N1-苯基-1,2,3-三氮唑類熊果酸衍生物的設(shè)計與合成

魏艷潔，趙憲東，王歡歡，賈宇夢，隋麗麗，張大軍，欒天，王進

（沈陽醫(yī)學院 藥學院，遼寧 沈陽 110034）

熊果酸（Ursolic Acid，UA）是一種天然的烏蘇烷型五環(huán)三萜類化合物。近幾年熊果酸的研究在國內(nèi)外掀起熱潮，研究發(fā)現(xiàn)其具有廣泛的生物學活性，如誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡、抗炎癥反應(yīng)、抗糖尿病、抗心血管疾病、抗病原微生物及抗神經(jīng)系統(tǒng)疾病等[1]。遺憾的是，熊果酸結(jié)構(gòu)本身存在水溶性差、生物利用度較低等缺點，因此在臨床上的應(yīng)用受到了非常大的限制。為了克服上述缺點，學者們對熊果酸進行結(jié)構(gòu)修飾和改造，從而得到一系列熊果酸衍生物[2-3]。其中，Bilal 等[4]將熊果酸C3 位羥基氧化成酮，得到3-羰基熊果酸（圖1 黑色部分），接著將C2 位進行羥醛縮合，引入不同的取代苯甲醛，將所有化合物與3-羰基熊果酸通過噻唑藍（MTT）法針對人肺癌細胞（A-549），乳腺癌細胞（MCF-7），結(jié)腸癌細胞（HCT-116），血癌細胞（THP-1）四種腫瘤細胞以及人正常的上皮細胞（FR-2）進行了抗增殖活性的測試。結(jié)果表明，絕大部分化合物針對上述四種腫瘤細胞的IC50值均低于熊果酸，但對FR-2 的IC50值高于熊果酸。其中，化合物1 活性最優(yōu)，其對A-549，MCF-7，HCT-116，THP-1 的IC50值分別為0.55、0.10、5.5、0.90 μmol/ L。1,2,3-三氮唑因其經(jīng)典的合成方法被廣泛應(yīng)用于有機合成與藥物研發(fā)中[5]。報道顯示在多種天然產(chǎn)物單體的化學結(jié)構(gòu)中連接1,2,3-三氮唑片段其原有的生物學活性明顯提高[6-7]。因此，以熊果酸為結(jié)構(gòu)母體，將其氧化為3-羰基熊果酸，在羰基的鄰位引入不同取代的N1-苯基-1,2,3-三氮唑，該片段與化合物1 所拼接的苯基相比，因具有較多的氫鍵受體而更易與某些靶蛋白相結(jié)合，因此通常會具有更為良好的生物活性。本實驗通過5 步反應(yīng)合成4個新化合物，合成工藝成熟，收率理想，1,2,3-三氮唑的合成方法采用經(jīng)典的Click 環(huán)合法，操作簡單。本實驗合成路線可為相關(guān)領(lǐng)域的合成研究提供參考，并為開發(fā)三唑類熊果酸衍生物提供借鑒。

圖1 化合物1 的化學結(jié)構(gòu)與生物活性Fig.1 Chemical structure and biological activity of compound 1

1 實驗方法

1.1 試劑與儀器

試劑：疊氮化鈉、丙炔醇、抗壞血酸鈉、熊果酸，阿拉丁試劑、鹽酸、亞硝酸鈉、氯化鈉﹑五水硫酸銅、二氧化錳、三氧化鉻、硫酸、氫氧化鉀、乙醇、丙酮、異丙醇、石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、叔丁醇，國藥集團化學試劑有限公司。所有試劑均為分析純。

儀器：DF-II 型集熱式磁力加熱攪拌器，BSA124S 型電子天平，RE-52 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，SHZ-D型循環(huán)水式真空泵，WFH-203B 型三用紫外分析儀，Axima CFR plus 型飛行時間質(zhì)譜儀，Bruker ARX-300核磁共振波譜儀。

1.2 目標化合物的合成

目標化合物的合成路線如圖2 所示。

圖2 目標化合物的合成路線Fig.2 The synthetic route of the target compounds

1.2.1 中間體A1-A4 的合成

將不同取代的苯胺（10 mmol）溶于10 mL 10%的鹽酸中，冰浴下滴加亞硝酸鈉溶液（1.035 0 g 的NaNO2溶于25 mL 的水中），滴畢，反應(yīng)0.5 h 后，滴加疊氮化鈉溶液（2.600 0 g 的NaN3溶于50 mL 的水中），3 h 后TLC 監(jiān)測反應(yīng)完全（展開劑為石油醚∶乙酸乙酯=15∶1，生成物Rf=0.8）；反應(yīng)液用乙酸乙酯萃?。?0 mL× 3），合并有機相，飽和氯化鈉溶液洗滌（10 mL × 3）后加入無水硫酸鈉干燥，過濾，濾液減壓蒸干，得淡黃色油狀物，收率95%～ 98%，無需純化直接進行下一步反應(yīng)。

1.2.2 中間體B1-B4 的合成

不同取代的中間體A1-A4（9.5 mmol）與0.560 0 g 的丙炔醇溶于35 mL 的叔丁醇中，0.198 0 g的抗壞血酸鈉與0.125 0 g 的五水硫酸銅溶于35 mL的水中，合并上述叔丁醇與水溶液，室溫下攪拌過夜；反應(yīng)液用乙酸乙酯萃?。?0 mL× 3），合并有機相，飽和氯化鈉溶液洗滌（10 mL × 3）后加入無水硫酸鈉干燥，過濾，濾液減壓蒸干，得白色或淡黃色固體，收率89%～ 92%，無需純化直接進行下一步反應(yīng)。

1.2.3 中間體C1-C4 的合成

不同取代的中間體B1-B4（8 mmol）溶于50 mL的丙酮中，加入10.000 0 g 的二氧化錳后回流反應(yīng)2 h 后TLC 監(jiān)測反應(yīng)完全；抽濾，濾液減壓蒸干后經(jīng)硅膠色譜純化（石油醚-乙酸乙酯=5∶1）得白色固體，收率80%～ 82%。

1.2.4 3-羰基熊果酸的合成

熊果酸（1.0 mmol）溶于60 mL 的丙酮中，冰浴下緩慢滴加瓊斯試劑，直至反應(yīng)液呈現(xiàn)黃紅色并在10 min 內(nèi)不褪色，繼續(xù)反應(yīng)1 h，TLC 監(jiān)測反應(yīng)完全，滴加1 mL 的異丙醇淬滅瓊斯試劑，待反應(yīng)液呈綠色后抽濾，濾液減壓蒸干，加入50 mL 的乙酸乙酯，飽和氯化鈉溶液洗滌（10 mL× 3）后加入無水硫酸鈉干燥，過濾，濾液減壓蒸干，得白色固體0.408 6 g，收率90%。

1.2.5 終產(chǎn)物（D1-D4）的合成

0.090 8 g 的3-羰基熊果酸與中間體C1-C4（物料比為1∶1.1）溶于15 mL 的無水乙醇中，加入0.016 8 g 的氫氧化鉀，室溫下反應(yīng)4 h 后TLC 監(jiān)測反應(yīng)完全，減壓蒸干溶劑，加入30 mL 的水，用稀鹽酸調(diào)節(jié)pH 至酸性，用乙酸乙酯萃?。?0 mL× 3），合并有機相，飽和氯化鈉溶液洗滌（10 mL× 3）后加入無水硫酸鈉干燥，過濾，濾液減壓蒸干后經(jīng)硅膠色譜純化（石油醚-乙酸乙酯=5∶1）得白色固體收率76%～ 79%。

2 結(jié)果與討論

2.1 目標化合物的合成

本實驗以不同取代的苯胺為起始物料，第一步為“一鍋法”，首先在酸性條件下被亞硝酸鈉還原為重氮苯，再被疊氮化鈉疊氮化生成不同的疊氮苯，本反應(yīng)應(yīng)嚴格控制疊氮化鈉溶液的滴速，防止過度放熱。第二步以中間體A 為原料，通過Click 反應(yīng)制得中間體B，將二價銅離子被抗壞血酸鈉還原為一價銅離子后催化環(huán)合反應(yīng)；本反應(yīng)探索了反應(yīng)溶劑對反應(yīng)的影響，發(fā)現(xiàn)使用叔丁醇﹑四氫呋喃這類與水互溶的有機試劑或二氯甲烷等與水分層的有機試劑均可發(fā)生該反應(yīng)，本反應(yīng)副產(chǎn)物少，目標產(chǎn)物易于純化。第三步使用二氧化錳作為弱氧化試劑將不同的醇（中間體B1-B4）氧化為醛，本反應(yīng)在后處理中應(yīng)在抽濾濾紙上加適宜量的硅藻土，防止二氧化錳顆粒過細透過濾紙。最后將不同取代的醛（中間體C1-C4）在堿性條件下與3-羰基熊果酸通過克萊森-施密特縮合反應(yīng)得終產(chǎn)物，因3-羰基熊果酸與終產(chǎn)物極性較接近，與終產(chǎn)物較難通過色譜法分離，因此反應(yīng)過程中使中間體C 稍過量，過量的中間體C 可通過硅膠柱層析與終產(chǎn)物進行分離，產(chǎn)品易于純化。

2.2 目標化合物的結(jié)構(gòu)表征

目標化合物的質(zhì)譜及核磁共振波譜數(shù)據(jù)如表1及圖3～ 5 所示，以D1 為例，在核磁氫譜數(shù)據(jù)中，化合物的化學位移8.05 的單重峰為1,2,3-三氮唑C5 位上的氫原子峰，當苯環(huán)上引入硝基等強吸電子效應(yīng)基團時，其化學位移相對較大（如D2 為8.18）。結(jié)合耦合常數(shù)可以確定，化學位移7.74 的雙重峰為與三唑相連苯環(huán)鄰位上的兩個氫原子峰，7.56 的雙重峰為與三唑相連苯環(huán)間位上的兩個氫原子峰，化學位移7.50 的單重峰為與1,2,3-三氮唑C4 位相連碳原子上的氫原子峰，化學位移5.35 的單重峰為熊果酸母體C12 位雙鍵上的氫原子峰，其余均為熊果酸環(huán)上或角甲基的氫原子峰；結(jié)合核磁共振碳譜的碳原子總數(shù)以及質(zhì)譜的分子量測試結(jié)果表明目標化合物的結(jié)構(gòu)均正確。

圖3 化合物D1 的核磁共振氫譜圖Fig.3 1H-NMR spectra of compound D1

圖4 化合物D1 的核磁共振碳譜圖Fig.4 13C-NMR spectra of compound D1

圖5 化合物D1 的質(zhì)譜圖Fig.5 Mass spectra of compound D1

3 小結(jié)

經(jīng)5 步反應(yīng)制得4 個未見文獻報道的新型熊果酸衍生物，總收率46%～ 53%。本實驗的研究內(nèi)容可為三唑類熊果酸衍生物的合成提供一定的參考。在后續(xù)的研究中可通過對該類化合物的生物學活性進行探究，為新藥的開發(fā)與研制提供有價值的借鑒。