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    miR-181b-5p調(diào)節(jié)EGR1/BIM通路對(duì)ALL細(xì)胞增殖、凋亡和遷移的影響*

    2023-08-22 03:25:32袁韻王婷胡艷
    西部醫(yī)學(xué) 2023年8期
    關(guān)鍵詞:劃痕熒光素酶試劑盒

    袁韻 王婷 胡艷

    (1.四川大學(xué)華西護(hù)理學(xué)院,四川 成都 610041;2.四川大學(xué)華西醫(yī)院血液內(nèi)科,四川 成都 610041)

    急性淋巴細(xì)胞白血病(Acute lymphoblastic leukemia,ALL)是一種常見(jiàn)的血液系統(tǒng)惡性腫瘤,其特點(diǎn)是骨髓浸潤(rùn)和肝、脾、淋巴結(jié)中淋巴母細(xì)胞的積累[1-2]。盡管ALL的治療取得了重大進(jìn)步,但仍有部分ALL患者復(fù)發(fā)后難以緩解[3]。因此,迫切需要探索治療ALL的新策略。miRNA在ALL和慢性淋巴細(xì)胞白血病中發(fā)揮關(guān)鍵作用,在靶向分子治療和預(yù)后評(píng)估等方面具有良好的應(yīng)用前景[4]。miR-181家族是許多生物過(guò)程中的重要調(diào)節(jié)分子,包括免疫反應(yīng)、細(xì)胞增殖、凋亡、線粒體功能和自噬[5]。miR-181a已經(jīng)被證實(shí)在ALL細(xì)胞中充當(dāng)腫瘤促進(jìn)miRNA,可通過(guò)調(diào)節(jié)腫瘤抑制基因早期生長(zhǎng)反應(yīng)因子1(Early growth response 1,EGR1)的表達(dá)影響細(xì)胞的周期進(jìn)程[6]。且已有研究證明,攜帶miR-181b-5p的細(xì)胞外囊泡可促進(jìn)ALL的惡性進(jìn)展[7]。生物信息學(xué)預(yù)測(cè)顯示EGR1是miR-181b-5p的潛在靶基因。EGR1是控制造血干細(xì)胞增殖的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子之一,EGR1激活并招募造血干細(xì)胞使其增殖和分化以產(chǎn)生成熟的血細(xì)胞,其失調(diào)與血液惡性腫瘤相關(guān),包括ALL[8]。據(jù)報(bào)道,在ALL中EGR1表達(dá)降低,升高其表達(dá)可誘導(dǎo)ALL細(xì)胞凋亡并抑制細(xì)胞增殖[9]。然而,miR-181b-5p在ALL細(xì)胞中的具體作用及機(jī)制尚不清楚。本研究旨在通過(guò)分析miR-181b-5p對(duì)ALL細(xì)胞增殖、遷移和凋亡的影響,同時(shí)驗(yàn)證miR-181b-5p和EGR1之間的靶向關(guān)系,以期尋找一個(gè)有希望的ALL治療靶點(diǎn),并揭示ALL治療的潛在機(jī)制。

    1 資料與方法

    1.1 一般資料 納入四川大學(xué)華西醫(yī)院2019年1月—2021年1月80例ALL患者(ALL組)。ALL診斷標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)是“國(guó)家ALL診斷和治療建議”[10]。參考文獻(xiàn)[11]將所有ALL患者分為24例標(biāo)準(zhǔn)風(fēng)險(xiǎn)(標(biāo)準(zhǔn)風(fēng)險(xiǎn)-ALL組)、35例中等風(fēng)險(xiǎn)(中等風(fēng)險(xiǎn)-ALL組)和21例高等風(fēng)險(xiǎn)(高等風(fēng)險(xiǎn)-ALL組)。同時(shí)收集我院無(wú)惡性血液病志愿者30例作為對(duì)照組。ALL患者的最小年齡為4歲,最大為48歲,平均年齡為18.17歲,其中男性53例,女性27例。對(duì)照組的最小年齡為4歲,最大年齡為47歲,平均年齡為20.60歲,其中16人為男性,14人為女性。本研究經(jīng)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。所有涉及的參與者均提供了知情同意書(shū)。

    1.2 細(xì)胞和主要試劑 Trizol RNA提取試劑(9108-1)、PrimeScript RT試劑盒(RR047AA)、SYBR Green Realtime PCR Master Mix(QPK-201)購(gòu)自日本TAKARA,人ALL細(xì)胞系NALM-6(HTX1901C)購(gòu)自深圳華拓生物,miR-181b-5p模擬物/抑制物(miR-181b-5p mimics/inhibitor)及其陰性對(duì)照(NC-mimics/inhibitor)均購(gòu)自上海GenePharma,EGR1過(guò)表達(dá)載體(EGR1)及其空載(Vector)均購(gòu)自廣州Ribo Bio,Lipofectamine 3000(L3000015)購(gòu)自美國(guó)Invitrogen,MTT細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒(8028)購(gòu)自美國(guó)ScienCell,Annexin V FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(CA001)購(gòu)自美國(guó)SAB,雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒(11402ES60)購(gòu)自上海YEASEN,Bicinchoninic Acid Protein Assay試劑盒(abx097193)購(gòu)自英國(guó)Abbexa,一抗EGR1(4154S)、BIM(2933T)、Cyclin D1(55506T)、C-caspase-3(9664T)、MMP-2(87809S)、MMP-9(13667T)和β-actin(4970T)購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology。

    1.3 方法

    1.3.1 qRT-PCR檢測(cè)miR-181b-5p和EGR1 mRNA相對(duì)表達(dá)水平 通過(guò)Trizol提取總RNA,并通過(guò)PrimeScript RT試劑盒獲得cDNA,使用SYBR Green法在ABI 7500 HT快速實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)上進(jìn)行miRNA和mRNA定量。U6用作miRNA相對(duì)定量的內(nèi)部對(duì)照,β-actin用作mRNA相對(duì)定量的內(nèi)部對(duì)照。使用2-ΔΔct法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)水平。引物序列如下:miR-181b-5p正向?yàn)?′-GTTTGAAC ATTCATTGCTGTCG-3′,反向?yàn)?′-GTGCAGGGT CCGAGGT-3′;EGR1正向?yàn)?′-AGCTGTGCAGTG CAGTCCAACGAC-3′,反向?yàn)?′-TAGTCGGGGAT CATGGGAACCTG-3′;U6正向?yàn)?′-CTCGCTTCG GCAGCACA-3′,反向?yàn)?′-AACGCTCTCACGAA TTTGCGT-3′;β-actin正向?yàn)?′-ACACCTTCTAC AATGAGCTG-3′,反向?yàn)?′-CTGCTTGCTGATCC ACATCT-3′。

    1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng)與分組 采用10%胎牛血清和1%鏈/青霉素的Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基,在5%CO2培養(yǎng)箱中于37 ℃培養(yǎng)NALM-6細(xì)胞。使用Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染生長(zhǎng)到80%匯合的NALM-6細(xì)胞。NALM-6細(xì)胞分為NC-mimics組(轉(zhuǎn)染NC-mimics)、miR-181b-5p mimics組(轉(zhuǎn)染miR-181b-5p mimics)、NC-inhibitor組(轉(zhuǎn)染NC-inhibitor)和miR-181b-5p inhibitor組(轉(zhuǎn)染miR-181b-5p inhibitor)。此外,為了進(jìn)一步探究miR-181b-5p對(duì)ALL的作用機(jī)制,將NALM-6細(xì)胞分為Vector組(轉(zhuǎn)染Vector)、EGR1組(轉(zhuǎn)染EGR1)和miR-181b-5p mimics+EGR1組(共轉(zhuǎn)染miR-181b-5p mimics和EGR1)。未被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞被認(rèn)為是Blank組。所有細(xì)胞均在37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h。通過(guò)qRT-PCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率見(jiàn)表1。

    表1 4組miR-181b-5b mRNA表達(dá)水平

    1.3.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力 將各組轉(zhuǎn)染的NALM-6細(xì)胞(2×104個(gè)/孔)種植到96孔板中。培養(yǎng)24 h后將20 μL MTT添加到每個(gè)孔中,并將板在37 ℃下孵育3~4 h。然后去除MTT試劑,并添加150 μL DMSO以溶解甲臜。使用酶標(biāo)儀在490 nm處測(cè)量吸光度。

    1.3.4 Annexin V FITC/PI雙染檢測(cè)細(xì)胞凋亡 將各組轉(zhuǎn)染的NALM-6細(xì)胞(5×105個(gè))以1000 rpm的速度離心5 min,然后將細(xì)胞重懸于0.5 mL結(jié)合緩沖液中,在細(xì)胞懸浮液中添加5 μL Annexin V FITC和PI溶液。將細(xì)胞在室溫下避光孵育5 min,并在30 min內(nèi)通過(guò)流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。

    1.3.5 劃痕愈合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移 將各組轉(zhuǎn)染的NALM-6細(xì)胞(1×105個(gè)/孔)接種到6孔板中,培養(yǎng)至細(xì)胞達(dá)到90%匯合。使用200 μL微量移液器尖端在每個(gè)孔的中間垂直劃傷細(xì)胞并洗滌去除懸浮細(xì)胞。培養(yǎng)細(xì)胞24 h,拍攝0 h和24 h細(xì)胞圖片,Image-J軟件測(cè)量劃痕寬度。劃痕愈合率(%)=[(0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度)/0 h劃痕寬度]×100%。

    1.3.6 雙熒光素酶檢測(cè)熒光素酶活性 生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)miR-181b-5p在EGR1 3′-UTR上的潛在結(jié)合位點(diǎn)。產(chǎn)生具有野生型(WT)或突變型(MUT)miR-181b-5p結(jié)合位點(diǎn)的EGR1并克隆到pmirGLO載體構(gòu)建EGR1 WT和EGR1 MUT。然后將EGR1 WT/EGR1 MUT與NC-mimics/miR-181b-5p mimics通過(guò)Lipofectamine 3000共轉(zhuǎn)染到NALM-6細(xì)胞中48 h。通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測(cè)熒光素酶活性。

    1.3.7 蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)蛋白表達(dá)水平 NALM-6細(xì)胞通過(guò)預(yù)冷的裂解緩沖液裂解得到總蛋白。通過(guò)Bicinchoninic Acid Protein Assay試劑盒對(duì)蛋白質(zhì)濃度進(jìn)行檢測(cè)。蛋白質(zhì)樣品在SDS-PAGE中分離,并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。將膜與一抗EGR1、BIM、Cyclin D1、C-caspase-3、MMP-2、MMP-9和β-actin(內(nèi)參)在4 ℃下孵育過(guò)夜。隨后將膜與二抗在25 ℃下孵育1 h。通過(guò)增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光法使蛋白質(zhì)可視化,并通過(guò)Quantity One 1-D軟件進(jìn)行量化。

    2 結(jié)果

    2.1 miR-181b-5p在ALL患者中的表達(dá)水平 兩組觀察對(duì)象的臨床病理特征見(jiàn)表2。與對(duì)照組相比,ALL組miR-181b-5p表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05);中等風(fēng)險(xiǎn)-ALL組miR-181b-5p的表達(dá)顯著高于標(biāo)準(zhǔn)風(fēng)險(xiǎn)-ALL組(P<0.05),高等風(fēng)險(xiǎn)-ALL組miR-181b-5p的表達(dá)顯著高于中等風(fēng)險(xiǎn)-ALL組(P<0.05),見(jiàn)圖1。結(jié)果表明ALL中miR-181b-5p表達(dá)增加,尤其是高等風(fēng)險(xiǎn)-ALL組。

    圖1 miR-181b-5p在ALL中表達(dá)水平

    表2 兩組臨床病理特征

    2.2 miR-181b-5p對(duì)ALL細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響 與NC-mimics組相比,miR-181b-5p mimics組NALM-6細(xì)胞活力、劃痕愈合率顯著增高,細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.05);與NC-inhibitor組相比,miR-181b-5p inhibitor組NALM-6細(xì)胞活力、劃痕愈合率顯著降低,細(xì)胞凋亡率顯著增高(P<0.05)。見(jiàn)圖2、表3。

    圖2 miR-181b-5p對(duì)ALL細(xì)胞凋亡和遷移的影響

    表3 miR-181b-5p對(duì)ALL細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響

    2.3 miR-181b-5p與ALL細(xì)胞中EGR1的表達(dá)存在相互作用關(guān)系 生物信息學(xué)技術(shù)預(yù)測(cè)了EGR1 3′-UTR中miR-181b-5p的結(jié)合位點(diǎn);雙熒光素酶結(jié)果顯示,與共轉(zhuǎn)染NC-mimics和EGR1 WT的NALM-6細(xì)胞相比,共轉(zhuǎn)染miR-181b-5p mimics和EGR1 WT的NALM-6細(xì)胞中相對(duì)熒光素酶活性顯著降低(P<0.05),見(jiàn)圖3。qRT-PCR檢測(cè)兩組EGR1的表達(dá)結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,ALL組EGR1的表達(dá)明顯降低(P<0.05)。中等風(fēng)險(xiǎn)-ALL組EGR1表達(dá)顯著低于標(biāo)準(zhǔn)風(fēng)險(xiǎn)-ALL組(P<0.05),高等風(fēng)險(xiǎn)-ALL組EGR1表達(dá)顯著低于中等風(fēng)險(xiǎn)-ALL組(P<0.05),見(jiàn)圖4。提示,EGR1在ALL中的表達(dá)下調(diào),尤其是在高等風(fēng)險(xiǎn)-ALL組。進(jìn)一步上調(diào)miR-181b-5p可顯著降低EGR1 mRNA表達(dá)(P<0.05),下調(diào)miR-181b-5p可明顯升高EGR1 mRNA表達(dá)(P<0.05),見(jiàn)圖5。

    圖3 Starbase網(wǎng)站預(yù)測(cè)miR-181b-5p與EGR1的結(jié)合位點(diǎn)及雙熒光素酶測(cè)定結(jié)果

    圖4 EGR1在ALL中表達(dá)水平

    圖5 miR-181b-5p對(duì)EGR1 mRNA表達(dá)的影響

    2.4 miR-181b-5p過(guò)表達(dá)削弱了EGR過(guò)表達(dá)對(duì)ALL腫瘤發(fā)生的抑制作用 為了進(jìn)一步探索EGR1是否參與了miR-181b-5p在ALL細(xì)胞中的作用,構(gòu)建EGR1過(guò)表達(dá)質(zhì)粒后轉(zhuǎn)染到NALM-6細(xì)胞中,轉(zhuǎn)染后EGR1 mRNA水平顯著增高(P<0.05),然后用于后續(xù)研究。與Vector組相比,EGR1組NALM-6細(xì)胞活力、劃痕愈合率顯著降低,細(xì)胞凋亡率顯著增高(P<0.05);與EGR1組比較,miR-181b-5p mimics+EGR1組NALM-6細(xì)胞活力、劃痕愈合率顯著增高,細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.05),見(jiàn)圖6、表4。

    圖6 miR-181b-5p過(guò)表達(dá)削弱了EGR過(guò)表達(dá)對(duì)ALL腫瘤細(xì)胞凋亡和遷移的影響

    表4 miR-181b-5p過(guò)表達(dá)削弱了EGR過(guò)表達(dá)對(duì)ALL腫瘤發(fā)生的抑制作用

    2.5 miR-181b-5p調(diào)節(jié)EGR1/BIM通路對(duì)ALL腫瘤發(fā)生相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 結(jié)果顯示,與Vector組相比,EGR1組NALM-6細(xì)胞中EGR1、BIM和C-caspase-3蛋白水平增高,Cyclin D1、MMP-2和MMP-9蛋白水平降低(P<0.05);與EGR1組比較,miR-181b-5p mimics+EGR1組NALM-6細(xì)胞中EGR1、BIM和C-caspase-3蛋白水平降低,Cyclin D1、MMP-2和MMP-9蛋白水平增高(P<0.05),見(jiàn)圖7、表5。

    圖7 Western blot檢測(cè)細(xì)胞中EGR1、BIM、Cyclin D1、C-caspase-3、MMP-2和MMP-9蛋白水平

    表5 miR-181b-5p調(diào)節(jié)EGR1/BIM通路對(duì)ALL腫瘤發(fā)生相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

    3 討論

    ALL是一種以淋巴細(xì)胞發(fā)育異常、分化異常為特征的血液系統(tǒng)性腫瘤,形成大量未成熟的白細(xì)胞[1-2]。miRNA的異常表達(dá)與ALL的腫瘤發(fā)生有關(guān)[12]。以往研究顯示,miR-181家族具有抑癌和致癌雙重功能,是腫瘤診斷與治療的潛在靶點(diǎn)[13-14]。有研究表明,miR-181b-5p在ALL細(xì)胞系中高表達(dá)[7]。因此,推測(cè)miR-181b-5p在ALL的發(fā)生和發(fā)展中起關(guān)鍵作用。本研究發(fā)現(xiàn)ALL患者中miR-181b-5p表達(dá)升高,且在高危ALL患者中表達(dá)最高。本實(shí)驗(yàn)功能研究結(jié)果顯示,過(guò)表達(dá)miR-181b-5p可明顯促進(jìn)ALL細(xì)胞的增殖和遷移,抑制細(xì)胞凋亡;轉(zhuǎn)染miR-181b-5p抑制物阻斷miR-181b-5p表達(dá)可抑制ALL細(xì)胞的遷移和侵襲,促進(jìn)細(xì)胞凋亡。以上結(jié)果提示miR-181b-5p通過(guò)促進(jìn)ALL細(xì)胞增殖、遷移和抑制細(xì)胞凋亡來(lái)誘發(fā)ALL的惡性進(jìn)展。因此,下調(diào)miR-181b-5p的表達(dá)可能是治療ALL的新靶點(diǎn)。

    EGR1是一種鋅指轉(zhuǎn)錄因子,可調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化和凋亡。EGR1在實(shí)體癌中表達(dá)失調(diào),并作為癌基因或腫瘤抑制因子發(fā)揮作用,具體取決于癌癥的階段和類型[15-16]。EGR1已被表征為白血病和多發(fā)性骨髓瘤中的腫瘤抑制因子[17]。EGR1可作為miRNA的下游靶標(biāo)發(fā)揮其腫瘤調(diào)節(jié)功能[18]。生物信息學(xué)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn),EGR1可能是miR-181b-5p的下游靶基因。本研究通過(guò)對(duì)ALL患者中EGR1 mRNA水平進(jìn)行檢測(cè),發(fā)現(xiàn)其在ALL中呈低表達(dá)。雙熒光素酶證實(shí),miR-181b-5p與EGR1存在相互作用,且上調(diào)miR-181b-5p可抑制EGR1表達(dá),下調(diào)miR-181b-5p可促進(jìn)EGR1表達(dá),提示miR-181b-5p負(fù)靶向調(diào)控EGR1在ALL中發(fā)揮促癌功能。此外,本研究發(fā)現(xiàn),上調(diào)miR-181b-5p可明顯削弱EGR1過(guò)表達(dá)對(duì)ALL細(xì)胞增殖、遷移的促進(jìn)作用以及對(duì)細(xì)胞凋亡的抑制作用。提示miR-181b-5p可能通過(guò)抑制EGR1的表達(dá)來(lái)促進(jìn)ALL的發(fā)展。

    據(jù)報(bào)道,BIM編碼一種來(lái)自BCL-2家族的細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白,可充當(dāng)細(xì)胞凋亡激活劑[19]。已有報(bào)道顯示,EGR1可通過(guò)與BIM的啟動(dòng)子結(jié)合,觸發(fā)其表達(dá),進(jìn)而觸發(fā)腫瘤細(xì)胞死亡[20]。本研究結(jié)果顯示,過(guò)表達(dá)EGR1可促進(jìn)BIM表達(dá),同時(shí)上調(diào)凋亡相關(guān)蛋白C-caspase-3的表達(dá),下調(diào)增殖相關(guān)蛋白Cyclin D1和遷移相關(guān)蛋白(MMP-2和MMP-9)水平。表明EGR1可能通過(guò)與BIM結(jié)合調(diào)控ALL細(xì)胞惡性行為相關(guān)蛋白的表達(dá)進(jìn)而影響細(xì)胞增殖、遷移和凋亡。進(jìn)一步的研究顯示,上調(diào)miR-181b-5p可削弱EGR1對(duì)BIM表達(dá)的影響。提示miR-181b-5p可能通過(guò)調(diào)節(jié)EGR1/BIM通路進(jìn)而影響ALL細(xì)胞增殖、凋亡和遷移。本研究補(bǔ)充了miR-181家族成員miR-181b-5p可能作為ALL的潛在治療靶點(diǎn)。但miR-181b-5p在ALL的詳細(xì)作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

    4 結(jié)論

    miR-181b-5p表達(dá)水平在ALL中上調(diào)。下調(diào)miR-181b-5p可通過(guò)激活EGR1/BIM通路抑制ALL細(xì)胞增殖、遷移并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

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