替代生物樣品的綠色樣品制備技術在法醫(yī)毒物學中的研究應用

趙玉霞,孫青芝

(貴州警察學院 刑技系,貴州 貴陽 550005)

法醫(yī)毒物學是在法醫(yī)學背景下針對生物樣品中藥物和其他外來化合物及其代謝物的檢測、鑒定的學科。法醫(yī)毒物學分析的生物樣品范圍廣泛,常規(guī)基質有血清、血漿、全血和尿液等,隨著檢測技術的發(fā)展,替代基質的分析樣品也逐漸出現(xiàn),典型的有唾液、頭發(fā)、指甲、汗液和腦脊液等,與血液樣本相比,唾液、頭發(fā)和汗液樣本更易收集。此外,頭發(fā)和指甲等角化基質,由于其具有長期穩(wěn)定性,目前也成為收集的對象[1]。法醫(yī)毒物目標分析物主要有非法/受控物質及其代謝物、藥物、酒精和毒物等。

樣品制備是法醫(yī)毒物分析中最關鍵的步驟,目的是消除樣品基質的干擾、預富集目標分析物,并減少基質效應,提高檢測靈敏度[2-3]。本課題組曾采用固相萃取——離子色譜法測定了血液中的草甘膦及其代謝產物氨甲基膦酸,該方法具有準確、靈敏的特點,可用于公安機關對血液中草甘膦及其代謝物氨甲基膦酸的分析[4]。樣品制備的方法有液-液萃取(Liquid liquid Extraction,LLE)、固相萃取(Solid phase extraction,SPE)和蛋白質沉淀。LLE和SPE通常要進行多步操作,需要大量高純度有機溶劑,這些程序不僅耗時,而且易導致分析誤差;蛋白質沉淀快速且簡單,缺點是清潔度有限,易損害儀器,從而縮短色譜柱的壽命或在液相色譜-質譜聯(lián)用(Liquid chromatography mass spectrometry,LC-MS)中產生高基質效應[5]。在過去幾十年,基于微萃取的新型樣品制備技術已在不同領域應用[6-10],與常規(guī)方法相比,微萃取方法成本低、不污染環(huán)境。目前,微萃取方法在法醫(yī)毒物學方面的應用仍然較少。

總結了過去10年法醫(yī)毒物學綠色樣品制備中用于分析替代生物樣品的最新進展,并闡述了法醫(yī)毒物學中用于樣品制備的微萃取和微型萃取技術。

1 替代生物樣品概述

目前,法醫(yī)毒物分析中常見的替代生物樣本分為兩大類,死前替代生物樣本:毛發(fā)、唾液或口腔液、指甲剪屑和指甲刮屑、汗液,以及母體生物樣本,如羊水和母乳;死后替代生物樣本:全指甲、玻璃體液、骨和骨髓、腦脊液等。

1.1 毛發(fā)

毛發(fā)樣品的分析能反映藥物成癮史或藥物毒性等信息[11]。在法醫(yī)毒物學分析中,藥物經血液循環(huán)進入毛發(fā),毛發(fā)以恒定速度生長,那么毒物在毛發(fā)中的沉積取決于藥物在血液中的濃度。研究表明,毛發(fā)中的毒物在特定條件下非常穩(wěn)定,因而毛發(fā)分析可以提供更大時間跨度的信息[12]。毛發(fā)分析的一個重要步驟是去污,提取的毛發(fā)樣品可能含有洗護用品、汗液或環(huán)境中的各種污染物,而這些污染物在分析過程中會產生干擾,進而影響結果。因此,需要將污染物從毛發(fā)表面除去,一般來說,用二氯甲烷或丙酮處理僅能去除毛發(fā)表面的污染物,而用甲醇會使毛發(fā)膨脹并將目標分析物溶于其中,從而改變藥物濃度,所以,最好使用有機溶劑和水溶液進行去污處理,必要時還應保存洗發(fā)溶液[13]。

1.2 指甲

異源化合物可儲存在指甲中,且隨著指甲的生長,藥物和酒精等異源化合物會進入指甲的角蛋白纖維并長時間停留[14]。與毛發(fā)相反,指甲不斷生長,不會發(fā)生因去除指甲而導致無法進行藥物檢測的情況。死前指甲樣本主要有兩種,即指甲剪屑和指甲刮屑,整個指甲都可用于法醫(yī)毒物分析。指甲剪屑是通過剪刀切割指甲過度懸垂進行收集的,而指甲刮屑則是用鋒利的刀片磨損上指甲層進行收集的[15]。手指甲可反應近3～5個月的身體信息,而腳指甲因生長速度較慢時間可延長至8～14個月。關于指甲刮屑,由于其表面積較大,分析時更容易受到汗液或環(huán)境污染,因此,指甲刮屑中的藥物濃度可能高于指甲本身。指甲樣本在儀器分析前也需去污,可通過水、肥皂溶液、緩沖溶液和有機溶劑進行。但這些方法尚不能確定是否能提取其中的藥物及對藥物的提取程度[16]。

1.3 唾液

唾液是從頭部和口腔的多個唾液腺分泌的液體,可通過咳痰或將吸收劑收集器放入口中進行收集的樣品,內含血液、淋巴、裂隙液、牙齦、臉頰細胞及各種腺體的混合唾液?；谌僖褐械难宄煞?唾液在法醫(yī)毒物分析中作為一種替代生物樣品而受到關注。首先,唾液和口腔液的收集簡單且無創(chuàng);其次,唾液為大量人群篩查提供了一種簡便有效的方法;第三,與富含蛋白質和脂肪成分的生物樣本相比,唾液樣本制備更容易;最后,由于唾液腺狀況和毒理學藥物監(jiān)測的指標,在法醫(yī)生物學中是一種重要的鑒別元素[17-18]。

1.4 其他替代生物樣本

其他替代生物樣本主要有汗液[19]、羊水、母乳和胎糞等。母乳能反應藥物用量、揭示母體與新生兒藥物暴露等信息。其缺點是母乳中含高脂成分,在分析過程中可能會產生干擾,且收集不便、樣本變異性大,會發(fā)生侵犯隱私等問題。羊水需要的樣品制備最少,干擾相對較低,但取樣過程中對人體有較高侵入性,可能伴隨并發(fā)癥[20]。新生兒體內的糞便可反應新生兒在妊娠期間的藥物暴露信息,與尿液相比,胎糞分析可將藥物使用的檢測窗口延長至妊娠的最后20周左右[21-22]。

此外,用于死后法醫(yī)毒物分析的替代基質還有:眼球玻璃體液[23-24]、膽汁[25-26]、胃內容物[27]、人體組織如肝臟和腎臟[28]、腦組織[29]、腦脊液[30]、牙齒及骨骼化遺骸[31-32]。

2 法醫(yī)毒物分析中替代生物樣品的綠色樣品制備技術

2.1 固相微萃取

SPME是一種外部涂有適當固定相的熔融石英纖維的樣品制備技術。涂層是由多個聚合物固定相組成的薄膜,通過吸收或吸附直接提取樣品表面的有機物[33]。目前常用的纖維涂層有聚二甲基硅氧烷(Polydimethylsiloxane ,PDMS)、聚二甲基矽氧烷/二苯(Poly-dimethylsiloxane/divenylbenzene,PDMS/DVB)、聚丙烯酸酯、碳氧烷/聚二甲基硅氧烷和穩(wěn)定柔性二苯/碳氧烷/聚二甲基硅烷[34]。常用的提取目標分析物的SPME技術有兩種:直接浸沒固相微萃取(Direct immersion solid phase microextraction,DI-SPME)和頂空固相微萃取(Headspace solid phase microextraction,HS-SPME)。DI-SPME是將纖維直接浸入樣品溶液中,HS-SPME是將纖維暴露在樣品上方的氣相中。SPME作為一種平衡技術,通過攪拌增加平衡速率,從而達到平衡所需的萃取時間,再將目標提取物通過加熱或添加適當有機溶劑的方式加入氣相色譜儀進行解吸[33]。

目前,SPME樣品制備技術因具有簡單、快速、溶劑干擾率低及靈敏度高等特點,已成功用于法醫(yī)毒物學中多種目標分析物的測定,如麻醉品、安非他命、可卡因、大麻素、美沙酮和其他阿片類物質、作為酒精過量標志物的脂肪酸乙酯、苯二氮卓等[35]。表1總結了近十年來用于法醫(yī)毒物分析中替代生物樣品制備SPME樣品制備技術。

表1 SPME在法醫(yī)毒物學替代生物樣品中的應用

Roessig等[36]開發(fā)了一種100 μm HS-SPME胎糞樣品制備技術,用于氣相色譜-質譜(Gas chromatography-mass spectrometry ,GC-MS)分析胎糞樣品中的脂肪酸乙酯前的樣品制備。由于脂肪酸乙酯作為胎糞和毛發(fā)樣品中的生物標志物,可用于評估宮內長期乙醇積累,進而推斷懷孕期間是否飲酒。因為,懷孕期間飲酒可能導致胎兒酒精譜系障礙,從而引起各種疾病癥狀。Silveira等[37]用同樣的方法從母乳中成功提取大麻素。

Narapanyakul等[39]在GC-MS測定前,已通過HS-SPME從玻璃體液中提取甲基苯丙胺,并與死后血液、尿液中的甲基苯丙胺含量進行比較。研究發(fā)現(xiàn),當常規(guī)樣品不可用或受到污染時,玻璃體液可作為血液和尿液樣品的重要替代品用于甲基苯丙胺的測定。

Inukai等[42]將在線管內SPME(On-line in-tube SPME,IT-SPME)方法用于提取毛發(fā)樣品中的尼古丁和可替寧。在該方法中,目標分析物從毛細管內壁上的Carboxen 1006固定相中提取并轉移至液相色譜柱,實現(xiàn)了HPLC-MS/MS提取、預濃縮和毛發(fā)樣品分析的自動化能力。IT-SPME最初是由Eisert和Pawliszyn[43]組裝的光纖SPME的自動替代品。管內SPME是一塊內表面涂有固定相的開放管狀熔融石英毛細管柱,在樣品制備過程中,樣品移向固定相,提取和濃縮目標分析物(通過吸附/吸收現(xiàn)象),再用合適的解吸溶劑洗脫。基于管內SPME的自動化能力,因此它能夠連續(xù)分析樣品。此外,管內SPME克服了傳統(tǒng)SPME中纖維脆性、低吸附能力和厚膜涂層泌水的缺點,IT-SPME中使用了大量材料和涂層。合適的固定相取決于目標分析物及樣品基質的性質。目前,常用的有壁涂層開管和多孔層開管GC柱。其中,多孔層開管GC柱因有較高的吸附表面和較厚的膜層,故而萃取效率較高。由于氫鍵、π-堆積和疏水相互作用,碳納米管是有機化合物的常用吸附劑。當使用碳納米管作為吸附劑時,分析物的吸附發(fā)生在其易于接近的壁上或間隙中[43]。

2.2 液相微萃取

LPME是常用的替代樣品制備技術,可使用少量溶劑從水溶液中提取目標分析物,它克服了液-液萃取中消耗大量有機溶劑的限制和固相萃取中樣品攜帶的限制。由于提取溶劑與樣品接觸方式不同,LPME主要分為單滴微萃取(Single-drop microextraction,SDME)、分散液-液微萃取(Dispersive liquid-liquid microextraction,DLLME)和中空纖維液相微萃取(Hollow fiber liquid-phase microextraction,HF-LPME),除此之外,研究人員還在不斷開發(fā)和評估新的技術。HF-LMPE中含有提取溶劑的一次性丙烯多孔中空纖維,該纖維可有效減慢有機溶劑在本體溶液中的溶解,優(yōu)點是成本低、樣品凈化效率高、可提供高富集因子[44]。HF-LPME有兩種主要類型:即兩相HF-LPME和三相HF-LFME。兩相HF-LPME通常用于提取低極性的目標分析物,而三相HF-LPME通常用于提取可電離化合物(酸和堿)[45]。DLLME是LPME的另一種形式,用注射器將合適的溶劑混合物(提取溶劑和分散劑溶劑)快速注射到樣品溶液中,由完全分散到水性樣品中的提取溶劑的細液滴形成渾濁溶液,離心將提取溶劑富集在提取容器的底部,再進行目標物的提取和分析,優(yōu)點是簡單、快速、有機溶劑用量少、富集系數(shù)高,且提取溶劑和樣品溶液之間表面積大,極大提高了提取效率[46]。表2總結了LPME在法醫(yī)毒物分析中替代生物樣品的LPME樣品制備技術。

Pantaleao等[47]將三相HF-LPME技術用于從人毛發(fā)中提取苯丙胺類興奮劑(即安非他命、甲基苯丙胺、芬普洛韋、3,4-亞甲基二氧甲基安非他胺及3,4-亞甲基二氧化亞丙胺)。具體操作:先在毛發(fā)樣品中添加二氯甲烷去污,并用氫氧化鈉對樣品水解,后將水解樣品置于Eppendorf管中并加入氯化鈉,在中空纖維孔中填充二己基醚,纖維內腔中填充15 μL 0.1 mol/L鹽酸(受體相),振蕩,萃取45 min,從纖維中除去受體相并在氮蒸汽下干燥,再加入三氟乙酸酐和乙酸乙酯的混合物進行衍生化。最后,樣品在氮氣蒸汽下再次干燥,并在GC-MS分析之前進行乙酸乙酯中重構。結果表明,此方法有機溶劑用量少,檢測限和定量限低。

Silveira等[48]將三項HF-LPME技術,用于GC-MS測定母乳中的可卡因及其衍生物。具體操作:先將母乳置于Eppendorf管中,加入氘化內標,pH值調至9.0,向溶液中加入氯化鈉達到鹽析效應,在填充有正辛醇的聚丙烯中空纖維孔中進行三相HF-LPME,纖維內腔填充0.4 mol/L鹽酸溶液。在2 400 r/min的多管渦流下混合30 min,將受體相從纖維轉移至小瓶,在氮氣流下干燥,殘留物用N,O-雙(三甲基甲硅烷基)三氟乙酰胺+1%三甲基氯硅烷衍生,冷卻至室溫后,將1.0 μL的等分試樣用GC-MS分析。與常規(guī)用于母乳預處理的萃取技術相比,LPME所需有機溶劑及樣品量較低,是一種有效的替代樣品預處理技術。

Dos等[49]在GC-MS分析前,用三項HF-LPME從玻璃體體液中提取抗抑郁藥,如阿米替林、去甲替林、丙咪嗪和去丙咪嗪等。具體操作:先將樣品轉移至5 mL玻璃管中,加入氫氧化鈉溶液及氘化內標物,在孔內填充十二烷聚丙烯的中空纖維中進行三項HF-LPME,纖維內腔填充0.1 mol/L甲酸為受體相,在1 000 r/min 55 ℃下攪拌,10 min內提取目標分析物,氮氣流下干燥,再在甲醇中重構殘留物。研究人員還評估了人和牛玻璃體體液與鹽水溶液的基質效應,結果表明丙咪嗪和去甲咪嗪變異性較大,而阿米替林和去甲替林沒有明顯的基質效應。

2.3 其他綠色提取技術

除SPME和LPME外,其他綠色提取技術也可用于替代生物樣品的樣品制備。表3列舉了其他綠色提取技術在法庭科學毒物分析中替代生物樣品制備中的應用。

Ezoddin等[55]在基于懸浮有機液滴微萃取固化的基礎上,用超聲波輔助超分子技術(Ultrasonic assisted supramolecular based on solidification of floating organic drop microextraction,UA-SM-SFO-ME)從唾液樣品中提取美沙酮。具體操作:用超聲波輻射1-十二醇和四氫呋喃,形成含反膠束的超分子溶劑聚集體,將獲得的超分子溶液分散在樣品溶液中,在超聲波作用下,2 min內提取目標分析物,離心使相分離,再將樣品置于冰中,將超分子溶劑固化、去除、熔化并分析。研究結果顯示超聲波能量的使用能提高提取效率。

填充吸附劑微萃取技術(Microextraction by packed sorbent ,MEPS)在法醫(yī)毒物分析中也用于替代生物樣品的綠色樣品制備,使用時將吸附劑材料直接填充到放置在注射器主體和針頭之間的小藥筒中。與傳統(tǒng)SPE技術相比,MEPS具有操作簡便、提取時間短、樣品和溶劑消耗量少等優(yōu)點[58]。Montesano等[59]在HPLC-MS/MS測定前,用MEPS技術制備樣品同時分析口腔液中的20種非法藥物,如可卡因、安非他明、天然和合成類阿片和迷幻劑。具體操作:將口腔液樣品蛋白質沉淀,用含有C18吸附劑的注射器,通過分配和抽吸等分樣品實現(xiàn)目標分析物的提取,洗滌吸附劑,在甲醇中加入5 mmol/L甲酸,再進行五個周期的分配和抽吸循環(huán)洗脫分析物,最后用HPLC-MS/MS分析。研究結果表明:此方法在提取目標分析物方面,具有良好的精密度和準確性,同時發(fā)現(xiàn),MEPS吸附劑可重復利用至少100次。

磁性固相萃取(Magnetic solid-phase extraction,MSPE)是另一種小型化樣品制備技術,也被用于法醫(yī)毒物分析中替代生物樣品的提取。MSPE是將磁性吸附劑直接加至含目標分析物的樣品溶液中,吸附后,用外部磁場分離磁性吸附劑,去除水性樣品,再添加適當?shù)娜軇┻M行洗脫,最后通過磁分離技術進行相分離。MSPE具備d-SPE吸附劑與目標分析物接觸面積大的優(yōu)點,從而提高了提取效率。與傳統(tǒng)SPE和LLE相比,MSPE是一種強大的樣品制備技術,它減少了樣品和有機溶劑的用量,被視為一種綠色樣品制備技術[60]。Boojaria等[61]將硅烷修飾過的磁性納米顆粒用于從人類毛發(fā)中提取嗎啡。與常規(guī)SPE吸附劑相比,硅烷改性磁性納米顆粒具有更大的表面積,因此具有吸附量大、靈敏度高、富集因子高及合成方法簡單快速的特點。Esmaeili等[62]將超順磁性Fe3O4@SiO2制備核殼復合納米顆粒,用于混合半膠束固相萃取毛發(fā)中的苯二氮卓類,再用HPLC-DAD進行分析。本方法將十六烷基三甲基溴化銨作為表面改性劑,在二氧化硅上形成半膠束和混合膠束,進而增強了苯二氮卓類化合物的吸附,這種方法具有經濟、簡單、快速、提取效率高、有機溶劑用量少等優(yōu)點。

3 結論

與法庭科學毒物分析中常用的傳統(tǒng)基質相比,毛發(fā)、指甲、胎糞、組織、口腔液和唾液等替代生物樣本的分析具有樣品采集容易、穩(wěn)定性高和時間跨度大等優(yōu)點。各種新的萃取技術已被用于法庭科學毒物學中替代生物樣品制備,SPME和LPME是最常用的樣品制備技術,而SV-LPE、μ-SPE、MEPS和MSPE因具有減少有機溶劑用量、簡單和快速等優(yōu)點也是常用的綠色樣品制備技術,目前,還有其他成熟的綠色樣品制備技術如織物相吸附萃取(Fabric phase sorptive extraction ,FPSE)、膠囊相微萃取(Capsule phase microextraction,CPME)和固相萃取移液管尖端(Pipette-tip solid-phase extraction ,PT-SPE),由于其在樣品處理方面的顯著優(yōu)勢,最近也受到了極大關注。

目前,許多新型材料已成功用于從生物基質中提取有機物,如有機金屬骨架、氧化石墨烯、碳基材料及分子印跡聚合物材料。這些材料以不同形式應用在樣品制備技術中,如作為SPME纖維或攪拌棒吸附萃取的涂層直接用分散固相萃取,作為MSPE磁性納米顆粒功能化后的磁性吸附劑,作為填充到移液管尖端后的PT-SPE吸附劑等。最后,結合多種綠色樣品制備技術對離子液體和深共晶溶劑評估也可用于替代生物樣品的制備。