膽紅素代謝通路主要酶的基因多態(tài)性研究進展*

段改原,李宇晨,蔣 雪 綜述,劉 玲 審校

1.昆明醫(yī)科大學研究生院,云南昆明 650500;2.大理大學研究生院,云南大理 671000;3.云南省昆明市兒童醫(yī)院新生兒科,云南昆明 650103

膽紅素來源于體內的血紅素,是血紅蛋白及其他血紅素蛋白在單核-巨噬細胞或其他網(wǎng)織內皮細胞及肝細胞中的代謝終產物。血紅素在微粒體血紅素氧合酶1(HO-1)、還原型輔酶Ⅱ(NADPH)及細胞色素c還原酶的作用下形成膽綠素,再由膽綠素還原酶(BLVR)還原為膽紅素,此時的膽紅素為未結合膽紅素(UCB)。UCB在血液中與清蛋白結合形成復合體,經(jīng)血液循環(huán)運輸至肝臟的Disse腔后與清蛋白分離,分離后的UCB在有機陰離子轉運肽2(OATP2)的作用下進入肝細胞,并與肝細胞胞質內的Y蛋白和Z蛋白結合,被運輸至肝細胞滑面內質網(wǎng),膽紅素在此被尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉移酶(UDPGT)催化與葡萄糖醛酸進行1～2次結合反應,形成結合膽紅素(CB),CB又經(jīng)多藥耐受相關蛋白2(MRP2)從肝細胞排出,并經(jīng)膽道系統(tǒng)排入腸腔,其中,部分CB在腸道細菌的作用下分解為未結合膽紅素,經(jīng)腸肝循環(huán)再次入血。

總之,膽紅素代謝是人體內一個復雜且受多因素影響的過程,代謝過程中任意一個環(huán)節(jié)異常均可引起血清膽紅素升高,造成嚴重不良后果。據(jù)報道,高膽紅素血癥是新生兒常見的疾病之一。該病主要表現(xiàn)為皮膚、鞏膜黃染,嚴重者可出現(xiàn)膽紅素腦病和肝功能損傷等并發(fā)癥,留下明顯的后遺癥。近年來,國內外學者對膽紅素代謝酶基因多態(tài)性開展了廣泛的研究,尤其是葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G-6-PD)、尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉移酶1A1(UGT1A1)、溶質載體有機陰離子轉運蛋白1B1(SLCO1B1),這些編碼基因突變將導致相應的酶或轉運蛋白功能障礙,嚴重影響膽紅素代謝。本文就國內外關于G-6-PD、UGT1A1、SLCO1B1、HO-1、BLVRA基因多態(tài)性研究進展進行總結。

1 G-6-PD

G-6-PD是人體內的管家酶,參與催化磷酸戊糖旁路途徑產生NADPH,而NADPH是預防氧自由基引起細胞結構損傷的重要物質。因此,當G-6-PD缺乏或活性降低時會影響NADPH的生成,紅細胞極易受氧化性損傷失去變形能力,在血流沖擊和毛細血管的擠壓作用下被破壞,發(fā)生急性溶血進而引起高膽紅素血癥。G-6-PD基因定位于X染色體長臂2區(qū)8帶(Xq28),由13個外顯子和12個內含子組成,全長約18 kb,編碼的G-6-PD由515個氨基酸組成。G-6-PD缺乏的遺傳方式為X染色體不完全顯性遺傳。男性患者只有一條X染色體,為半合子,酶活性常顯著缺乏。女性兩條X染色體上一般只有一條有G-6-PD基因缺陷,為雜合子,其酶活性可正常至顯著缺乏。根據(jù)遺傳規(guī)律,該病男性患者常多于女性患者。BAHR等[1]曾報道了一個來自歐洲血統(tǒng)的北美家庭家族性G-6-PD缺乏,包括64名家族成員、涉及7代人,其中就有35名男性患有嚴重G-6-PD 缺乏癥(c.637G>T)。

G-6-PD缺乏是人類最常見的酶缺乏疾病之一,在世界范圍內廣泛存在,全球約5億人受累,但患病率差異很大,在部分非洲地區(qū)的患病率>20%,在亞洲地區(qū)如中國、印度等的患病率為10%～15%,在緬甸的患病率則>20%,在美洲地區(qū)如美國、巴西等的患病率為5%～10%[2]。迄今為止,約200種G-6-PD基因突變被報道,G-6-PD基因多態(tài)性存在地域、種族差異。據(jù)國外研究報道,非洲人G-6-PD基因突變以p.Asn126Asp(G-6-PD A+)、p.Val68Met (G-6-PD Asahi)和p.Ile48Thr(G-6-PD Aures)常見,歐洲人則以p.Ala335Thr(G-6-PD Chatham)為主[3]。阿拉伯地區(qū)以p.Tyr437Tyr常見,而且p.Asp135Thr、p.Ser179Asn、p.Arg246Leu、p.Glu307Pro突變僅在阿拉伯人群中被報道[4]。BOONYAWAT等[5]報道在泰國G-6-PD缺乏的兒童中,最常見的突變?yōu)閏.871G>A,其次為c.1376G>T、c.1388G>A、c.487G>A。G-6-PD基因不同位點突變導致G-6-PD不同程度失活,出現(xiàn)高膽紅素血癥,甚至出現(xiàn)核黃疸。2015年,LIU等[6]納入了研究對象來自以色列、美國、印度及中國臺灣地區(qū)的5篇原始文獻進行薈萃分析,發(fā)現(xiàn)G-6-PD缺乏的新生兒高膽紅素血癥和光療風險分別是G-6-PD正常新生兒的3.92倍和3.01倍,但未進行突變亞群分析。然而,WISNUMUTI等[7]報道印度尼西亞Deutromalay人群新生兒最常見的G-6-PD基因突變是c.871G>A,其次是c.1376G>T和p.Leu128Pro,但是病例組(1.72%)與對照組(1.74%)G-6-PD缺乏癥的患病率相似,G-6-PD基因多態(tài)性與印度尼西亞Deutromalay人群新生兒高膽紅素血癥無明顯關系。造成以上不同結論的原因多考慮是納入的研究對象存在明顯種族差異。此外,G-6-PD缺乏的嬰兒更容易發(fā)生核黃疸。CUNINGHAM等[8]報道美國發(fā)生核黃疸的嬰兒中有20%為G-6-PD缺乏,并且發(fā)生核黃疸后,G-6-PD缺乏的嬰兒病死率約15%,而G-6-PD正常嬰兒僅為1%。

我國G-6-PD缺乏的總體患病率約2.1%,基因突變以c.1388G>A、c.1376G>T、c.95A>G最常見,不同地區(qū)患病率差異較大,北方地區(qū)低于南方地區(qū)[9]。LIU等[10]對中國2013-2017年共6 919 647例新生兒進行G-6-PD缺乏篩查,發(fā)現(xiàn)最常見的3個突變與HE等[9]報道的一致,并首次報道了4個變異位點:c.152C>T、c.290A>T、c.697G>C和c.1285A>G。G-6-PD缺乏癥主要發(fā)生在華南地區(qū),其基因多態(tài)性因地區(qū)和種族而存在差異,如:c.487G> A在山東和山西很普遍,但在廣東、廣西和浙江卻很少;c.592C>T及c.1360C>T僅在廣東、廣西、山東和浙江等沿海地區(qū)的新生兒中發(fā)現(xiàn)。TONG等[11]對中國東南部地區(qū)1 565例高膽紅素血癥嬰兒進行G-6-PD基因檢測,發(fā)現(xiàn)439例(28.1%)存在G-6-PD突變。除最常見的3種突變外,該研究還檢測到一個新的錯義突變——c.1118 T>C,位于G-6-PD基因外顯子9,這種錯義突變使G-6-PD活性明顯降低,出現(xiàn)嚴重高膽紅素血癥。

總而言之,G-6-PD缺乏在世界各國普遍常見,部分G-6-PD基因突變可引起嚴重高膽紅素血癥,造成核黃疸,甚至死亡。因此,對新生兒進行G-6-PD缺乏篩查非常必要,如若條件允許,建議將G-6-PD缺乏篩查納入常規(guī)產前檢查,對于父母存在G-6-PD缺乏或突變攜帶的患兒能夠盡早診斷,及時治療。

2 UGT1A1

UGT1A1現(xiàn)已被證實是人體內唯一能降低血清膽紅素的酶,其編碼基因位于2號染色體長臂37區(qū)8帶(2q37),是由第1外顯子和4個共同外顯子(第2～5)組成的復合體,基因全長218 kb,mRNA長2.36 kb。UGT1A1基因多態(tài)性主要發(fā)生在編碼區(qū)外顯子、啟動子,也可發(fā)生在遠端加強序列、內含子及剪接位點。UGT1A1基因不同位點突變將導致UGT1A1活性不同程度降低,表現(xiàn)為Gilbert綜合征(GS)、Crigler-Najjar綜合征Ⅰ型及Ⅱ型(CNS-Ⅰ/Ⅱ)。膽紅素不僅具有神經(jīng)毒性,還可加重UGT1A1基因缺陷者肝功能損害。LIU等[12]曾報道在UGT1A1基因敲除的小鼠體內UCB增加可以刺激kuffer細胞釋放炎癥因子,進而激活肝臟星狀細胞,在膽紅素的刺激下,肝臟中的核因子(NF)-κB抑制劑α(IκB-α)、NF-κB抑制物激酶-β(IKK-β)和p65被過度磷酸化,導致NF-κB活化進而誘導肝細胞DNA損傷。此外,NF-κB的激活還可抑制UGT1A1的表達,從而加重高膽紅素血癥,如此形成了一個惡性循環(huán)。因此,臨床醫(yī)生在診治高膽紅素血癥合并肝功能損害的患者時,若其存在UGT1A1基因缺陷,應格外重視。

目前UGT1A1基因突變已發(fā)現(xiàn)約163種,多為啟動子及編碼區(qū)外顯子突變。啟動子多態(tài)性以TATA盒插入突變最常見,其序列的長度與高膽紅素血癥程度呈負相關。UGT1A1基因可以精確調節(jié)轉錄起始的DNA序列,而啟動子TATA盒突變會導致轉錄起始的頻率和準確性異常,即使可以產生有正常結構的酶分子,但其表達減少會降低酶的活性,進而影響膽紅素代謝。TATA盒突變是GS的遺傳基礎,純合A(TA)6TAA為野生型,其余為突變型,以A(TA)7TAA突變最常見。研究發(fā)現(xiàn),A(TA)7TAA在非洲裔美國人中突變率較高,約為44.6%,在高加索人群中突變率約38.8%,在俄羅斯人中突變率約為38.5%,在越南人中突變率約為6.0%,而在中國人中突變率相對較低,約為1.0%[13-15]。有研究表明復合雜合A(TA)7TAA和c.211G>A,或單一純合A(TA)7TAA是我國漢族人群GS的主要基因型,并且顯著增加患高膽紅素血癥的風險[16]。但在巴拿馬地區(qū),A(TA)7TAA多態(tài)性與新生兒高膽紅素血癥之間無明顯關系[17],這可能與環(huán)境因素如日照、飲食有關。LI等[18]的一項薈萃分析認為A(TA)7TAA多態(tài)性與新生兒高膽紅素血癥無關,但納入的原始研究較少(僅4篇),未來仍需要更多高質量、大樣本量的研究來證實。TATA盒突變除A(TA)7TAA外,也有A(TA)8TAA、A(TA)5TAA的報道。DAPR等[19]應用Taqman PCR技術對53例GS患者UGT1A1(TA)n多態(tài)性進行基因分型,發(fā)現(xiàn)39.6%是野生型,24.5%為A(TA)7TAA純合突變,30.2%為A(TA)7TAA雜合突變,A(TA)7TAA和A(TA)8TAA復合雜合突變、A(TA)5TAA雜合突變各占1.9%。UGT1A1基因編碼區(qū)以第1外顯子c.211G>A錯義突變最常見,尤其是c.211G>A純合突變使UGT1A1活性明顯降低,表現(xiàn)為GS或CNS-Ⅱ。CHEN等[20]使用慢病毒載體和COS-7細胞建立體外UGT1A1野生型和c.211G>A純合及雜合突變的細胞模型,發(fā)現(xiàn)c.211G>A純合子及雜合子UGT1A1活性分別為野生型的22.0%和71.0%,純合酶活性明顯低于雜合酶,原因可能是c.211G>A突變影響了蛋白質的空間構象,降低了酶與底物的結合。c.211G>A突變是新生兒高膽紅素血癥的危險因素,主要見于中國、日本、韓國等亞洲黃種人,在歐洲、美洲等白種人較少見[15,21]。除c.211G>A外,外顯子c.3279 T>G也有報道。2020年,LI等[22]納入了7項病例對照研究進行薈萃分析,發(fā)現(xiàn)c.3279 T>G是新生兒高膽紅素血癥的易感因素,但是其納入的研究對象包括亞洲人群、非洲人及高加索人,其人種、環(huán)境、生活習慣的異質性可能影響薈萃分析的結果。近年來,隨著分子生物學的發(fā)展,基因檢測技術的進步,越來越多的突變位點被報道。2022年,GU等[13]報道在中國人群中新發(fā)現(xiàn)了7個變異位點,分別是p.Ala61Gly、p.Leu166Alafs*16、p.Ser306Phe、p.Glu424*、p.R341Q、p.R240K、p.Y67F,其中前4個變異可能是致病變異,后3個變異意義不明。這可能是因為UGT1A1基因與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展有關,除高膽紅素血癥外,UGT1A1基因多態(tài)性與乳腺癌、前列腺癌、直腸癌等癌癥以及伊立替康導致化療相關性腹瀉、中性粒細胞減少均有關系。對于意義不明的突變是否與臨床表型相關,未來可以利用基因重組技術進行基因敲除,從而進行功能驗證。

3 SLCO1B1

SLCO1B1基因編碼的OATP2在肝細胞攝取膽紅素的過程中起重要作用,SLCO1B1基因突變將影響OATP2轉運功能,進而引起高膽紅素血癥。SLCO1B1基因位于12號染色體短臂1區(qū)2帶(12p12),全長108.59 kb,由15個外顯子和14 個內含子組成。人類OATP2的cDNA包含2 073個堿基對,編碼691個氨基酸。研究發(fā)現(xiàn),與在人腦、腎臟、肝臟和睪丸中均高度表達的人OATP1相比,OATP2的強信號僅在肝臟中檢測到,是肝細胞基底膜外側將有機陰離子、未結合膽紅素等轉運至細胞內的一種極其重要的轉運蛋白。迄今為止,已發(fā)現(xiàn)的SLCO1B1基因突變已超過100余種,研究最多的是c.388 G>A及c.521 T>C。PASANEN等[23]研究了來自非洲、中東、亞洲、歐洲、大洋洲和美洲的52個人群SLCO1B1等位基因分布,發(fā)現(xiàn)c.521T>C頻率在人群之間顯著不同,在美國人群中為24.0%,在歐洲人群中18.0%,在撒哈拉以南非洲人群中為1.9%,在大洋洲人群中為0.0%,并且經(jīng)種群之間相比發(fā)現(xiàn),SLCO1B1基因在種群內部更具多樣性。LEE等[24]研究發(fā)現(xiàn)c.521T>C在歐美人群中突變頻率較高,約14%,在非裔美國人中則為2%,與PASANEN等[23]結果一致;相反,c.388A>G則主要見于非裔美國人,約74%,歐美人則為30%。BOO等[25]研究認為SLCO1B1變異體在馬來西亞新生兒中普遍存在(49.3%),其中,c.388 G>A占26.3%,c.512 T>C占23.0%,而且c.388 G>A是新生兒高膽紅素血癥的風險因素。AMANDITO等[26]報道c.512 T>C在印度尼西亞高膽紅素血癥新生兒中很常見,但其多態(tài)性與膽紅素水平無關。在國內,BAI等[27]、LI等[28]均認為c.521T>C是中國人群高膽紅素血癥的遺傳危險因素,但張鈺恒等[29]的研究不支持此觀點。我國幅員遼闊、民族眾多,地域、民族異質性可能是造成以上不同觀點的主要原因;其次是研究樣本數(shù)量有限,代表性欠佳,未來仍需擴大樣本研究,進一步對民族亞群進行分析。

4 HO-1

血紅素氧合酶(HO)的編碼基因位于染色體22q12上,由5個外顯子和4個內含子組成,是細胞內唯一能分解血紅素的管家酶,相對分子質量約為33×103,是一種單體蛋白,可將血紅素降解為等摩爾量的一氧化碳、游離鐵和膽綠素。HO以3種活性異構體(HO-1、HO-2和HO-3)存在。HO-1,也稱為熱休克蛋白 32(Hsp32),是一種誘導型亞型,其表達可被不同的應激條件上調,并被多種刺激激活;HO-2和HO-3為組成型亞型,在大多數(shù)人體組織中以基礎水平表達,但在神經(jīng)元、脾臟和肝臟中的水平較高。HO-1活性在很大程度上取決于轉錄水平。然而,HO-1啟動子的表達受腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、神經(jīng)生長因子、白細胞介素、γ-干擾素及其底物等多種刺激因子調節(jié)。因此,這些刺激因子水平可間接影響HO-1活性,最終引起一系列疾病。

目前關于HO-1基因多態(tài)性與高膽紅素血癥的研究主要集中在啟動子區(qū)域(GT)n重復多態(tài)性,而且短(GT)n等位基因可能是高膽紅素血癥的遺傳危險因素[30]。TIWARI等[31]報道印度新生兒(GT)n重復長度在15～40個,短(GT)n重復(≤20個)是新生兒高膽紅素血癥的獨立危險因素。KATAYAMA等[32]報道日本新生兒(GT)n重復長度在16～41個,排除UGT1A1基因211G>A多態(tài)性攜帶者后,短(GT)n等位基因(<22個)的攜帶者新生兒高膽紅素血癥的發(fā)生率更高。以上兩項研究表明不同地區(qū)(GT)n的重復長度范圍差異不大,短(GT)n增加了患高膽紅素血癥的風險。但是,在一項針對非裔美國嬰兒的(GT)n多態(tài)性研究中,將等位基因長度分為短(S,<25個)、中 (M,25～33個)、長(L,>33個),其中有12.2% 的等位基因是S,但是至少有1個L等位基因的嬰兒與至少有1個S等位基因的嬰兒之間的總膽紅素血癥風險百分位數(shù)差異無統(tǒng)計學意義[(48.6±34.0)%vs.(44.9±31.6)%,P=0.51][33]。這些研究結果不一致可能與地域、種族差異有關,前兩項研究以亞洲人群為研究對象,后一項研究則以非裔人群為研究對象。但也有可能是因為膽紅素水平易受到其他遺傳因素或環(huán)境因素的影響。總體而言,目前關于HO-1基因多態(tài)性與高膽紅素血癥的相關性研究較少,結論不一,對于(GT)n重復長短定義也不同,未來仍需大量樣本進行研究,以定義出短(GT)n數(shù),并對多項研究薈萃分析短(GT)n是否為高膽紅素血癥的危險因素。

5 BLVRA

BLVR有2種同工酶,即BLVRA和BLVRB。BLVRA水平在妊娠20周時增加,而BLVRB在妊娠14～15周可以被檢出。BLVRA的mRNA在腦、肺和胰腺中水平較高,在肝臟和胎盤中水平較低。BLVRA將膽綠素Ⅸα還原為膽紅素Ⅸα,即未結合膽紅素,是成人膽紅素的主要形式。BLVRB存在于成人的所有組織中,其功能作用尚未完全闡明。HO在β-meso位置裂解胎兒血紅素,產生膽綠素Ⅸβ,再由BLVRB還原為膽紅素Ⅸβ,膽紅素Ⅸβ的溶解度較高,可以直接排泄。因此,BLVR基因多態(tài)性與高膽紅素血癥的研究主要為BLVRA多態(tài)性與高膽紅素血癥的研究。編碼人膽綠素-Ⅸα還原酶的cDNA核苷酸長度約1 146 bp,編碼296個氨基酸。BLVRA主要以單體形式存在,是血紅蛋白氧化酶-膽紅素抗氧化系統(tǒng)的重要成員之一,具有蘇氨酸、絲氨酸和酪氨酸蛋白激酶的活性,可以激活TF-2和HO-1的轉錄因子,參與細胞內信號傳導。BLVRA基因突變導致其結構改變,影響其功能。LI等[28]報道rs699512基因座是BLVRA基因唯一常見的非同義單核苷酸多態(tài)性,其錯義突變使極性蘇氨酸(Thr)變?yōu)榉菢O性丙氨酸(Ala),使BLVRA活性增加,最終引起膽紅素升高,是中國漢族新生兒人群中新生兒高膽紅素血癥的易感基因。周進福等[34]以福建地區(qū)新生兒高膽紅素血癥患兒為研究對象,發(fā)現(xiàn)rs699512位點A等位基因及rs1637530位點C等位基因是新生兒高膽紅素血癥的易感基因,但YANG等[35]研究認為rs699512位點多態(tài)性和新生兒高膽紅素血癥無明顯相關。目前為止,BLVRA基因多態(tài)性與高膽紅素血癥相關性研究較少,其具體發(fā)病機制尚未闡明,未來有待進一步研究。

6 小結與展望

綜上所述,G-6-PD、UGT1A1、SLCO1B1、HO-1、BLVRA基因多態(tài)性均存在地域、種族差異,不同突變位點在不同人群中基因頻率不同,而且G-6-PD、UGT1A1、SLCO1B1基因突變具有積累效應,攜帶風險因素的數(shù)量越多,發(fā)生高膽紅素血癥及其并發(fā)癥的風險就越大。但截至目前,大多數(shù)研究局限于基因多態(tài)性與高膽紅素血癥的相關性,對其治療及預后研究甚少,而且由于研究樣本數(shù)量有限,部分研究結果相悖。隨著科技的發(fā)展及基因檢測技術的進步,人類將迎來基因時代,未來仍需進行大樣本基因多態(tài)性與高膽紅素血癥的相關研究,對于存在基因突變的高膽紅素血癥患者,以期治療上能從基因方面取得突破。