔助診斷作用。PTB患兒因肺組織遭受不同程度的損傷,進(jìn)而導(dǎo)致上述指標(biāo)出現(xiàn)應(yīng)激性升高,并參與疾病的進(jìn)展過(guò)程[17]。此外,Pearson相關(guān)分析發(fā)現(xiàn),PTB患兒PBMC miRNA-31、miRNA-146a表達(dá)水平與CD3+、CD4+比例及CD4+/CD8+比值水平均呈負(fù)相關(guān)(P<0.05),與CD8+、IL-2、IL-6、IL-8水平均呈正相關(guān)(P<0.05)。說(shuō)明miRNA-31、miRNA-146a可能是通過(guò)靶向調(diào)控MAPK及JAK/STAT等信號(hào)通路,從而發(fā)揮炎癥免疫調(diào)控作用,進(jìn)而參與PTB的發(fā)生、發(fā)展。

綜上所述,兒童PTB PBMC miRNA-31、miRNA-146a均存在明顯高表達(dá),且與細(xì)胞免疫、炎癥因子均密切相關(guān),可作為輔助診斷PTB的潛在生物學(xué)標(biāo)志物,值得臨床重點(diǎn)關(guān)注。