蓖麻毒素A 鏈（RTA）和RTA-4D5 scFv 的穿膜改造探究

許嘉文

（華東理工大學(xué)魯華生物技術(shù)研究所，上海 200237）

1 文獻(xiàn)綜述

許多植物都可以產(chǎn)生被稱為核糖體蛋白失活蛋白（RIPs）的蛋白毒素，RIPs 的主要功能是作為保護(hù)免受微生物入侵的工具[1]。蓖麻毒素是二型核糖體蛋白失活蛋白的一種，由二硫鍵連接的A 鏈和B 鏈組成。蓖麻毒素被細(xì)胞內(nèi)吞后，絕大多數(shù)內(nèi)化的蓖麻毒素被轉(zhuǎn)運回細(xì)胞表面，剩余部分被運送到溶酶體并被降解，最終只有很小一部分被運輸?shù)礁郀柣w網(wǎng)絡(luò)[2]。而蓖麻毒素A鏈需要穿過細(xì)胞膜，通過逆向轉(zhuǎn)運途徑進(jìn)入胞漿中才能發(fā)揮毒性用，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。因此蛋白毒素在胞內(nèi)的定位是展現(xiàn)其細(xì)胞毒性的關(guān)鍵[3]。研究人員在蛋白質(zhì)末端添加短肽改善其穿膜或定位能力，這種短肽被稱為信號肽。

KDEL 是一種最常見的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位肽，由四個氨基酸殘基組成，通常存在于哺乳動物和植物細(xì)胞中，一般只有在蛋白質(zhì)的C 端才能發(fā)揮蛋白質(zhì)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位作用。而DEKKMP 是 E3/19K 蛋白的C 端末尾的6 位殘基，同樣也是一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)保留信號。如今更多的新型穿膜肽正在被發(fā)現(xiàn)，其中一種很有潛力的穿模肽來自乙型肝炎病毒（HBV）編碼的X 蛋白。Xentry 由X 蛋白中的7 個氨基酸殘基組成，序列為LCLRPVG，該短肽能夠滲透多種癌細(xì)胞系，包括HepG2、H441、BT474[4]。由于許多不同的細(xì)胞類型表達(dá)多配體蛋白聚糖，特別是高水平表達(dá)多配體蛋白聚糖的上皮細(xì)胞，Xentry 可用于將藥物遞送至疾病治療中的組織。[5]

蓖麻毒素作為抗腫瘤藥物，已被研究人員廣泛而深入地研究，其抗腫瘤作用已在許多實驗?zāi)Ｐ椭械玫阶C實，如人腫瘤細(xì)胞移植到裸鼠體內(nèi)的實驗[6]，但是蓖麻毒素自身對腫瘤細(xì)胞并沒有特異性，使用蓖麻毒素同樣會殺傷正常細(xì)胞。為了解決蓖麻毒素對腫瘤細(xì)胞的特異性問題，近年來蓖麻毒素和其A 鏈被用于合成靶向性腫瘤治療的免疫毒素，并顯示出良好的特異性抗癌活性[7]。

本實驗利用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位信號肽，使單鏈A 鏈蓖麻毒素在沒有B 鏈的輔助下依舊能夠高效逆向運輸，細(xì)胞內(nèi)化蓖麻毒素后將蓖麻毒素快速引導(dǎo)至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，從而增強細(xì)胞毒性。同時利用4D5 scFv 對特定腫瘤細(xì)胞的高特異性，減輕其對正常細(xì)胞的殺傷力。由于蓖麻毒素和4D5 連接后蛋白分子量較大，在細(xì)胞內(nèi)化過程中不易被細(xì)胞攝入，所以在蛋白中插入一段穿膜肽以輔助蛋白毒素的內(nèi)化。通過以上改造，希望構(gòu)建的蛋白毒素能用于臨床腫瘤治療。

2 實驗方法（過程）

2.1 引物設(shè)計

使用Snapgene 軟件，依據(jù)PCR 和重疊PCR 的原理設(shè)計引物。

2.2 質(zhì)粒構(gòu)建

2.2.1 PCR 反應(yīng)

質(zhì)粒pET-28a-SUMO-RTA-KDEL（質(zhì)粒1）、pET-28a-SUMO-RTA-4D5-KDEL（質(zhì)粒2）由實驗室保存，用來作為本實驗的PCR 模板；使用設(shè)計好的引物S1primer，primer2 和質(zhì)粒1 進(jìn)行PCR，獲得SUMO-RTA-KDEL3（RK3）片段；使用設(shè)計好的引物S1primer，primer3 和質(zhì)粒2進(jìn)行PCR，獲得SUMO-RTA-4D5-KDEL3（R4K3）片段；使用設(shè)計好的引物S1primer，primer4 和質(zhì)粒2 進(jìn)行PCR，獲得SUMO-RTA-4D5-DEKKMP（R4D）片段；將上述PCR 反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行核酸電泳驗證，并使用OMEGA 公司的Cycle Pure試劑盒回收PCR 片段。

表1 引物

以質(zhì)粒2 為模板，分別使用設(shè)計好的引物S1primer，primer5 和primer6，primer4 進(jìn)行PCR，獲得SUMO-Xentry和Xentry-RTA-4D5-DEKKMP；對PCR 產(chǎn)物核酸電泳，并用OMEGA 公司的Gel Extraction 試劑盒切膠回收目標(biāo)片段。

以回收的PCR 產(chǎn)物為重疊PCR 模板，加入S1 primer，primer4，PCR獲得SUMO-Xentry-RTA-4D5-DEKKMP（XR4D），進(jìn)行核酸電泳驗證并用OMEGA 公司的Cycle Pure 試劑盒純化。

2.2.2 PCR 產(chǎn)物的連接

將上述所有PCR 產(chǎn)物和pET-28a 用限制性核酸內(nèi)切酶Nco Ⅰ和Xho Ⅰ在37℃下水浴酶切2 小時。使用T4 連接酶將回收的PCR 酶切產(chǎn)物與酶切pET-28a 質(zhì)粒連接，22℃，4h 或16℃過夜。

2.3 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化和驗證

將由PCR 連接的產(chǎn)物及DH5α 感受態(tài)細(xì)胞冰浴10 min 使其融化。再將10μL 的PCR 連接產(chǎn)物加入DH5α，并繼續(xù)冰浴30min。后迅速以42℃金屬浴熱激90s，并及時放回冰浴，持續(xù)降溫2min。最后加入1mL 的普通LB 培養(yǎng)基，于37℃孵育1h。孵育完成后，4000rpm離心90s，棄去上清，加入150μL 的普通LB 培養(yǎng)基重懸菌體，然后將其涂布在含有卡那抗性的LB 培養(yǎng)基平板上，于37℃搖床倒置，過夜培養(yǎng)。本實驗采取菌落PCR 以及核酸電泳驗證轉(zhuǎn)化結(jié)果，將PCR 產(chǎn)物進(jìn)行核酸電泳，并觀察電泳結(jié)果，若電泳結(jié)果顯示PCR 產(chǎn)物大小與目的片段大小一致，則表明重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化初步成功。將驗證成功的菌液加入0.5mL 的含有卡那霉素的LB培養(yǎng)基中后，置于37℃搖床中培養(yǎng)6h 并測序。使用試劑盒將測序正確的菌液培養(yǎng)并抽提質(zhì)粒，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入BL21 感受態(tài)細(xì)胞中，獲得重組表達(dá)菌株。

2.4 誘導(dǎo)蛋白表達(dá)

取1.5 mL 菌液分別加入3 個200mL 卡那抗性的LB搖瓶中，37℃搖床中培養(yǎng)4 小時，加入50μL 1M 的IPTG誘導(dǎo)，放入18℃搖床中誘導(dǎo)表達(dá)，誘導(dǎo)時間為16h～20h左右。

2.5 蛋白純化

2.5.1 鎳柱純化

誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)束后，去除上清LB 培養(yǎng)基，加入40mL PBS 緩沖液重懸菌體，利用超聲破碎儀進(jìn)行細(xì)胞破碎，并取上清倒入干凈的離心管。將上清先通過0.45nm 孔徑的濾膜過濾，然后將上清通過鎳柱使其與鎳柱結(jié)合。分別用50mM、100mM、200mM 以及500mM 濃度的咪唑溶液對鎳柱洗脫，并收集洗脫液。分別將上樣流穿液和各濃度咪唑洗脫液取出30μL，加入10μL4×蛋白上樣緩沖液，制成蛋白樣。SDS-PAGE 電泳檢驗?zāi)繕?biāo)蛋白所在洗脫區(qū)間。

2.5.2 透析、濃縮、SUMO 酶切和再純化

用SUMO 蛋白酶對目的蛋白進(jìn)行酶切，以獲得單獨的RK3、R4K3、R4D 和XR4D 蛋白。蛋白透析液采用20 mM 的PBS 緩沖液，將純化的蛋白裝在透析袋中用夾子夾好，然后放在PBS 緩沖液中進(jìn)行透析。將蛋白通過10kDa 的超濾膜濃縮至10mL，并加入1mL 的SUMO 酶4℃過夜酶切。酶切產(chǎn)物通過鎳柱純化，并進(jìn)行蛋白電泳檢測純化結(jié)果。

2.6 蛋白抗腫瘤活性檢測

采用MTT 法檢測目的蛋白對正常細(xì)胞及SKOV3 腫瘤細(xì)胞的毒性。先將80%鋪板率的細(xì)胞消化，制成單個懸浮的細(xì)胞液，再用血球計數(shù)板計數(shù)10μL 的細(xì)胞液。將細(xì)胞懸浮液稀釋到每1mL 含1×105 個細(xì)胞，每孔100μL 接種到96 孔板上，在37℃、5%CO2的環(huán)境下培養(yǎng)24h，讓細(xì)胞貼壁。細(xì)胞貼壁后，去除孔板中的完全培養(yǎng)基，用維持培養(yǎng)基將蛋白稀釋成不同濃度，加入孔板中培養(yǎng)72h。每孔加入10μL MTT 溶液，再培養(yǎng)4h。棄去上清液，每孔加入100μL 二甲基亞砜，在酶標(biāo)儀上振蕩5min，然后讀取490nm 處的吸光度。然后再棄去上清，每孔加入100μL DMSO 溶液，在酶標(biāo)儀上震蕩5min 后，使用酶標(biāo)儀測定490nm 處的吸光度。

3 實驗結(jié)果與結(jié)論

由表2 的實驗結(jié)果可知，RK3 蛋白對H460 細(xì)胞和SKOV3 細(xì)胞有相似的抑制率，RK3 對正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞均有一定的殺傷性且對正常細(xì)胞殺傷性略大于腫瘤細(xì)胞。R4K3 蛋白對正常細(xì)胞H460 幾乎沒有殺傷性，但對SKOV3 腫瘤細(xì)胞具有顯著的抑制能力。

表2 不同蛋白對H460 和SKOV3 的細(xì)胞抑制率

R4D 蛋白對正常細(xì)胞H460 幾乎沒有殺傷性，但對SKOV3腫瘤細(xì)胞具有顯著的抑制能力。與R4K3蛋白相比，R4D 蛋白對細(xì)胞的抑制能力基本相同。

XR4D 蛋白對正常細(xì)胞H460 幾乎沒有殺傷性，但對SKOV3 腫瘤細(xì)胞具有顯著的抑制能力。與R4K3 和R4D蛋白相比，R4D 蛋白對細(xì)胞的抑制能力基本相同，但達(dá)到最大抑制效果所需的蛋白濃度有所下降。

4D5 scFv 片段在提高蛋白毒素對腫瘤細(xì)胞的特異性方面有顯著的功效。但同時由于4D5 scFv 片段蛋白較大，可能是導(dǎo)致含有該片段的蛋白毒素相較于RTAKDEL 對腫瘤細(xì)胞殺傷性有所下降的原因。帶有Xentry穿膜肽的蛋白毒素由于其穿膜能力較強，所以達(dá)到最大毒性所需要的蛋白濃度相較沒有穿膜肽的蛋白毒素更低。帶有KDEL3 或DEKKP 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)保留信號肽的蛋白毒素在蛋白毒性上相較于沒有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)保留信號肽的RTA蛋白更強，說明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)保留信號肽可以增強蓖麻毒素的細(xì)胞毒性。

4 展望

蓖麻毒素A 鏈?zhǔn)敲庖叨舅氐难芯繜狳c，本實驗通過添加4D5 scFv 片段提高了RTA 蛋白對腫卵巢癌瘤細(xì)胞的特異性，通過添加內(nèi)質(zhì)網(wǎng)保留信號KDEL、KDEL3、DEKKMP 提高了其蛋白毒性，通過添加Xentry 穿膜肽降低了達(dá)到最大細(xì)胞抑制率所需的蛋白濃度。但是DEKKMP 和Xentry 的作用機(jī)理并沒有進(jìn)行深入探究，雖然已有文獻(xiàn)對這兩個信號肽做出機(jī)理的解釋，但都并非是在RTA 蛋白毒素方面的研究。在今后的實驗中，可以嘗試?yán)昧魇郊?xì)胞儀測量細(xì)胞凋亡的早期和晚期比例，同時用激光共聚焦法觀察DEKKMP 和Xentry 影響下的RTA 蛋白在細(xì)胞中的分布，以進(jìn)一步研究其作用機(jī)理。