微球新制劑在藥學(xué)綜合實(shí)驗(yàn)教學(xué)中的設(shè)計(jì)與應(yīng)用

邱立朋，胡 笳，方文杰，陳敬華

（江南大學(xué)生命科學(xué)與健康工程學(xué)院，江蘇無錫 214122）

0 引 言

在醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)高速發(fā)展和利好政策的背景下，我國正在向藥物研發(fā)強(qiáng)國轉(zhuǎn)型，因此，創(chuàng)新型藥學(xué)應(yīng)用人才的培養(yǎng)是促進(jìn)我國提高醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)競(jìng)爭(zhēng)力的關(guān)鍵［1-2］。實(shí)驗(yàn)教學(xué)是藥學(xué)專業(yè)人才培養(yǎng)中的重要實(shí)踐環(huán)節(jié)，是培養(yǎng)學(xué)生綜合知識(shí)應(yīng)用、科學(xué)性思路、創(chuàng)新精神和實(shí)踐動(dòng)手能力的重要手段［3］。綜合型藥學(xué)實(shí)驗(yàn)是在掌握專業(yè)理論知識(shí)和基本實(shí)驗(yàn)操作后進(jìn)行的多個(gè)知識(shí)點(diǎn)整合的專業(yè)實(shí)驗(yàn)教學(xué)，其內(nèi)容涉及多門課程知識(shí)或者藥物研發(fā)和科學(xué)研究中的綜合知識(shí)，突出對(duì)專業(yè)知識(shí)的靈活運(yùn)用和行業(yè)發(fā)展的整體把握。目前，越來越多高校重視對(duì)藥學(xué)綜合型實(shí)驗(yàn)教學(xué)的不斷改革與探索，不斷提高學(xué)生對(duì)專業(yè)的學(xué)習(xí)興趣，增強(qiáng)學(xué)生動(dòng)手實(shí)踐能力和創(chuàng)新研究思維，為醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)培養(yǎng)高素質(zhì)創(chuàng)新性藥學(xué)專業(yè)人才而努力［4-5］。

微球是目前備受關(guān)注的藥物新劑型，它是將藥物通過物理或者化學(xué)方法溶解、分散或吸附在高分子載體材料中形成的微米級(jí)球狀實(shí)體［6］。微球能夠保護(hù)藥物不被非特異性細(xì)胞和組織改變其生物分布或排出體內(nèi)，實(shí)現(xiàn)緩控釋放，降低全身血藥濃度，提高治療效果［7-9］。自2000 年注射用醋酸亮丙瑞林微球上市以來，微球制劑作為改良劑型的高端制劑代表，因獨(dú)特的技術(shù)與市場(chǎng)優(yōu)勢(shì)，受到醫(yī)藥企業(yè)的廣泛關(guān)注。阿霉素為蒽環(huán)類抗腫瘤藥物，是一種臨床常用的化療藥物，主要用于急性白血病、支氣管肺癌、肝癌等的治療。然而，它有著較大的心臟毒性等副作用，臨床需嚴(yán)格限制其使用劑量，以減少其引起的不良反應(yīng)［10］。因此，近年來藥學(xué)研究人員一直對(duì)阿霉素改良劑型進(jìn)行研究［11-13］。白蛋白因其良好生物相容性和載藥能力被廣泛研究［14-15］，例如上市藥物紫杉醇白蛋白納米粒。目前被進(jìn)行研究的白蛋白主要分為卵清蛋白、人血清白蛋白和牛血清白蛋白（Bovine Serum Albumin，BSA）。BSA廉價(jià)易得，可以通過物理或化學(xué)手段制備成安全性好和可生物降解的微球制劑，從而增加難溶性藥物的溶解度、降低藥物的毒副作用，實(shí)現(xiàn)抗腫瘤藥物的靶向遞送和緩控釋放［16-18］。

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法是科研過程中篩選和優(yōu)化處方工藝的常用手段，它可以科學(xué)合理地安排實(shí)驗(yàn)，提高實(shí)驗(yàn)效率，盡快得到最優(yōu)結(jié)果。因此，將科學(xué)前沿成果與本科實(shí)驗(yàn)教學(xué)相結(jié)合，把Plackett-Burman 和正交設(shè)計(jì)法用于藥學(xué)綜合創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)“阿霉素白蛋白微球的制備與表征”。通過引入不同因素的篩選優(yōu)化和分析，培養(yǎng)學(xué)生科學(xué)研究思路和綜合運(yùn)用知識(shí)的能力，利于他們把握行業(yè)研究現(xiàn)狀，開拓學(xué)習(xí)視野，激發(fā)科學(xué)研究的興趣。該實(shí)驗(yàn)操作較為簡單，具有較強(qiáng)的新穎性和綜合性，使學(xué)生體驗(yàn)新藥研發(fā)的思路，感受藥物新劑型的魅力，樹立為建設(shè)新藥強(qiáng)國的責(zé)任和信心。

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 材料與儀器

牛血清白蛋白（上海碧云天生物有限公司），鹽酸阿霉素（上海生工生物工程公司），司盤-80（上海阿達(dá)瑪斯試劑有限公司），吐溫-80（南京化學(xué)試劑股份有限公司），戊二醛、液體石蠟、無水乙醇、氯化鈉（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），其他所用試劑均為分析純。

紫外可見分光光度計(jì)（UV-2550，日本島津公司），旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RE-2000A，鄭州科泰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司），電子分析天平（PR，奧豪斯儀器有限公司），集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（DF-101S，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司），光學(xué)倒置顯微鏡（DMIL LED，徠卡儀器有限公司），超聲細(xì)胞破碎儀（JY92-IIN，寧波新芝生物科技有限公司）。

1.2 阿霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定

取空白牛血清白蛋白溶液、鹽酸阿霉素溶液在200～800 nm 波長范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，確定最大吸收波長。精密稱取鹽酸阿霉素25 mg，置于250 mL容量瓶中，配置0.1 g／L的標(biāo)準(zhǔn)液。然后，精密量取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL分別移入10 mL容量瓶中，配制成標(biāo)準(zhǔn)系列濃度，于最大吸收波長處測(cè)定吸光度，以吸光度（x）對(duì)濃度（y）進(jìn)行線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3 空白微球的制備

采用乳化-化學(xué)固化法制備白蛋白微球。精密稱取牛血清白蛋白溶于蒸餾水中，渦旋溶解，作為水相。液體石蠟為油相，司盤-80，吐溫-80 作為乳化劑。在適當(dāng)轉(zhuǎn)速攪拌下，將水相逐滴加入油相中，繼續(xù)乳化得到W／O型初乳后，再加入適量戊二醛溶液攪拌固化。無水乙醇清洗，20 ℃真空干燥即得空白微球。

在預(yù)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，選擇Plackett-Burman 設(shè)計(jì)法進(jìn)行處方優(yōu)化。選擇油水體積比、乳化劑的比例、交聯(lián)劑與白蛋白的比例、水相白蛋白濃度、乳化時(shí)間和固化時(shí)間6 個(gè)因素作為考察的對(duì)象，各因素及其水平如表1所示。

表1 Plackett-Burman設(shè)計(jì)因素與水平

1.4 阿霉素白蛋白微球的制備

精密稱取定量牛血清白蛋白和阿霉素避光溶解于蒸餾水中，渦旋溶解，作為水相，其余操作同空白微球制備方法。通過單因素初步確定影響因素后，采用四因素三水平L9（34）的設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)法，以微球的包封率和載藥率為指標(biāo)，優(yōu)化處方和工藝。正交設(shè)計(jì)因素及水平見表2。

表2 正交設(shè)計(jì)因素與水平

1.5 微球性質(zhì)表征

選擇光學(xué)顯微鏡輔助image J 進(jìn)行微球的形態(tài)和粒徑的評(píng)價(jià)。粒徑分布計(jì)算式為SPAN ＝（D90－D50）／D10，數(shù)值越小表示粒徑分布寬度越窄。紫外分光光度法測(cè)定微球中藥物的包封率和載藥量：稱取阿霉素白蛋白微球和空白微球10 mg，加入20 mL 無水乙醇超聲破碎，在480 nm波長處分別測(cè)定吸光度，計(jì)算包封率和載藥量。動(dòng)態(tài)透析法考察載阿霉素白蛋白微球的體外藥物釋放：選擇0.9%的氯化鈉溶液作為釋放介質(zhì)，稱取5 mg阿霉素原料藥和阿霉素白蛋白微球分散后，裝于透析袋中（截面相對(duì)分子質(zhì)量Mw＝3 500），置于裝有20 mL 釋放介質(zhì)的EP 管中，分別于不同時(shí)間點(diǎn)吸取2 mL透析液，并補(bǔ)充等量新鮮介質(zhì)。紫外分光光度法測(cè)定阿霉素含量并計(jì)算累計(jì)釋放度。

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線建立

通過紫外分光光度計(jì)掃描確定鹽酸阿霉素在480.0 nm處有最大吸收，而空白BSA微球溶液在此波長無干擾，故選定480.0 nm 為檢測(cè)波長。以吸光度（x）對(duì)濃度（y）進(jìn)行線性作圖，得到回歸方程為

表明藥物在0.01～0.06 g／L濃度線性范圍內(nèi)檢測(cè)線性關(guān)系良好。

2.2 空白微球制備及優(yōu)化

采用Plackett-Burman 設(shè)計(jì)法對(duì)空白微球的制備進(jìn)行篩選和優(yōu)化。以油水體積比（A）、乳化劑的比例（B）、交聯(lián)劑與白蛋白的比例（C）、水相白蛋白濃度（D）、乳化時(shí)間（E）、固化時(shí)間（F）為考察因素，微球粒徑和粒徑分布為響應(yīng)進(jìn)行篩選，根據(jù)Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)需求，G、H、J、K、L為未知的虛擬變量。實(shí)驗(yàn)安排和結(jié)果如表3 所示。

表3 Plackett-Burman設(shè)計(jì)的粒徑和粒徑分布結(jié)果

采用Design-Expert?軟件（Version-12.0.3.0）進(jìn)行試驗(yàn)結(jié)果分析，以多項(xiàng)式回歸模型描述結(jié)果和因素之間的關(guān)系：因素前系數(shù)絕對(duì)值大小可以反映該變量對(duì)于響應(yīng)的重要程度。結(jié)合表4 的F檢驗(yàn)可見，各因素對(duì)粒徑影響的顯著性順序依次為：C≈D＞A＞B，其中乳化劑比例顯著相關(guān)（P＜0.05），交聯(lián)劑與白蛋白比例、白蛋白濃度和油水體積比這3 個(gè)因素極顯著相關(guān)（P＜0.01）。各因素對(duì)粒徑分布影響的顯著性順序依次為：C＞D＞F＞B＞E，其中固化時(shí)間、乳化劑比例、乳化時(shí)間這3 個(gè)因素顯著相關(guān)（P＜0.05），交聯(lián)劑與白蛋白比例和白蛋白濃度極顯著相關(guān)（P＜0.01）。

表4 Plackett-Burman設(shè)計(jì)的因素顯著性方差分析結(jié)果

帕累托圖表現(xiàn)效應(yīng)對(duì)響應(yīng)的估計(jì)影響，每條柱的值代表效應(yīng)的估計(jì)絕對(duì)值除以t檢驗(yàn)的t值，其中跨過參考線的條值在統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著。如圖1 所示，因素C和因素D在全部的6 個(gè)因素中對(duì)粒徑的影響極顯著，且因素C對(duì)粒徑分布的影響也極顯著。各因素顯著性順序與F檢驗(yàn)結(jié)果一致，分析結(jié)果可靠。

圖1 Plackett-Burman設(shè)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)化效應(yīng)帕累托圖

為驗(yàn)證回歸模型可有效預(yù)測(cè)實(shí)際試驗(yàn)結(jié)果，表5和圖2 提供各次試驗(yàn)的預(yù)測(cè)值與實(shí)際值的比較。除粒徑分布試驗(yàn)3 外，試驗(yàn)和預(yù)測(cè)結(jié)果的偏差均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這可以認(rèn)為Plackett-Burman 設(shè)計(jì)回歸模型是基本符合事實(shí)的。

圖2 Plackett-Burman設(shè)計(jì)的響應(yīng)殘差圖

表5 Plackett-Burman設(shè)計(jì)的粒徑和粒徑分布實(shí)際值和預(yù)測(cè)值對(duì)比

2.3 阿霉素白蛋白微球處方及優(yōu)化

采用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)法對(duì)載藥微球的處方進(jìn)行篩選和優(yōu)化。以藥物與蛋白質(zhì)量比（σ）、蛋白濃度（β）、固化劑與蛋白比例（γ）和固化時(shí)間（δ）為考察因素，包封率和載藥量為篩選指標(biāo)進(jìn)行試驗(yàn)。結(jié)果如表6 所示。

表6 正交試驗(yàn)結(jié)果

對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行極差分析，極差R的大小反應(yīng)了各個(gè)影響因素對(duì)載藥率的影響程度。從結(jié)果中可以看出，各因素對(duì)微球載藥率的影響大小順序?yàn)椋害?＞γ ＞δ ＞β，即藥物與白蛋白質(zhì)量比對(duì)微球的載藥率影響最大，其次是固化劑與白蛋白之間的比例。由表6 可見，阿霉素白蛋白微球的最佳處方工藝為α1β3γ2δ1，即藥物與BSA質(zhì)量比為1∶15，BSA 濃度為8%，固化劑與BSA比例為1∶25，固化時(shí)間為1 h。按照該工藝制備阿霉素白蛋白微球，通過紫外分光光度計(jì)測(cè)定載藥量和包封率分別為16.74 ±0.42%和97.67 ±0.63%。

2.4 微球制劑學(xué)表征

通過顯微鏡觀察白蛋白微球和阿霉素白蛋白微球的形態(tài)和粒徑。由圖3 可見，優(yōu)化后最終制備的空白微球多為圓球形，表面光滑，粒徑較均勻，由Image J計(jì)算平均粒徑為（8.81 ±4.69）μm。阿霉素白蛋白微球?yàn)榧t色粉末，規(guī)則較為圓整，粒徑均勻，約在10～25 μm。

圖3 兩種微球的顯微圖像

阿霉素白蛋白微球的體外釋放如圖4 所示。微球制劑中藥物開始釋放速度較快，8 h 累積釋放量約30%，后來持續(xù)緩慢釋放，72 h 的釋放度達(dá)到（45.08±0.03）%。前期的突釋可能是吸附在微球表面的藥物引起的，而隨后釋放介質(zhì)溶液滲入到微球內(nèi)部，使得藥物緩慢溶出。此外，通過阿霉素原料藥的釋放曲線發(fā)現(xiàn)，游離藥物短時(shí)間內(nèi)釋放超過80%，這表明阿霉素白蛋白微球能夠明顯延遲藥物的釋放速度，具有較好的緩釋效果。

圖4 游離藥物和載藥微球體外釋放曲線

3 結(jié) 語

本實(shí)驗(yàn)教學(xué)將行業(yè)前沿研究、實(shí)驗(yàn)教學(xué)和專業(yè)人才培養(yǎng)結(jié)合起來，設(shè)計(jì)阿霉素白蛋白微球制備的綜合性開放實(shí)驗(yàn)，涵蓋制劑制備、藥物分析、基本性質(zhì)表征和實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法的應(yīng)用，使學(xué)生掌握新藥研發(fā)趨勢(shì)，綜合運(yùn)用專業(yè)知識(shí)，掌握基本科研思路。該實(shí)驗(yàn)通過Plackett-Burman和正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方法對(duì)空白微球和載藥微球的處方和工藝進(jìn)行篩選，然后對(duì)微球基本的粒徑形態(tài)、載藥量和體外釋放進(jìn)行考察。結(jié)果表明，優(yōu)化后微球具有較為均一的粒徑、良好的包封率和藥物緩釋作用。通過該實(shí)驗(yàn)，學(xué)生掌握制劑研發(fā)的基本流程，合理運(yùn)用實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)法，熟悉知識(shí)的交叉運(yùn)用，拓寬專業(yè)學(xué)習(xí)視野，提高實(shí)踐操作和綜合創(chuàng)新能力。