顯微拉曼光譜儀在本科實(shí)驗(yàn)教學(xué)中的搭建及應(yīng)用

趙 浩，郭 鑫，吳忠云，徐金榮，楊 玲，鄭俊榮

（北京大學(xué)化學(xué)國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心化學(xué)與分子工程學(xué)院，北京 100871）

0 引 言

化學(xué)是一門以實(shí)驗(yàn)為基礎(chǔ)的學(xué)科，在本科實(shí)驗(yàn)教學(xué)過程中，除了傳授學(xué)生基礎(chǔ)知識(shí)、基礎(chǔ)原理和基本技能外，還需要鍛煉學(xué)生的科學(xué)思維和動(dòng)手能力，培養(yǎng)學(xué)生團(tuán)隊(duì)合作精神和勇于探索的創(chuàng)新精神，促進(jìn)學(xué)生能力和素質(zhì)的全面提升，培養(yǎng)創(chuàng)新型人才［1-3］。隨著自動(dòng)化、智能化的時(shí)代發(fā)展，現(xiàn)代儀器的精密度和一體化程度越來越高，科學(xué)研究也越來越依賴于各種高精尖的儀器設(shè)備。儀器的智能化、一體化給操作者在使用時(shí)帶來了極大的便利，大大提升了工作效率。但是本科實(shí)驗(yàn)教學(xué)中，儀器的高度集成化和智能化反而不利于教學(xué)的開展，一鍵式的儀器操作雖然能確保學(xué)生更快更精確的取得實(shí)驗(yàn)結(jié)果，但是學(xué)生對(duì)儀器的內(nèi)部構(gòu)造，工作原理完全不清楚，或者是仍然停留在書本的理論知識(shí)上，讓學(xué)生拿到一份實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)或者學(xué)會(huì)一臺(tái)儀器的操作，并不是實(shí)驗(yàn)教學(xué)目標(biāo)，需要教給學(xué)生的應(yīng)該是儀器的工作原理和構(gòu)造。為了讓學(xué)生更直觀地看到儀器的內(nèi)部構(gòu)造，了解儀器的工作原理，提高教學(xué)質(zhì)量，國(guó)內(nèi)許多高校在實(shí)驗(yàn)教學(xué)中通過使用自制儀器［4-5］、虛擬仿真實(shí)驗(yàn)［6-7］、MOOC［8］、線上線下結(jié)合［9］等形式來進(jìn)行更直觀、更適用、更高效的實(shí)驗(yàn)教學(xué)，并取得了良好的教學(xué)效果。相比虛擬仿真實(shí)驗(yàn)和MOOC而言，自制儀器不僅可以讓學(xué)生更深入地學(xué)習(xí)基礎(chǔ)知識(shí)和基本原理，還能有效地培養(yǎng)學(xué)生的動(dòng)手能力和實(shí)踐能力，引導(dǎo)學(xué)生的創(chuàng)新思維和創(chuàng)新意識(shí)［10-12］。本實(shí)驗(yàn)的自制儀器更是讓學(xué)生自己動(dòng)手搭建儀器設(shè)備裝置，通過團(tuán)隊(duì)分工合作，鍛煉團(tuán)隊(duì)合作意識(shí)，培養(yǎng)學(xué)生自信心，讓學(xué)生不再對(duì)“大型”儀器陌生，知其然且知其所以然，為學(xué)生之后繼續(xù)從事科研工作打下必要的基礎(chǔ)。

拉曼光譜作為一種無損檢測(cè)手段，擁有分析速度快，重復(fù)性好，樣品用量少且無需前處理等優(yōu)點(diǎn)，在化學(xué)結(jié)構(gòu)鑒定，材料表征，生物醫(yī)學(xué)分析，文物鑒定和保護(hù)，寶石鑒別，食品安全等領(lǐng)域都有廣泛應(yīng)用［13-19］。但是，目前國(guó)內(nèi)使用的顯微拉曼光譜儀基本都是依賴國(guó)外進(jìn)口，儀器價(jià)格昂貴，難以面向本科生開展教學(xué)實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)搭建了一款用于本科生實(shí)驗(yàn)教學(xué)的可拆解顯微拉曼光譜儀，儀器可供學(xué)生重復(fù)拆裝使用，組裝的儀器具有較高的靈敏度和精密度，可以滿足教學(xué)實(shí)驗(yàn)測(cè)試要求，相比商用儀器，不僅能夠發(fā)揮更好的教學(xué)效果，而且極大地降低了成本。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/h3>

（1）學(xué)習(xí)搭建顯微拉曼光譜儀；

（2）掌握拉曼光譜的相關(guān)知識(shí)，理解顯微拉曼光譜儀的工作原理和構(gòu)造；

（3）學(xué)習(xí)如何使用顯微拉曼光譜儀進(jìn)行樣品測(cè)試，并進(jìn)行譜圖分析；

（4）培養(yǎng)學(xué)生的創(chuàng)新能力，動(dòng)手能力，團(tuán)隊(duì)合作能力和自信心。

1.2 實(shí)驗(yàn)原理

1928 年，Raman 等［20-21］經(jīng)過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，光通過透明介質(zhì)時(shí)，在散射光譜中，部分光的頻率發(fā)生了變化，這種現(xiàn)象被稱為拉曼散射。1960 年，激光器的出現(xiàn)為拉曼光譜儀提供了理想的光源，拉曼光譜發(fā)展進(jìn)入新的時(shí)期，在納米材料、有機(jī)材料和醫(yī)藥等各方面都有應(yīng)用。拉曼光譜儀是測(cè)量拉曼光譜的實(shí)驗(yàn)裝置，通常由激發(fā)光源、樣品光路、分光光路、檢測(cè)器和控制系統(tǒng)5部分組成［22-23］。

根據(jù)拉曼光譜儀構(gòu)造原理，筆者設(shè)計(jì)了如圖1 所示的顯微拉曼光譜儀光路。學(xué)生通過實(shí)驗(yàn)室提供的激光光源、顯微鏡、光學(xué)鏡片、光學(xué)鏡架和檢測(cè)器等部件，依照?qǐng)D1 所示光路圖搭建顯微拉曼光譜儀，儀器搭建完成之后使用無水乙醇和環(huán)己烷作為標(biāo)準(zhǔn)樣進(jìn)行儀器調(diào)試，并將信號(hào)檢測(cè)器的像素信號(hào)標(biāo)定為拉曼位移信號(hào)。最后，利用搭建的顯微拉曼光譜儀對(duì)無水乙醇、環(huán)己烷、四氯化碳和單層硫化鉬等樣品進(jìn)行了測(cè)試。

圖1 顯微拉曼光譜儀光路示意圖（A為樣品光路，B為分光光路，C為檢測(cè)光路）

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

實(shí)驗(yàn)儀器：金相顯微鏡（BH200M），激光光源（中心波長(zhǎng)532.3 nm，能量0～300 mW可調(diào)），狹縫，光學(xué)面包板，二向色鏡，濾光片，光柵，平面反射鏡，凹面鏡（f＝150 mm），平凸透鏡（f＝120 mm），電荷耦合陣列檢測(cè)器（CMOS，北京青木子科技發(fā)展有限公司），光學(xué)鏡架。

實(shí)驗(yàn)試劑：無水乙醇（分析純），四氯化碳（分析純），環(huán)己烷（分析純），單層硫化鉬。

1.4 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

1.4.1 搭建顯微拉曼光譜儀

學(xué)生根據(jù)圖1 所示的光路示意圖搭建儀器，從激光器開始將光學(xué)元件沿著光路的方向進(jìn)行搭建，在儀器搭建過程中要注意保持整個(gè)光路在同一平面高度，以及整個(gè)光路的可逆性，確保光路的準(zhǔn)直。圖2 為搭建好的顯微拉曼光譜儀實(shí)物圖。

圖2 顯微拉曼光譜實(shí)物圖（A為樣品光路，B為分光光路，C為檢測(cè)光路）

完成儀器搭建之后，通過測(cè)試無水乙醇的拉曼信號(hào)對(duì)儀器進(jìn)行調(diào)試，包括調(diào)節(jié)狹縫寬度，樣品與物鏡之間距離，凹面鏡與光柵之間角度和距離，凹面鏡與檢測(cè)器之間角度和距離等多方面因素，直到得到標(biāo)準(zhǔn)的乙醇拉曼譜圖。

1.4.2 拉曼位移的標(biāo)定

本實(shí)驗(yàn)所使用的檢測(cè)器為電荷耦合陣列檢測(cè)器（CMOS），其輸出的初始信號(hào)為“像素-拉曼強(qiáng)度”，所以需要根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)譜圖將像素按照對(duì)應(yīng)的波數(shù)進(jìn)行擬合標(biāo)定，將“像素-拉曼強(qiáng)度”轉(zhuǎn)變成“拉曼位移-拉曼強(qiáng)度”，擬合過程可以通過Origin軟件來實(shí)現(xiàn)。

1.4.3 儀器性能分析

根據(jù)無水乙醇和環(huán)己烷測(cè)得的拉曼信號(hào)，從儀器有效測(cè)量范圍、信噪比和分辨率3 方面對(duì)儀器的基礎(chǔ)性能進(jìn)行分析。

1.4.4 樣品測(cè)試

用調(diào)試好的儀器進(jìn)行樣品測(cè)試，分別選取具有代表性的四氯化碳的振動(dòng)拉曼光譜和單層硫化鉬來進(jìn)行測(cè)試。

2 結(jié)果分析

2.1 拉曼位移的標(biāo)定

光柵的色散率可以通過下式計(jì)算：

式中：Q為色散距離；λ 為波長(zhǎng)；n為光譜級(jí)數(shù)；d為光柵常數(shù)。當(dāng)Q較小且變化不大時(shí)，可以認(rèn)為cosQ＝1，此時(shí)，光柵的角色散率只取決于d及n，可以認(rèn)為是常數(shù)，不隨波長(zhǎng)而變，這樣的光譜在長(zhǎng)波及短波的各波段波長(zhǎng)間隔是一樣的，稱為“均排光譜”。即在一定范圍內(nèi)，波長(zhǎng)的變化呈現(xiàn)線性關(guān)系，且其變化率為常數(shù)。

實(shí)驗(yàn)中以無水乙醇和環(huán)已烷為標(biāo)準(zhǔn)物，通過無水乙醇和環(huán)已烷的特征峰對(duì)像素和波長(zhǎng)進(jìn)行標(biāo)定，特征峰波長(zhǎng)，像素及拉曼位移對(duì)應(yīng)關(guān)系如表1 所示。其中，拉曼位移可由下式計(jì)算：

表1 無水乙醇和環(huán)己烷特征峰的拉曼位移、波長(zhǎng)及對(duì)應(yīng)的像素

通過Origin作圖軟件將實(shí)驗(yàn)得到的原始數(shù)據(jù)中對(duì)應(yīng)表1 中這15 個(gè)特征峰的像素值（p）進(jìn)行擬合，擬合結(jié)果如圖3 所示。擬合結(jié)果為：λ ＝0.030 47p＋534.025，r2＝0.999 98。

圖3 “像素-波長(zhǎng)”擬合結(jié)果

根據(jù)擬合結(jié)果進(jìn)行轉(zhuǎn)換，可將“拉曼強(qiáng)度-像素”轉(zhuǎn)換為“拉曼強(qiáng)度-拉曼位移”。圖4 中（a）圖和（c）圖分別為無水乙醇和環(huán)己烷通過CMOS獲得的像素點(diǎn)與拉曼強(qiáng)度之間的關(guān)系曲線；（b）圖和（d）圖分別為無水乙醇和環(huán)己烷對(duì)應(yīng)的“拉曼位移-拉曼強(qiáng)度”譜圖。

圖4 無水乙醇和環(huán)己烷的拉曼光譜圖

2.2 儀器性能分析

從儀器測(cè)量范圍、分辨率和信噪比3 方面對(duì)儀器的性能進(jìn)行初步分析。根據(jù)2.1 中拉曼位移標(biāo)定的結(jié)果，可以計(jì)算出儀器可測(cè)波數(shù)范圍為72～3 991 cm－1，對(duì)應(yīng)的波長(zhǎng)范圍為534～675 nm。以乙醇的最強(qiáng)吸收峰為例，在圖4（b）中可見，無水乙醇最大峰強(qiáng)的相對(duì)強(qiáng)度約在94，在沒有信號(hào)峰地方的噪音相對(duì)強(qiáng)度在3附近，初步估算儀器的信噪比可以達(dá)到31。圖5 所示是儀器測(cè)得的環(huán)已烷在2 800～3 050 cm－1波數(shù)段的拉曼信號(hào)，從圖中可見，儀器可以清晰地區(qū)分出2 938和2 923 cm－1的兩個(gè)尖峰，表明儀器的分辨率優(yōu)于15 cm－1。

圖5 環(huán)己烷在2 800～3 050 cm －1波數(shù)段的拉曼光譜信號(hào)

2.3 樣品測(cè)試

拉曼光譜和紅外吸收光譜都涉及分子的振動(dòng)和轉(zhuǎn)動(dòng)，在光譜學(xué)分析中可以相互補(bǔ)充，四氯化碳是一個(gè)典型的例子，其分子為四面體結(jié)構(gòu)，根據(jù)其分子對(duì)稱性可以產(chǎn)生多種振動(dòng)模式，其中在219、316 cm－1處的C-Cl對(duì)稱彎曲振動(dòng)和463 cm－1處的C-Cl 對(duì)稱伸縮振動(dòng)在拉曼光譜中有明顯體現(xiàn)，而767 和790 cm－1處的C-Cl反對(duì)稱伸縮在拉曼光譜中則不是很明顯，圖6 為用搭建的顯微拉曼光譜儀測(cè)得的四氯化碳的拉曼光譜。

圖6 四氯化碳的拉曼光譜圖

顯微拉曼光譜儀具有很好的空間分辨能力，適用于微觀尺寸下樣品的拉曼分析。圖7 所示是通過搭建的顯微拉曼光譜儀對(duì)單層硫化鉬進(jìn)行測(cè)試，獲得的單層硫化鉬和SiO2／Si 基底的拉曼信號(hào)，可見在400 cm－1附近有2 個(gè)明顯的硫化鉬信號(hào)峰。

圖7 二硫化鉬的拉曼光譜圖

3 教學(xué)應(yīng)用

我?；瘜W(xué)與分子工程學(xué)院已經(jīng)在中級(jí)物理化學(xué)實(shí)驗(yàn)課上連續(xù)5 年開展“拉曼光譜儀的搭建及應(yīng)用”實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目，本實(shí)驗(yàn)為該實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目的擴(kuò)展內(nèi)容，供有興趣的學(xué)生在原有拉曼光譜儀的基礎(chǔ)上增加顯微裝置，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)單層硫化鉬或石墨烯等樣品的測(cè)量。實(shí)驗(yàn)中，學(xué)生除了進(jìn)行儀器搭建以外，同時(shí)還需要進(jìn)行數(shù)據(jù)采集編程和遠(yuǎn)程控制程序編寫，可以使用C語言，Python或者Labview等軟件。作為一個(gè)項(xiàng)目式實(shí)驗(yàn)，該實(shí)驗(yàn)在教學(xué)過程中采用小組分工合作的方式進(jìn)行，一般2或3 個(gè)學(xué)生為一個(gè)團(tuán)隊(duì)共同完成實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以口頭匯報(bào)的形式展現(xiàn)。學(xué)生在儀器搭建以及應(yīng)用測(cè)試的過程中有充分的創(chuàng)新空間，儀器搭建過程可以對(duì)光路、操作界面進(jìn)行改進(jìn)，應(yīng)用測(cè)試部分可以選擇自己感興趣的樣品，學(xué)生近些年有測(cè)定水果農(nóng)藥殘留，日常商品成分等。

4 結(jié) 語

根據(jù)本科生實(shí)驗(yàn)教學(xué)的需求，設(shè)計(jì)了一款可重復(fù)搭建拆解的顯微拉曼光譜儀，從得到的無水乙醇、環(huán)己烷、四氯化碳和二硫化鉬的拉曼譜圖可以看出，儀器具有良好的性能，分辨率和信噪比，完全能夠滿足本科教學(xué)和科研的使用。

在設(shè)計(jì)組裝實(shí)驗(yàn)儀器的過程中，學(xué)生們通過摸索各個(gè)部件的功能，對(duì)儀器構(gòu)造和原理有了深刻的認(rèn)識(shí)和理解，不僅達(dá)到了學(xué)習(xí)拉曼光譜相關(guān)知識(shí)的目的，而且打開了“現(xiàn)代化”儀器的神秘面紗，讓學(xué)生敢于上手，懂得調(diào)試儀器性能，樹立自信心，有效地培養(yǎng)了學(xué)生的動(dòng)手能力和創(chuàng)新精神。良好的儀器改造能力將在學(xué)生日后的科研過程中獲益無窮。