生活污水中苯二氮?類(lèi)藥物及其新型策劃藥分析方法優(yōu)化及應(yīng)用

朱 珠，張苓榮，趙孟林，張 璇，郝芳華，李喜青，杜 鵬

1. 北京師范大學(xué)水科學(xué)研究院，城市水循環(huán)與海綿城市技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100875

2. 北京大學(xué)城市與環(huán)境學(xué)院，地表過(guò)程分析與模擬教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100871

苯二氮?類(lèi)藥物(benzodiazepines，BZDs)作為精神科門(mén)診普遍使用的強(qiáng)效鎮(zhèn)靜安眠藥物，連續(xù)使用易形成藥物依賴(lài)，在全球范圍內(nèi)已出現(xiàn)普遍的濫用現(xiàn)象[1-2]. 新型苯二氮?類(lèi)策劃藥(designer benzodiazepines，DBZDs)則多為常用BZDs 的結(jié)構(gòu)修飾物，藥效與BZDs相似，但在國(guó)內(nèi)未通過(guò)藥物監(jiān)管部門(mén)的上市批準(zhǔn). 因缺少法律監(jiān)管，DBZDs 已成為毒品市場(chǎng)盛行的一類(lèi)新精神活性物質(zhì)[3-4]. 同時(shí)，BZDs 和DBZDs 會(huì)通過(guò)服用者排泄物經(jīng)市政管網(wǎng)匯入污水處理廠(chǎng)，因生活污水中檢出BZDs 和DBZDs 的報(bào)道逐年增多，有關(guān)部門(mén)已將依替唑侖等BZDs 和DBZDs 作為重點(diǎn)監(jiān)管對(duì)象[5].此外，污水處理廠(chǎng)未能去除的BZDs 和DBZDs 原藥或代謝產(chǎn)物隨出水排入地表水環(huán)境，因其仍具有較高的生物活性，給水生生物[6-7]和居民飲用水[8-9]安全帶來(lái)了潛在威脅. 針對(duì)BZDs 和DBZDs 使用造成的社會(huì)問(wèn)題和環(huán)境問(wèn)題，對(duì)此類(lèi)藥物的使用情況進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，并估算其使用量，對(duì)禁毒部門(mén)制定管控政策和新型污染物健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)具有重要意義[10-11].

環(huán)境分析科學(xué)技術(shù)的發(fā)展催生了基于污水流行病學(xué)(wastewater-based epidemiology，WBE)的毒品濫用監(jiān)測(cè)手段，該方法通過(guò)對(duì)生活污水中目標(biāo)化合物濃度水平的分析，獲取接近實(shí)時(shí)的區(qū)域毒品濫用水平、時(shí)空分布等關(guān)鍵信息[12-15]，較傳統(tǒng)藥物濫用調(diào)查方法更客觀(guān)高效. 歐洲[16-17]、亞洲[18]、美洲[19]等地區(qū)已廣泛應(yīng)用WBE 方法監(jiān)測(cè)其傳統(tǒng)和新型毒品的濫用水平. 隨著社會(huì)對(duì)公共健康關(guān)注度的不斷提高，WBE 的研究對(duì)象逐漸轉(zhuǎn)向了與人體健康相關(guān)的生物標(biāo)志物，如煙草、酒精[20]、咖啡因[21]等合法成癮性物質(zhì)，具有強(qiáng)效鎮(zhèn)痛效果的曲馬多、阿片類(lèi)藥物[22]，治療細(xì)菌疾病的抗生素[23]以及與糖尿病高血壓等常見(jiàn)基礎(chǔ)病有關(guān)的二甲雙胍[24]、美托洛爾[25]等，以進(jìn)一步挖掘污水中所包含的人類(lèi)生活方式及健康狀況信息. 此外，在新型冠狀病毒全球大流行的背景下，以病原體為生物標(biāo)志物，污水流行病學(xué)在傳染病預(yù)警、疾病傳播動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)以及社區(qū)感染人數(shù)預(yù)測(cè)等方面的作用和價(jià)值同樣被不斷發(fā)掘[26-27]. 然而，針對(duì)治療失眠、焦慮的BZDs 和新精神活性物質(zhì)DBZDs 的WBE 研究仍然較為匱乏. Baker 等[28]利用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)技術(shù)建立了污水中65 種非法藥物及處方藥的分析方法，其中包含地西泮、硝西泮等7 種常用BZDs 處方藥，并對(duì)英國(guó)城市污水中BZDs 進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)該類(lèi)藥物濃度在11.9~209 ng/L 之間；Yuan等[29]報(bào)道了國(guó)內(nèi)阿普唑侖、勞拉西泮及奧沙西泮在北京醫(yī)療廢水和生活污水中的賦存情況，Wu 等[8]對(duì)黃浦江及沿江污水廠(chǎng)中地西泮、阿普唑侖、艾司唑侖等8 種BZDs 處方藥進(jìn)行監(jiān)測(cè)，結(jié)果表明該類(lèi)藥物在北京、上海各類(lèi)水體中廣泛存在. 由于BZDs 藥物種類(lèi)繁多，現(xiàn)有報(bào)道中所包含的BZDs 種類(lèi)較少，且多為地西泮、奧沙西泮等常用藥物，缺乏針對(duì)尼美西泮、三唑侖等BZDs 類(lèi)第三代毒品以及吡唑侖、依替唑侖等非法DBZDs 的相關(guān)研究. 因此，建立一種涵蓋較全種類(lèi)BZDs 和DBZDs 的高靈敏度、高選擇性污水分析方法，可對(duì)BZDs 和DBZDs 的使用情況進(jìn)行更為系統(tǒng)全面的監(jiān)測(cè).

該研究以25 種BZDs 和DBZDs 為研究對(duì)象，利用固相萃取(SPE)前處理技術(shù)和LC-MS/MS 實(shí)現(xiàn)對(duì)污水樣品中目標(biāo)化合物的分析測(cè)定，并對(duì)分析方法進(jìn)行了優(yōu)化. 通過(guò)回收率、基質(zhì)效應(yīng)、檢出限和定量限、精密度等質(zhì)量控制指標(biāo)對(duì)分析方法進(jìn)行評(píng)價(jià). 通過(guò)對(duì)北京市主城區(qū)6 家污水廠(chǎng)進(jìn)水樣品的分析驗(yàn)證了優(yōu)化后方法的可靠性，以期為BZDs 和DBZDs 的精確監(jiān)管、來(lái)源追溯提供可靠的技術(shù)手段，也為進(jìn)一步開(kāi)展該類(lèi)藥物的污水流行病學(xué)研究提供技術(shù)支持.

1 材料與方法

1.1 試劑與耗材

該試驗(yàn)所用標(biāo)準(zhǔn)樣品具體包括：常用BZDs 處方藥及其代謝產(chǎn)物阿普唑侖(ALP)、α-羥基阿普唑侖(OHALP)、氯硝西泮(CZP)、7-氨基氯硝西泮(7ACZP)、地西泮(DZP)、去甲地西泮(NDZP)、替馬西泮(TZP)、奧沙西泮(OZP)、艾司唑侖(EZM)、勞拉西泮(LZP)、咪達(dá)唑侖(MZM)、硝西泮(NZP)、氯甲西泮(LMZP)；BZDs 類(lèi)第三代毒品氟硝西泮(FNZP)、尼美西泮(NMZP)及其代謝產(chǎn)物7-氨基尼美西泮(7ANMZP)、三唑侖(TZM)；非法DBZDs 標(biāo)準(zhǔn)樣品氯地西泮(CDZP)、地洛西泮(DLZP)、氟丙西泮(FBZP)、甲氯硝西泮(MCZP)、吡唑侖(PZM)、依替唑侖(ETM)；非苯二氮?類(lèi)新型安眠藥富馬酸喹硫平(QTP)和唑吡坦(ZPM)(均為濃度100 μg/mL 的甲醇溶液，純度>99%). 9 種氘代內(nèi)標(biāo)ALP-D5、 OHALP-D5、 DZP-D5、 NDZP-D5、 OZP-D5、EZM-D5、 LZP-D4、 ETM-D3和ZPM-D6(均 為 濃 度10 μg/mL 的甲醇溶液，純度>99%)，以上標(biāo)準(zhǔn)樣品均購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich 公司；甲醇(LC-MS 級(jí))和乙腈(LC-MS 級(jí))均購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；甲酸、甲酸銨、氨水均購(gòu)自上海安譜試驗(yàn)科技股份有限公司，均為HPLC 級(jí)；超純水由MilliQ 系統(tǒng)(德國(guó)Merck KGaA 公司)制備；Cleanert PEP 和Cleanert PCX(60 mg，3 mL)固相萃取柱購(gòu)自天津博納艾杰爾科技有限公司；針式過(guò)濾器(1.0 μm，玻璃纖維)購(gòu)自天津市科藝隆試驗(yàn)設(shè)備公司；離心過(guò)濾管(0.2 μm)購(gòu)自美國(guó)Costar 公司.

1.2 儀器與設(shè)備

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀(Triple QuadTM6500+)購(gòu)于美國(guó)AB SCIEX 公司；固相萃取裝置(SBEQCG1416)、氮吹儀(EFAA-DF24)購(gòu)于上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；渦旋振蕩器(VXMNDG)購(gòu)于奧豪斯儀器(常州)有限公司；離心機(jī)(MiniMax17)購(gòu)于湖南可成儀器設(shè)備有限公司；KQ3200B 型超聲波清洗器購(gòu)于昆山市超聲儀器有限公司.

1.3 LC-MS/MS 條件優(yōu)化

根據(jù)目標(biāo)化合物的性質(zhì)選擇離子源和離子化模式. 將濃度為20 ng/mL 的目標(biāo)化合物標(biāo)準(zhǔn)溶液通過(guò)針泵恒流的進(jìn)樣方式注入質(zhì)譜，選取2 個(gè)豐度強(qiáng)且穩(wěn)定的子離子分別作為定量離子和定性離子. 采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式優(yōu)化各特征離子的去簇電壓(DP)和碰撞能量(CE)，最終根據(jù)各目標(biāo)化合物的保留時(shí)間設(shè)置分段采集模式以實(shí)現(xiàn)最大的響應(yīng)強(qiáng)度. 采用安捷倫InfinityLad Poroshell HPH C18 液相色譜柱(2.1 mm×100 mm，2.7 μm)，通過(guò)優(yōu)化流動(dòng)相pH、添加劑、洗脫梯度等條件，實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)化合物的有效分離并縮短分析周期.

1.4 樣品前處理方法

該研究采用固相萃取法(SPE)對(duì)樣品進(jìn)行濃縮和凈化，固相萃取柱使用前依次向管內(nèi)加入3 mL 甲醇、3 mL 超純水和3 mL pH=2 的超純水進(jìn)行活化.取50 mL 經(jīng)1 μm 濾膜過(guò)濾后的污水樣品，添加100 μL濃度為50 ng/mL 的內(nèi)標(biāo)混合溶液，靜置5~10 min 使其與樣品混合均勻. 調(diào)節(jié)固相萃取裝置使樣品以1 mL/min 的速度均勻加載，污水加載完成后依次使用2 mL 2%甲酸水溶液和2 mL 甲醇淋洗. 待萃取柱填料干燥后使用4 mL 5%甲醇氨溶液洗脫，洗脫液收集在10 mL 玻璃試管內(nèi)，使用緩和氮?dú)庠诤銣貤l件下緩慢將洗脫液吹至干燥. 向試管中加入500 μL 50%甲醇水溶液復(fù)溶管底殘留物，振蕩至洗脫物完全溶解，此時(shí)各污水樣品內(nèi)標(biāo)濃度均為10 ng/mL. 復(fù)溶液經(jīng)0.2 μm 離心過(guò)濾管過(guò)濾后裝入專(zhuān)用樣品瓶，4 ℃下保存等待LC-MS/MS 分析測(cè)定.

1.5 質(zhì)量控制

1.5.1 回收率

分別取25、125 和250 μL 濃度為20 ng/mL 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液加入到50 mL pH=2 的超純水中配成不同濃度梯度的溶液，每組設(shè)置3 個(gè)平行樣品，并設(shè)置一組流程空白. 按1.4 節(jié)樣品前處理方法處理加標(biāo)樣品并上機(jī)測(cè)定，根據(jù)流程空白、加標(biāo)樣品的測(cè)定數(shù)據(jù)以及實(shí)際加標(biāo)濃度計(jì)算得到經(jīng)固相萃取后不同濃度25種目標(biāo)化合物的回收率.

1.5.2 基質(zhì)效應(yīng)

該試驗(yàn)選取北京肖家河污水處理廠(chǎng)的進(jìn)水作為基質(zhì)效應(yīng)供試水樣，按1.4 節(jié)對(duì)供試水樣進(jìn)行樣品前處理，使用前處理后的供試水樣配制體積為500 μL、濃度范圍為1~10 ng/mL 的加標(biāo)水樣. 經(jīng)LC-MS/MS分析測(cè)定得到各目標(biāo)物質(zhì)在污水樣品和不同濃度的加標(biāo)污水樣品、標(biāo)準(zhǔn)樣品中的響應(yīng)峰面積，比較加標(biāo)前后目標(biāo)物質(zhì)響應(yīng)的變化，評(píng)價(jià)基質(zhì)對(duì)分析儀器響應(yīng)信號(hào)的抑制或增強(qiáng)效應(yīng)，計(jì)算公式[30]：

式中：ME 表示基質(zhì)效應(yīng)，%；Aaddition表示經(jīng)LC-MS/MS分析測(cè)定得到的各目標(biāo)物質(zhì)響應(yīng)峰面積；Ablank為污水中目標(biāo)物質(zhì)的峰面積；Astandard為目標(biāo)物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)樣品峰面積.

1.5.3 檢出限和定量限

將系列低濃度混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.01~0.1 ng/mL)上機(jī)測(cè)定，以信噪比S/N 為3 時(shí)對(duì)應(yīng)的濃度為儀器檢出限(ILOD，ng/L)，S/N 為10 時(shí)對(duì)應(yīng)的濃度為儀器定量限(ILOQ，ng/L). 方法檢出限(MLOD，ng/L)和定量限(MLOQ，ng/L)分別通過(guò)式(2)(3)計(jì)算：

式中：V1為上機(jī)濃縮液的體積，取值為500 μL；V2為前處理所取污水樣品的體積，取值為50 mL.

1.5.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的線(xiàn)性及范圍

該試驗(yàn)對(duì)環(huán)境樣品中目標(biāo)物質(zhì)的濃度范圍進(jìn)行估計(jì)，在估計(jì)濃度上限的2~3 倍內(nèi)配制含甲醇體積50%、濃度梯度范圍為0.01~10 ng/mL 的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液. 上機(jī)測(cè)定后擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，相關(guān)系數(shù)(R2)應(yīng)不低于0.99，同時(shí)滿(mǎn)足范圍內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)樣品分析定量準(zhǔn)確度在80%~120%之間.

1.5.5 精密度

采用對(duì)同一標(biāo)準(zhǔn)樣品連續(xù)多次測(cè)定結(jié)果(n=4)和多天重復(fù)測(cè)定結(jié)果(n=4)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)來(lái)評(píng)價(jià)儀器的日內(nèi)精密度與日間精密度，15%的RSD作為方法可接受的標(biāo)準(zhǔn)上限.

1.6 使用量估算

利用污水處理廠(chǎng)日均流量、服務(wù)區(qū)域常住人口數(shù)據(jù)等可估算出地區(qū)目標(biāo)物質(zhì)的人均負(fù)荷水平，進(jìn)而反向推算出藥物使用量，其計(jì)算公式：

式中：L為藥物千人均負(fù)荷量，mg/(1 000 inh·d)，其中inh 表示inhabitant；Cin為污水處理廠(chǎng)進(jìn)水樣品濃度，ng/L；Fin為污水處理廠(chǎng)的平均進(jìn)水流量，m3/d；P為污水處理廠(chǎng)服務(wù)人口數(shù)；U為北京市各BZDs 的使用量，mg/(1 000 inh·d)；E表示目標(biāo)物質(zhì)生物標(biāo)志物的人體排泄率，%；MWratio表示目標(biāo)物質(zhì)母體與其生物標(biāo)志物的摩爾質(zhì)量比值.

2 結(jié)果與討論

2.1 優(yōu)化后的LC-MS/MS 條件

25 種目標(biāo)化合物分子結(jié)構(gòu)中均含氮原子，且多呈仲胺或叔胺形式，在ESI 離子化模式下易與氫離子結(jié)合形成帶正電荷的母離子[M+H]+，因此該研究選擇在正離子檢測(cè)模式下，采用MRM 模式對(duì)所有目標(biāo)化合物進(jìn)行檢測(cè). 離子源電壓(IS)為4 500 V，離子源溫度(TEM)為450 ℃，氣簾氣(CUR)壓力為25 psi，干燥氣(GS1)壓力為65 psi，輔助氣(GS2)壓力為55 psi，碰撞池氣壓(CAD)為6 psi. 各目標(biāo)化合物及其相應(yīng)內(nèi)標(biāo)質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1.

表1 質(zhì)譜檢測(cè)條件Table 1 Experimental conditions for mass spectrometry analysis

BZDs 在酸性條件下易于質(zhì)子化，因此該研究選用10 mmol/L 甲酸銨(含0.1%甲酸)水溶液(流動(dòng)相A)/乙腈(流動(dòng)相B)作為流動(dòng)相體系，以提高目標(biāo)化合物的離子化率. 由于多數(shù)BZDs 結(jié)構(gòu)和性質(zhì)相似，其在色譜柱上的保留時(shí)間較為接近，故采用梯度洗脫方式提高其分離效果. 同時(shí)，7ACZP、7ANMZP 和ZPM的極性較強(qiáng)，因此設(shè)置較低比例的有機(jī)相作為初始流動(dòng)相條件，以獲得較為理想的保留時(shí)間. 優(yōu)化后的洗脫梯度：0~0.5 min，10% B 相；0.5~5 min，10%~90% B 相；保持90% B 相0.4 min；5.4~5.8 min，10%~90% B 相；保持10% B 相2.2 min. 色譜柱溫度為40 ℃，流速0.4 mL/min，進(jìn)樣體積為2 μL. 圖1 為優(yōu)化后25 種目標(biāo)化合物的色譜圖，該方法能夠在5.4 min 內(nèi)實(shí)現(xiàn)對(duì)所有物質(zhì)的有效分離，顯著縮短了分析周期，同時(shí)提高了儀器對(duì)目標(biāo)化合物的靈敏度.

圖1 目標(biāo)化合物高效液相色譜圖Fig.1 Ultra-performance liquid chromatography chromatograms of all target compounds

2.2 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

2.2.1 固相萃取柱的選擇

該研究選擇SPE 技術(shù)對(duì)樣品進(jìn)行凈化與富集，并比較Cleanert PCX 和Cleanert PEP 固相萃取柱(分別簡(jiǎn)稱(chēng)“PEP 柱”和“PCX 柱”)對(duì)25 種目標(biāo)化合物的凈化回收效果，2 種柱子均按照1.4 節(jié)方法對(duì)污水樣品進(jìn)行前處理，具體回收率如圖2 所示. 兩種萃取柱均采用聚苯乙烯/二乙烯苯為填料，PEP 柱表面同時(shí)具有親水性和憎水性基團(tuán)，對(duì)各類(lèi)極性、非極性物質(zhì)具有較為均衡的吸附作用；PCX 柱則兼有陽(yáng)離子交換和反相吸附混合作用力. 試驗(yàn)結(jié)果表明，PEP 柱無(wú)法實(shí)現(xiàn)對(duì)OHALP 的吸附，對(duì)FNZP、MCZP、MZM、7ANMZP 等物質(zhì)的回收率低于60%，對(duì)OZP、PZM、LMZP、NMZP 等物質(zhì)的回收率則超過(guò)了200%；PCX柱對(duì)25 種目標(biāo)物質(zhì)均有較好的吸附和凈化效果，因此該研究選用PCX 柱進(jìn)行SPE 前處理.

圖2 不同SPE 柱待測(cè)目標(biāo)化合物回收率比較Fig.2 Comparison of recoveries using different SPE columns

2.2.2 淋洗條件的優(yōu)化

PCX 柱在前處理過(guò)程中會(huì)吸附污水基質(zhì)中的部分干擾組分，因此需要加入淋洗步驟降低基質(zhì)組分對(duì)準(zhǔn)確定量的影響. BZDs 多為中等或弱極性化合物，易溶于甲醇、乙腈等試劑，不易溶于水. 該研究在污水樣品加載完成后設(shè)置4 mL 純水、4 mL 2%甲酸甲醇溶液和2 mL 2%甲酸水溶液-2 mL 甲醇3 種淋洗條件并比較其凈化效果. 如圖3 所示，使用4 mL 純水淋洗時(shí)多數(shù)目標(biāo)化合物的損失較少，但對(duì)非極性干擾組分凈化效果不佳；使用4 mL 2%甲酸甲醇溶液淋洗時(shí)對(duì)基質(zhì)中干擾組分去除效果較好，但導(dǎo)致FNZP、MCZP、NZP 等物質(zhì)損失較多，回收率低于80%；使用2 mL 2%甲酸水溶液-2 mL 甲醇淋洗時(shí)，25 種目標(biāo)化合物回收率均在80%~120%之間，凈化效果較為理想. 導(dǎo)致這一結(jié)果的原因?yàn)榧姿崴軌虼龠M(jìn)目標(biāo)化合物質(zhì)子化，使得萃取小柱對(duì)藥物的保留作用更穩(wěn)定，而甲醇能有效去除干擾性基質(zhì)，因此該研究選用2 mL 2%甲酸水溶液-2 mL 甲醇作為前處理的淋洗溶液.

圖3 不同淋洗條件下待測(cè)目標(biāo)化合物的回收率比較Fig.3 Comparison of recoveries using different flushing conditions

2.2.3 洗脫和復(fù)溶條件的優(yōu)化

BZDs 經(jīng)樣品加載后以質(zhì)子化形式吸附于萃取柱，因其多為弱堿性化合物，在堿性條件下更易被洗脫溶液提取. 該研究選擇在甲醇中加入適量氨水來(lái)增加洗脫溶液的pH，以提高目標(biāo)化合物的洗脫效率. 結(jié)果表明，連續(xù)分批加入體積為1 mL 的洗脫溶液時(shí)，初始流出液中多數(shù)物質(zhì)洗脫率高于40%，隨著洗脫液體積的增加，在第4、第5 批次洗脫流出液中多數(shù)目標(biāo)化合物洗脫率低于1%，因此該研究選擇4 mL 5%甲醇氨溶液作為洗脫液. 對(duì)于復(fù)溶過(guò)程，該研究分別考察了30%、50%、80% 3 種不同體積分?jǐn)?shù)甲醇水溶液的復(fù)溶效果. 結(jié)果顯示，在30%甲醇水溶液復(fù)溶條件下CDZP、MZM、QTP 等物質(zhì)未能實(shí)現(xiàn)較好的回收效果，而甲醇體積分?jǐn)?shù)為80%時(shí)將削弱2.3.2 節(jié)淋洗步驟對(duì)萃取柱的凈化功效，使用50%甲醇水溶液復(fù)溶則能夠保證目標(biāo)藥物的充分復(fù)溶和凈化效果，因此該研究選用50%甲醇水溶液作為復(fù)溶溶液(見(jiàn)圖4).

圖4 不同復(fù)溶條件下待測(cè)目標(biāo)化合物的回收率比較Fig.4 Comparison of recoveries using different re-solvents

2.3 已優(yōu)化方法的評(píng)價(jià)

2.3.1 回收率和基質(zhì)效應(yīng)

如表2 所示，經(jīng)PCX 柱固相萃取后，25 種目標(biāo)化合物在不同濃度梯度下的回收率均在80%~120%之間，基質(zhì)效應(yīng)(ME)在——20%~20%之間，滿(mǎn)足檢測(cè)要求.

表2 優(yōu)化方法后目標(biāo)化合物的回收率和基質(zhì)效應(yīng)Table 2 Recoveries and matrix effects of all target compounds using optimization method

2.3.2 檢出限、定量限、標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)線(xiàn)性、儀器準(zhǔn)確度及精密度

如表3 所示，25 種目標(biāo)化合物的方法檢出限和方法定量限在0.02~3.7 ng/L 之間，標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)在10~10 000 ng/L范圍內(nèi)線(xiàn)性表現(xiàn)良好(R2>0.99)，不同濃度標(biāo)準(zhǔn)樣品定量準(zhǔn)確度在80%~120%之間. 此外，儀器日內(nèi)和日間精密度RSD(n=4)在1%~13%之間，均小于15%，儀器穩(wěn)定性可達(dá)到試驗(yàn)要求. 因此，該研究所采用的分析方法能夠滿(mǎn)足多種BZDs 和DBZDs 的同步定量分析.

表3 優(yōu)化方法后目標(biāo)化合物的檢出限、定量限、線(xiàn)性范圍及精確度Table 3 MLOD, MLOQ, linearity and precision of all target compounds using optimization method

2.4 分析方法在實(shí)際污水樣品中的應(yīng)用

該研究于2020 年12 月——2021 年1 月對(duì)北京市6 家市政污水處理廠(chǎng)(WWTP-1~WWTP-6)的進(jìn)水進(jìn)行采樣(24 h 混合水樣)，生活污水比例均高于90%，具體運(yùn)行數(shù)據(jù)見(jiàn)表4. 采用上述優(yōu)化方法對(duì)樣品進(jìn)行前處理和分析測(cè)定.

表4 北京市6 家污水處理廠(chǎng)的基本情況Table 4 Basic information on the six WWTPs in Beijing

檢測(cè)結(jié)果顯示，進(jìn)水樣品中18 種目標(biāo)化合物被檢出. ALP、DZP、NDZP、OZP、EZM、NMZP、MZM、QTP、ZPM 檢出率為100%，TZP 檢出率高于90%，表明BZDs 在北京地區(qū)被廣泛使用. 其中OZP 在6 個(gè)污水廠(chǎng)進(jìn)水中平均檢出濃度最高，范圍為(15.1±1.4)~(22.4±3.8) ng/L，其 次 為QTP〔(10.1±1.4)~(18.5±1.5)ng/L〕 、 NMZP〔 (7.5±1.9)~(16.8±1.8) ng/L〕 、 DZP〔(2.9±0.2)~(7.1±2.0) ng/L〕、EZM〔(2.6±0.8)~(4.9±0.7)ng/L〕和LZP〔(3.1±3.9)~(8.8±7.4) ng/L〕，其余目標(biāo)化合物濃度均小于4 ng/L(見(jiàn)表5). 值得注意的是，18 種檢出物質(zhì)中有4 種屬于DBZDs(見(jiàn)表5)，分別為CDZP、ETM、FBZP 和MCZP，其濃度范圍為(0.03±0.1) ng/L(ETM) ~ (0.3±0.7) ng/L (MCZP). 在我國(guó)，DBZDs 未得到藥物監(jiān)管部門(mén)的生產(chǎn)使用許可，無(wú)法通過(guò)合法途徑獲取. 此外，由于以上4 種DBZDs 結(jié)構(gòu)或取代基團(tuán)的特殊性，無(wú)法通過(guò)合法BZDs 代謝或降解生成. 因此，采樣污水處理廠(chǎng)服務(wù)區(qū)內(nèi)可能存在DBZDs 濫用現(xiàn)象，應(yīng)加強(qiáng)對(duì)此類(lèi)藥物的檢測(cè)與管控.

表5 目標(biāo)BZDs 和DBZDs 在北京污水處理廠(chǎng)進(jìn)水中的平均濃度Table 5 Concentrations of target BZDs and DBZDs in influences of Beijing wastewater treatment plants

以藥物母體或代謝產(chǎn)物作為生物標(biāo)志物，利用1.6 節(jié)式(3)(4)估算北京地區(qū)檢出率較高的幾種常用BZDs 的使用量. 結(jié)果顯示，QTP〔(401.8±198.7) mg/(1 000 inh·d)〕、NMZP〔(301.1±177.0) mg/(1 000 inh·d)〕、MZM〔(68.0±32.6) mg/(1 000 inh·d)〕 、 ZPM〔 (36.0±14.9)mg/(1 000 inh·d)〕及EZM〔(24.7±9.1) mg/(1 000 inh·d)〕的使用量遠(yuǎn)高于OZP〔(7.4±2.5) mg/(1 000 inh·d)〕、ALP〔(4.0±4.9) mg/(1 000 inh·d)〕和DZP〔(3.5±1.5)mg/(1 000 inh·d)〕. 該研究結(jié)果低于2014 年Wang 等[31]對(duì)北京地區(qū)DZP 使用量的估算值〔(7.6~10.6) mg/(1 000 inh·d)〕，這可能與藥物生物標(biāo)志物的選擇、居民用藥習(xí)慣的改變等因素有關(guān).

3 結(jié)論

a) 該研究對(duì)污水樣品前處理方法和儀器條件進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果表明前處理過(guò)程應(yīng)選用Cleanert PCX萃取柱，依次使用2 mL 2%甲酸水溶液、2 mL 甲醇淋洗填料，使用4 mL 5%甲醇氨溶液洗脫目標(biāo)化合物，氮吹后用500 μL 50%甲醇水溶液復(fù)溶殘留物.

b) 該試驗(yàn)方法驗(yàn)證結(jié)果表明，25 種目標(biāo)化合物在回收率、基質(zhì)效應(yīng)、檢出限與定量限、線(xiàn)性范圍等方面符合試驗(yàn)要求，該方法能夠?qū)崿F(xiàn)超痕量目標(biāo)化合物的準(zhǔn)確、高效檢測(cè).

c) 對(duì)北京市6 家污水處理廠(chǎng)進(jìn)水樣品的測(cè)定說(shuō)明該方法能夠滿(mǎn)足實(shí)際樣品的分析測(cè)定要求. BZDs在北京市生活污水中廣泛存在，雖然DBZDs 檢出率較低，但可能存在濫用現(xiàn)象，需加強(qiáng)對(duì)此類(lèi)藥物的監(jiān)測(cè).

d) 由于未考慮BZDs 在污水管網(wǎng)中的穩(wěn)定性，因此該研究對(duì)北京地區(qū)BZDs 使用量估算存在一定不確定性. 未來(lái)可開(kāi)展BZDs 穩(wěn)定性相關(guān)研究，從方法學(xué)上提高其估算結(jié)果的準(zhǔn)確性.