鬼針草多糖提取工藝優(yōu)化研究

文│薛沾枚 孟維珊 張艷 劉雪松 楊旭東 王爽 陳曦 朱慶賀 羅天瑤（黑龍江省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)分院黑龍江省獸用藥物重點實驗室，黑龍江省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)分院）張備 張國華 馮萬宇 劉秋瑾 王歡 楊昊天 史同瑞*（黑龍江省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)分院）

鬼針草（Bidens bipinnata L.）又稱鬼釵草，全國分布廣泛，產(chǎn)量很多，是菊科草本植物。鬼針草中富含多糖、黃酮、皂苷等活性成分，具有清熱解毒、抗氧化、消腫、止瀉等作用，可作為飼草應(yīng)用到畜牧養(yǎng)殖中，但菊科植物本身具有特殊氣味，會影響動物采食，對其主要活性成分進行提取，能改善其適口性與消化性。超聲波提取法能加速中草藥多糖成分溶于溶劑中，有效提高多糖提取率，且操作簡單。因此，本試驗采用響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波提取鬼針草多糖，提高鬼針草多糖提取率，減少資源浪費，提高經(jīng)濟價值。

一、材料與方法

1.材料。

（1）藥材與主要試劑。鬼針草全草藥材，由黑龍江省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)分院中草藥基地采摘。

試劑：石油醚、無水乙醇、95%乙醇、丙酮、苯酚、濃硫酸、山梨醇（天津科密歐化學試劑有限公司）；葡萄糖標準品（中國食品藥品鑒定研究院）；試驗用水均為超純水。

（2）主要儀器。HH6-恒溫水浴鍋（力辰科技有限公司），F(xiàn)W100高速萬能粉碎機（天津市泰斯特儀器有限公司），752G紫外分光光度計（上海儀電控股集團公司），F(xiàn)-020SD超聲波清洗器（深圳市新開儀器有限公司）。

2.方法。

（1）鬼針草多糖提取及提取率計算。采用苯酚-硫酸法測定多糖，無水葡萄糖標準品為對照品，于490納米處測吸光度，根據(jù)公式計算鬼針草多糖率。取鬼針草藥材粉碎，過60目篩，稱取5克，加入一定體積倍數(shù)的超純水，取沉淀，干燥。

表1 響應(yīng)面試驗設(shè)計和結(jié)果

（2）單因素試驗設(shè)計。稱取5克鬼針草粉末共4份，料液比分別為1∶20克/毫升、1∶30克/毫升、1∶40克/毫升、1∶50克/毫升，設(shè)定超聲提取時間為35分鐘，溫度為45℃，計算料液比條件下鬼針草多糖提取率；在料液比為1∶30克/毫升，設(shè)定超聲提取溫度為45℃，提取時間分別為30、35、40、45分鐘，計算不同提取時間鬼針草多糖提取率。在料液比為1∶30克/毫升，設(shè)定超聲提取時間為35分鐘，提取溫度設(shè)定為40、45、50、55℃，計算不同提取溫度條件下鬼針草多糖提取率。

（3）響應(yīng)面法優(yōu)化鬼針草多糖的提取條件。根據(jù)單因素分析結(jié)果，設(shè)定料液比、提取時間、提取溫度的自變量條件，以鬼針草多糖含量為響應(yīng)值，采用Box-Benhnken8.0.6試驗設(shè)計方法優(yōu)化出鬼針草多糖最佳提取工藝條件。

（4）數(shù)據(jù)分析。每組試驗采用3次重復(fù)，試驗采用SPSS 20.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，P ＜0.05表示差異顯著，采用Oringe8.0軟件進行繪圖。

二、結(jié)果與分析

1.單因素試驗結(jié)果。由圖1可知，當料液比為1 ∶3 0 克/毫升時提取率達到最高7.59%，當提取時間為5 0 分鐘時提取率達到最高6.71%，當溫度為50℃時提取率達到最高7.48%。

◎圖1 各因素對超聲波法鬼針草多糖提取率影響

2.響應(yīng)面優(yōu)化提取工藝。

（1）鬼針草多糖提取率的數(shù)字模型建立。根據(jù)單因素試驗結(jié)果設(shè)計以料液比（A）、提取時間（B）和提取溫度（C）為自變量，多糖提取率為響應(yīng)值，采用Box-Benhnken8.0.6設(shè)計3因素3水平試驗，試驗結(jié)果見表2。利用Design Expert8.0對試驗數(shù)據(jù)進行方差分析，結(jié)果如表3。得到回歸方程：Y＝8.06+0.22A+0.37B+0.64C+0.35AB+0.055AC-0.058BC-1.27A2-1.19B2-0.45C2，此模型建立具有較強的顯著性與擬合性，適合超聲工藝優(yōu)化提取鬼針草多糖預(yù)測分析，方差結(jié)果A、B、C、A2、B2、C2均顯著，P＜0.01或P＜0.05；各因素對鬼針草多糖提取率影響為提取溫度＞提取時間＞料液比；AC與BC項不顯著P ＞0.05，將這兩項從回歸方程中刪除，回歸方程得率為Y=8.06+0.22A+0.37B+0.64C+0.35AB-1.27A2-1.19B2-0.45C2。

◎圖2 料液比和超聲時間的相互作用及等高線分析圖

◎圖3 料液比和提取溫度的相互作用及等高線分析圖

◎圖4 提取溫度和超聲時間的相互作用及等高線分析圖

表2 回歸方差分析

（2）鬼針草多糖提取率的響應(yīng)面分析。利用Design Expert 8.0.6軟件對表3數(shù)據(jù)進行擬合，所得的響應(yīng)面及等高線見圖3～5。本試驗中BC的相互交互最為顯著，兩兩之間互相影響顯著順序為：BC＞AC＞AB。

（3）模型驗證。響應(yīng)面分析結(jié)果得出，最佳鬼針草多糖最佳提取條件為料液比1∶30.02克/毫升、提取時間50.95分鐘、提取溫度55.40℃，提取率為8.31%，考慮到實際工藝的方便性，將提取工藝優(yōu)化設(shè)定為料液比1∶30克/毫升、提取時間51分鐘、提取溫度55℃，進行工藝驗證。對上述工藝條件進行3次驗證，鬼針草多糖平均提取率為8.23%，與預(yù)測值8.31%無顯著差異，說明模型成功有效，方法可行。

三、討論

多糖提取過程中存在提取時間較長、能量消耗高、經(jīng)濟費用高及環(huán)境污染等問題。超聲波法提取技術(shù)是通過空化氣泡破裂而產(chǎn)生的高強度沖擊波與剪切力，使植物細胞破碎內(nèi)容物溶出，是一種高效率和綠色環(huán)保的提取技術(shù)。響應(yīng)面設(shè)計能準確分析各因素與響應(yīng)值的關(guān)系，獲得最佳優(yōu)化工藝。在本試驗中，隨著料液比的增加，多糖提取率呈先上升后下降的趨勢。提取過程中料液比低，得不到充分浸提，會導(dǎo)致提取率低。隨著時間的增加，多糖提取率呈先上升后下降趨于穩(wěn)定的趨勢，其原因可能是由于超聲時間增加，鬼針草內(nèi)其他易于溶于水的成分也被提取出來。隨著溫度的上升，鬼針草多糖提取率呈先上升后下降的趨勢，其原因可能是由于高溫破壞了多糖結(jié)構(gòu)，降低了鬼針草多糖的提取率。響應(yīng)面優(yōu)化鬼針草多糖提取工藝的提取溫度對提取率的影響最大。分析其原因，可能是由于提取過程中溫度能促使藥物有效溶解在提取液中，但多糖類成分會由于溫度過高分解變性。

四、結(jié)語