殼聚糖在牙髓再生中的應(yīng)用進(jìn)展

胡 玲,倪世磊,詹駱寧,劉曉莉,謝曉昱,李 毅*

(1.吉林大學(xué)口腔醫(yī)院,吉林 長(zhǎng)春130021;2.吉林省牙發(fā)育及頜骨重塑與再生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,吉林 長(zhǎng)春130021)

牙髓再生是利用組織工程學(xué)原理使種子細(xì)胞在支架材料上擴(kuò)增生長(zhǎng)成為類似牙髓的新生組織,恢復(fù)正常的牙髓-牙本質(zhì)復(fù)合體的結(jié)構(gòu)和功能。殼聚糖(chitosan,CS)作為組織工程研究中常用的支架材料之一,是一類由幾丁質(zhì)脫乙?；幚慝@得的線性陽(yáng)離子多糖,由于具有合適的機(jī)械性能、良好的生物相容性、降解性、廣譜抗菌性等眾多生物學(xué)特性,近年來在組織工程再生領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。本文針對(duì)殼聚糖的生物學(xué)特性,結(jié)合其目前在牙髓再生領(lǐng)域的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 殼聚糖的一般特性

1.1 殼聚糖的結(jié)構(gòu)

殼聚糖是天然大分子中含量最豐富的多糖之一,存在于節(jié)肢動(dòng)物的外骨骼或真菌和酵母的細(xì)胞壁中,是由D-氨基葡萄糖和N-乙?；?D-氨基葡萄糖通過β-(1,4)-糖苷鍵組成的共聚物。分子量和脫乙酰度(degree of deacetylation,DD)對(duì)殼聚糖的理化性質(zhì)及生物學(xué)特性起到?jīng)Q定性作用。一般來說,殼聚糖的DD越高,分子鏈中氨基的質(zhì)子化程度越高,水溶性及生物學(xué)效應(yīng)越高。殼聚糖的分子量與聚合物鏈的構(gòu)型相關(guān),低分子量殼聚糖的聚合物鏈通常呈松弛、近似線性的鏈,暴露出較多的氨基;分子量增加主鏈原子超過600個(gè)時(shí),聚合物鏈開始盤繞,氨基基團(tuán)被包裹在聚合物內(nèi),氨基質(zhì)子化程度降低,因此低分子量的殼聚糖表現(xiàn)出更強(qiáng)的水溶性和生物活性[1]。

1.2 殼聚糖的生物相容性

殼聚糖具有良好的生物相容性,可促進(jìn)多種細(xì)胞的增殖,這是殼聚糖在組織再生領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用的主要原因之一。殼聚糖對(duì)人牙髓干細(xì)胞(dental pulp stem cells,DPSCs)無明顯細(xì)胞毒性,將多孔殼聚糖支架與DPSCs 共同培養(yǎng)時(shí)DPSCs表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞增殖活性[2]。但這種促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用機(jī)制在不同細(xì)胞中可能存在不同。研究表明,殼聚糖處理的間充質(zhì)干細(xì)胞中,細(xì)胞數(shù)量及TLR2和TLR4的表達(dá)較空白組明顯增強(qiáng),這說明殼聚糖可通過Toll樣受體(toll-like receptor,TLR)調(diào)節(jié)間充質(zhì)干細(xì)胞增殖[3]。而將殼聚糖與角膜上皮細(xì)胞(RCECs)共培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)則發(fā)現(xiàn)殼聚糖處理的RCECs數(shù)量和p-ERK1/2表達(dá)水平顯著提高,使用ERK抑制劑PD98059預(yù)處理RCECs則這種改變消失,證明殼聚糖可激活ERK信號(hào)通路促進(jìn)細(xì)胞的增殖[4]。

1.3 殼聚糖的降解性

牙髓重建是一個(gè)需要時(shí)間的復(fù)雜過程,支架的降解對(duì)牙髓組織生長(zhǎng)和基質(zhì)沉積產(chǎn)生重要影響。殼聚糖在體內(nèi)降解所需的主要酶之一是溶菌酶,該酶通過水解乙酰化基團(tuán)來降解殼聚糖[5]。高DD和低分子量的殼聚糖乙酰基基團(tuán)較少,降解速率快。研究表明,對(duì)殼聚糖進(jìn)行改性及修飾或可調(diào)節(jié)殼聚糖的降解速率,Navidi等[5]在殼聚糖支架中添加SAPO-34、CaO和Fe2O3納米粒子,使溶菌酶作用于乙酰化基團(tuán)的難度增加,72小時(shí)內(nèi)支架的降解率從23%降低至16%;畢博等[6]用不同濃度的還原氧化石墨烯(rGO)修飾殼聚糖支架,在相同降解時(shí)間時(shí),復(fù)合支架的降解率隨著rGO含量的增加而逐漸下降。牙髓再生需要支架材料在合適的時(shí)間內(nèi)降解,通過對(duì)殼聚糖的改性修飾可使支架降解速率與牙髓組織重建時(shí)間相適配。

1.4 殼聚糖的機(jī)械性能

機(jī)械性能是支架材料的重要性能之一,支架應(yīng)提供組織起源的剛度,機(jī)械強(qiáng)度允許通過外科手術(shù)植入。殼聚糖支架機(jī)械強(qiáng)度較低,據(jù)報(bào)道,DD高于60%的殼聚糖的拉伸強(qiáng)度為250～400 g/mm2,未交聯(lián)殼聚糖支架的彈性模量為3.8 kPa,交聯(lián)后彈性模量提高到7.4～19.9 kPa[7]。在牙髓再生中,材料彈性模量低易引起支架收縮可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞與牙本質(zhì)壁間的空隙對(duì)新組織的形成產(chǎn)生不利影響[8],機(jī)械強(qiáng)度高的材料具有優(yōu)異的機(jī)械穩(wěn)定性,更利于牙髓干細(xì)胞分化和牙本質(zhì)樣組織的形成[9]。因此,提高殼聚糖支架的機(jī)械性能有利于牙髓組織再生的過程。目前提高殼聚糖支架機(jī)械性能的主要方法是將殼聚糖與其他材料復(fù)合使用,將10%的生物活性玻璃加入殼聚糖支架,殼聚糖的抗壓強(qiáng)度從34 kPa提高到363 kPa,壓縮模量從0.41 MPa提高到10.04 MPa[10];而向殼聚糖支架中加入0.5%還原氧化石墨烯后,支架的彈性模量由(1.10±0.14)MPa上升到(1.87±0.25) MPa,同時(shí)支架的吸水率提高[6]。

2 殼聚糖的抗菌作用

控制根管內(nèi)感染是牙髓再生的關(guān)鍵之一,確保根管內(nèi)的無菌環(huán)境對(duì)牙髓組織再生極其重要[11]。殼聚糖具有廣譜抗菌性能,對(duì)細(xì)菌和真菌均有抑制作用。研究表明,殼聚糖對(duì)持續(xù)性牙髓感染中常見的糞腸球菌(細(xì)菌)和白色念珠菌(真菌)的浮游形態(tài)和生物膜均產(chǎn)生抑制效果,可降低培養(yǎng)液中游離微生物數(shù)量,抑制生物膜中微生物的代謝活性、延緩生物膜的形成[12-13]。改性的殼聚糖在抗菌方面可能起到更好的作用,Thienngern等[14]將殼聚糖與聚乙二醇或丙二醇共混進(jìn)行物理改性,增加了殼聚糖的流動(dòng)性,對(duì)牙本質(zhì)小管的滲透增強(qiáng)從而使殼聚糖更好的與定植到牙本質(zhì)小管內(nèi)的微生物作用;將殼聚糖與Ag、Au、Zn、Cu等具有抗菌活性的金屬粒子復(fù)合改性,對(duì)多種革蘭陰性菌和革蘭陽(yáng)性菌發(fā)揮協(xié)同增效抗菌作用[15];Han等[16]對(duì)殼聚糖甲基化和磺化修飾得到電離殼聚糖(ICS),增加了殼聚糖氨基上的正電荷密度,能更好地吸附在微生物表面發(fā)揮抗菌作用。殼聚糖的陽(yáng)離子特性增強(qiáng)導(dǎo)致抗菌性增加,說明殼聚糖的抗菌機(jī)制可能是通過氨基上的正電荷與細(xì)菌表面的負(fù)電荷相互作用,導(dǎo)致細(xì)胞膜通透性的變化誘導(dǎo)細(xì)菌破裂死亡。另一報(bào)道指出,綠原酸接枝殼聚糖能降低金黃色葡萄球菌中ATP酶和過氧化氫酶的活性,影響細(xì)菌的抗氧化系統(tǒng)和能量代謝;同時(shí)破壞細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)并與遺傳物質(zhì)DNA結(jié)合,影響金黃色葡萄球菌的活性,說明殼聚糖的抗菌機(jī)制還可能與影響細(xì)菌代謝和破壞細(xì)菌遺傳物質(zhì)相關(guān)[17]。

3 殼聚糖誘導(dǎo)干細(xì)胞分化作用

牙髓再生主要包括牙本質(zhì)形成、牙髓血運(yùn)重建和神經(jīng)再支配,通過干細(xì)胞牙源性分化、血管內(nèi)皮分化及神經(jīng)分化可實(shí)現(xiàn)不同結(jié)構(gòu)的組織再生。殼聚糖支架具有誘導(dǎo)干細(xì)胞分化的能力,細(xì)胞在三維支架上沿著多孔結(jié)構(gòu)立體生長(zhǎng),胞體拉伸、細(xì)胞骨架發(fā)生形變,這種形變產(chǎn)生力學(xué)刺激作用于細(xì)胞膜上的相關(guān)蛋白并傳遞到細(xì)胞內(nèi)部,激活下游一系列信號(hào)通路,如MAPK通路、β-catenin通路等,從而影響細(xì)胞分化[18]。

3.1 殼聚糖誘導(dǎo)干細(xì)胞牙源性分化

研究發(fā)現(xiàn),殼聚糖可促進(jìn)DPSCs成牙分化,Porrelli等[19]將乳糖改性的殼聚糖(CTL)均勻涂覆在支架多孔結(jié)構(gòu)表面研究其對(duì)DPSCs成牙分化的作用,發(fā)現(xiàn)CTL能促進(jìn)DPSCs堿性磷酸酶的表達(dá),并使礦物質(zhì)沉積增加,證明CTL在促進(jìn)DPSCs牙源性分化中具有一定作用。殼聚糖還可促進(jìn)脫落乳牙干細(xì)胞(stem cells from human exfoliated deciduous teeth,SHEDs)成牙分化,在Subhi等[20]的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)殼聚糖加入到水門汀內(nèi)后SHEDs的牙源性分化標(biāo)志物表達(dá)水平較加入前升高并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,證明殼聚糖的加入促進(jìn)了SHED的成牙本質(zhì)向分化。體內(nèi)研究同樣證明殼聚糖促進(jìn)干細(xì)胞成牙分化的效果,Ashry等[21]在狗蓋髓模型中將殼聚糖與MTA作為蓋髓劑,檢測(cè)到添加殼聚糖的MTA組樣品中DSPP的mRNA表達(dá)水平較僅使用MTA組顯著提高,進(jìn)而說明殼聚糖促進(jìn)DPSCs牙源性分化的能力。然而目前殼聚糖促進(jìn)干細(xì)胞成牙本質(zhì)分化的機(jī)制尚不清楚。

3.2 殼聚糖誘導(dǎo)干細(xì)胞血管內(nèi)皮分化

牙髓活力依賴于血運(yùn)重建,殼聚糖誘導(dǎo)干細(xì)胞向血管內(nèi)皮細(xì)胞分化、促進(jìn)新血管形成的能力為牙髓血運(yùn)重建提供理論基礎(chǔ)。殼聚糖可促進(jìn)不同來源的MSCs血管內(nèi)皮分化。羅鳴驁等[22]為研究殼聚糖對(duì)脂肪干細(xì)胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)存活與分化的影響,將ADSCs加載到殼聚糖支架注射到小鼠背部皮下,殼聚糖促進(jìn)了ADSCs血管內(nèi)皮分化和血管的形成,可能原因是支架提供的良好細(xì)胞生長(zhǎng)微環(huán)境促進(jìn)了這種分化。另一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)證明殼聚糖還可以增加人胎盤來源的間充質(zhì)干細(xì)胞血管內(nèi)皮分化標(biāo)志物VEGF的表達(dá),實(shí)現(xiàn)血管內(nèi)皮分化[23]。目前,殼聚糖促進(jìn)干細(xì)胞血管內(nèi)皮分化的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

3.3 殼聚糖誘導(dǎo)干細(xì)胞神經(jīng)分化

牙髓內(nèi)神經(jīng)可感受外界刺激,調(diào)節(jié)髓內(nèi)血管的收縮和舒張,維護(hù)牙髓的穩(wěn)態(tài)。殼聚糖促進(jìn)DPSCs神經(jīng)分化是實(shí)現(xiàn)新生牙髓神經(jīng)再支配的重要途徑。據(jù)報(bào)道,殼聚糖可能通過不同機(jī)制促進(jìn)DPSCs神經(jīng)分化。Zhang等[24]在探究殼聚糖對(duì)DPSCs神經(jīng)分化的影響時(shí),將殼聚糖支架與DPSCs在體外共同培養(yǎng),蛋白質(zhì)印跡分析和PCR檢測(cè)結(jié)果顯示殼聚糖組DPSCs的神經(jīng)細(xì)胞特異性標(biāo)志物CNPase、MAP-2和GFAP的表達(dá)較對(duì)照組顯著增高,證明殼聚糖具有誘導(dǎo)DPSCs神經(jīng)分化的能力,這種作用可能與殼聚糖激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)。Zheng等[25]在摸索體外DPSCs神經(jīng)分化的條件時(shí),合成多孔殼聚糖支架接種DPSCs后細(xì)胞中神經(jīng)分化標(biāo)志物表達(dá)比空白組增加,說明殼聚糖可促進(jìn)DPSCs的神經(jīng)分化,進(jìn)一步研究表明殼聚糖誘導(dǎo)DPSCs神經(jīng)源性可能與ERK信號(hào)通路的激活相關(guān)。

4 殼聚糖的促進(jìn)礦化作用

牙髓再生的內(nèi)容之一是牙本質(zhì)的新生,主要是成牙本質(zhì)細(xì)胞礦物質(zhì)沉積的過程。殼聚糖具有抑制硬組織脫礦和促進(jìn)礦化的性能,在微環(huán)境中可與H+結(jié)合提高溶液pH值,也能通過靜電作用吸附到牙齒表面形成保護(hù)層達(dá)到抑制脫礦的作用[26];殼聚糖含氮量高的特點(diǎn)使其可攜帶鈣和磷酸鹽等礦化離子,同時(shí)殼聚糖能穿透牙釉質(zhì)向病變深層輸送再礦化離子,促進(jìn)再礦化過程[27]。Subhi等[20]向硅酸鈣基水門汀內(nèi)添加殼聚糖后與SHEDs共同培養(yǎng),隨著殼聚糖濃度的升高和孵育時(shí)間的延長(zhǎng),SHEDs細(xì)胞中鈣沉積量逐漸增加,證明了殼聚糖促進(jìn)礦化的能力。Zhang等[28]發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)CMC在人工齲齒影響牙本質(zhì)模型中可穩(wěn)定無定形磷酸鈣,促進(jìn)礦物在牙本質(zhì)I型膠原蛋白纖維內(nèi)部沿著膠原纖維長(zhǎng)軸定向排列,無CMC組則形成纖維外礦化,說明殼聚糖可誘導(dǎo)牙本質(zhì)仿生礦化,相較于無序礦化具有更優(yōu)異的生物學(xué)和機(jī)械力學(xué)性能。另一項(xiàng)研究中發(fā)現(xiàn)[29],CMC不僅能夠誘導(dǎo)脫礦牙本質(zhì)仿生礦化,還能提高人工牙本質(zhì)齲損的粘接性能。

5 殼聚支架在牙髓再生領(lǐng)域應(yīng)用現(xiàn)狀

目前的研究表明,能夠攜帶干細(xì)胞并輸送生長(zhǎng)因子的可生物降解的3D植入式或可注射支架是牙髓再生的最合適方法,殼聚糖基復(fù)合支架應(yīng)用于牙髓再生表現(xiàn)出不錯(cuò)的效果。Bordini等[30]將殼聚糖與氫氧化鈣和β甘油磷酸鹽(βGP)復(fù)合制成多孔殼聚糖支架,具有良好的圓形孔隙網(wǎng)絡(luò),這種支架促進(jìn)牙髓細(xì)胞增殖,對(duì)遠(yuǎn)處牙髓細(xì)胞具有趨化作用,即使在沒有成骨培養(yǎng)基補(bǔ)充的情況下也能誘導(dǎo)牙母細(xì)胞成牙分化,同時(shí)刺激礦化基質(zhì)沉積,促進(jìn)牙本質(zhì)形成。Moreira等[31]去除大鼠第一磨牙根管內(nèi)側(cè)牙髓建立體內(nèi)原位牙髓模型,向根管內(nèi)注射血凝塊-殼聚糖水凝膠混合支架并使用5 J/cm2的能量密度進(jìn)行光生物療法(PBMT),在4周時(shí)觀察到根管內(nèi)發(fā)育良好的牙髓樣組織,新生結(jié)締組織內(nèi)含年輕的血管、沿根管壁存在新生牙本質(zhì),且根管內(nèi)未檢測(cè)到炎癥、未見根管內(nèi)部/外部吸收;其中一個(gè)樣本甚至觀察到一層與牙本質(zhì)壁緊密接觸、胞質(zhì)延伸穿透牙本質(zhì)小管的細(xì)胞,這層細(xì)胞成牙本質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物HSP-25陽(yáng)性表達(dá),表明血凝塊-殼聚糖水凝膠混合支架在PBMT存在情況下可能形成與天然結(jié)構(gòu)相似的牙髓-牙本質(zhì)復(fù)合體。Ei等[32]將攜帶自體DPSCs和生長(zhǎng)因子的殼聚糖水凝膠支架移植到犬根尖周炎的年輕恒切牙中,根管內(nèi)出現(xiàn)類似牙髓組織的纖維組織,內(nèi)含多條大小血管,還出現(xiàn)牙本質(zhì)樣組織,沿著根管壁的牙本質(zhì)具有牙本質(zhì)小管樣結(jié)構(gòu),證明攜帶干細(xì)胞并輸送生長(zhǎng)因子的殼聚糖水凝膠支架在牙髓再生領(lǐng)域具有巨大的潛力。

6 展望

殼聚糖作為天然高分子材料,價(jià)格低廉、性能優(yōu)異,不僅可作為支架材料發(fā)揮抗菌作用為牙髓再生提供無菌環(huán)境,誘導(dǎo)干細(xì)胞分化、促進(jìn)礦化保證牙髓組織工程中不同結(jié)構(gòu)組織的形成,同時(shí)也可單獨(dú)或與其他材料復(fù)合作為物質(zhì)載體攜帶生物活性分子,協(xié)同促進(jìn)牙髓組織再生。然而,目前關(guān)于殼聚糖促進(jìn)牙髓再生的研究尚有不足：(1)殼聚糖基材料促進(jìn)形成的新生牙髓的組織學(xué)結(jié)構(gòu)及生物學(xué)功能未與天然牙髓進(jìn)行對(duì)比,無法得知再生的牙髓樣組織與天然牙髓的差異;(2)目前研究停留在實(shí)驗(yàn)室水平,臨床療效尚未可知;(3)殼聚糖在牙髓再生中發(fā)揮作用的機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。