丙泊酚通過靶向調(diào)控PI3K/AKT/mTOR信號通路體外抑制乳腺癌細(xì)胞生長*

郭志強(qiáng) 張敏 許斌兵

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬遂寧市中心醫(yī)院麻醉科,四川 遂寧 629000)

乳腺癌是發(fā)生于乳腺的上皮性惡性腫瘤,根據(jù)2020年最新全球癌癥數(shù)據(jù),乳腺癌已取代肺癌,成為全球第一大癌[1]。雖然化學(xué)治療、生物治療及靶向治療等方法已使乳腺癌患者的預(yù)后得到明顯改善,但死亡率仍高,居全球癌癥死亡人數(shù)的第5位[2]。此外,年輕女性乳腺癌患者正在增長,且轉(zhuǎn)移率高[3]。因此,亟待研究新的治療方法提高乳腺癌患者生存率,減輕全球及我國的疾病負(fù)擔(dān)。丙泊酚,2, 6-二異丙基苯酚,常被用于誘導(dǎo)和維持麻醉[4]。近年來,有報道稱,丙泊酚參與調(diào)控癌細(xì)胞的增殖和凋亡,其抗腫瘤作用逐漸引起人們的關(guān)注[5-6]。研究發(fā)現(xiàn)丙泊酚降低了人Hela細(xì)胞的侵襲能力[7]。在HR陽性晚期乳腺癌患者中,丙泊酚治療有效,且患者對其普遍具有良好的耐受性[8]。然而,丙泊酚治療乳腺癌的機(jī)制仍不完全清楚。因此,本文旨在分析丙泊酚對乳腺癌細(xì)胞生長、侵襲性、凋亡的作用,以及對PI3K/AKT/mTOR信號通路的影響,試圖揭示丙泊酚的乳腺癌中的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng) MCF-7和BT474細(xì)胞購自美國ATCC細(xì)胞庫,所有細(xì)胞均在RPMI-1640培養(yǎng)基(美國Invitrogen公司)中培養(yǎng),培養(yǎng)基中添加10%熱滅活胎牛血清(FBS)、3 mM L-谷氨酰胺、50 μg/mL慶大霉素和1%青霉素/鏈霉素(所有試劑均購自美國Gibco公司)。細(xì)胞在37 ℃和5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.2 細(xì)胞分組 MCF-7和BT474細(xì)胞在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),均分為對照組和丙泊酚組。用丙泊酚標(biāo)準(zhǔn)品(10 mg/mL,購自德國sigma-aldrich公司)處理細(xì)胞48 h。MCF-7細(xì)胞培養(yǎng)至85%匯合,然后取出培養(yǎng)基,用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)沖洗3次。根據(jù)制造商的說明使用Lipo-fectamine 2000(美國Sigma公司)進(jìn)行處理。Sable PI3K 過表達(dá)MCF-7細(xì)胞通過GS 篩選系統(tǒng)篩選。PI3K過表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)丙泊酚處理后轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞分為對照組、丙泊酚+PI3K組、PI3K組。

1.3 動物分組 SPF級雌性Balb/c小鼠(6～8周齡,體質(zhì)量30～32 g)購自上海斯萊克實驗動物公司。小鼠皮下植入MCF-7細(xì)胞(1×107細(xì)胞),小鼠維持在12小時的光/暗周期,自由獲取飲食和水。腫瘤植入后第5天開始治療(直徑5～8 mm)。實驗組荷瘤小鼠靜脈注射丙泊酚(10 mg/kg),Control組靜脈注射PBS。腫瘤體積按最小直徑0.52×最小直徑2 ×最大直徑公式計算。第50天處死小鼠進(jìn)行進(jìn)一步分析。本研究嚴(yán)格按照中國北京動物保護(hù)學(xué)會《實驗動物護(hù)理使用指南》的建議進(jìn)行,本次實驗獲我院動物倫理委員會批準(zhǔn)。所有的手術(shù)在戊巴比妥鈉麻醉(50 mg/kg)下實施安樂死,盡量減少動物的痛苦。

1.4 Transwell小室試驗檢測細(xì)胞侵襲 MCF-7和BT474細(xì)胞在帶有小室插入的6孔培養(yǎng)板中進(jìn)行Transwell小室侵襲試驗。對于侵襲檢測,MCF-7和BT474細(xì)胞(1×104/孔)被放置到帶有基質(zhì)凝膠涂層膜的上腔室中,在每個膜上至少3個隨機(jī)選擇顯微鏡下視野進(jìn)行小室涂層膜上侵襲計數(shù)。

1.5 流式細(xì)胞學(xué)試驗檢測細(xì)胞凋亡 MCF-7和BT474細(xì)胞胰酶消化后收集細(xì)胞,冷PBS洗滌細(xì)胞2次,后調(diào)整細(xì)胞密度至1×106個細(xì)胞/mL。細(xì)胞懸浮液中加入5 μL Annexin V-FITC (美國Biosciences公司),輕輕混勻后于2～8 ℃避光條件下孵育15 min。之后加入10 μL PI(美國Biosciences公司)輕輕混勻于2～8 ℃避光條件下孵育5 min。FACScan 流式細(xì)胞儀(美國Biosciences公司)進(jìn)行分析。重復(fù)試驗3次,測定并計算各組標(biāo)記細(xì)胞凋亡率。

1.6 CCK8試驗檢測細(xì)胞增殖 根據(jù)使用說明,選擇使用Cell Counting Kit-8(上海Beyotime公司)評估腫瘤細(xì)胞活力。將MCF-7和BT474細(xì)胞(1×103)接種于96孔板,加入丙泊酚(10 mg/mL)48 h。在孵育結(jié)束前3 h將CCK-8試劑加入孔中。使用酶標(biāo)儀來測定在450 nm下吸光度來分析細(xì)胞活力。

1.7 免疫組織化學(xué)實驗 石蠟包埋的異種腫瘤組織被切成連續(xù)的4 μm厚切片。將組織切片在100 ℃下在檸檬酸溶液(10 mmol/L,pH=6.0),然后在二甲苯中脫蠟,在乙醇溶液中再水合和分級。將腫瘤切片浸泡在0.3%過氧化氫溶液中,抑制腫瘤細(xì)胞內(nèi)源性過氧化物酶活性。隨后,腫瘤切片分別與兔抗人PI3K (1∶400, ab86714)、AKT (1∶400, ab8805)、mTOR (1∶400, ab2732)在4 ℃下孵育過夜。最后,腫瘤切片用HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗孵育,二氨基苯作為顯色原,蘇木精作為核反染色。使用化學(xué)發(fā)光檢測系統(tǒng)(美國Biosciences公司)對結(jié)果進(jìn)行可視化。

1.8 Western blot檢測蛋白表達(dá)水平 MCF-7 和BT474 細(xì)胞通過刮取收獲,并在RIPA 緩沖液中裂解,然后在4 ℃ 下勻漿10 min。用SDS-PAGE分析蛋白后轉(zhuǎn)移膜。隨后蛋白質(zhì)與兔抗人Bcl-2(1∶400, ab32124)、Bcl-w (1∶500, ab2568)、caspase-3 (1∶500, ab217)、caspase-8(1∶400, ab25901)、PI3K (1∶400, ab86714) AKT(1∶400, ab8805)、mTOR(1∶400, ab2732)和β-actin(1∶400, ab5694) (所有試劑購自英國Abcam公司) 在4 ℃一起孵育12 h。

1.9 TUNEL檢測腫瘤切片中的凋亡陽性細(xì)胞 通過末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶生物素-dUTP標(biāo)記(TUNEL)來測定(德國Roche Diagnostics公司)。將切片在4 ℃下用4%多聚甲醛溶液固定60 min后切片脫脂、復(fù)水,在TDT酶和標(biāo)記液(1∶9)中沉淀60 min。隨后,用50 μL反應(yīng)混合物37 ℃孵育60 min,PBS洗滌3次。細(xì)胞核用DAPI在4 ℃下染色60 min。在放大倍數(shù)400 下觀察至少3個隨機(jī)選擇視野計算 TUNEL 陽性細(xì)胞的百分比。最后,用Zeiss LSM 510共聚焦顯微鏡在488 nm處捕捉腫瘤組織圖像。

2 結(jié)果

2.1 丙泊酚治療顯著抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖 CCK-8實驗結(jié)果顯示,對照組中MCF-7細(xì)胞增殖率為(108.32±18.72)%,丙泊酚組中MCF-7細(xì)胞增殖率為(56.45±8.72)%;對照組中BT474細(xì)胞增殖率為(112.56±15.56)%, 丙泊酚組中BT474細(xì)胞增殖率為(52.43±7.65)%。與對照組相比,丙泊酚(10 mg/mL)處理顯著抑制乳腺癌MCF-7和BT474細(xì)胞的增殖(P<0.05),見圖1。

圖1 丙泊酚抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖

2.2 丙泊酚治療顯著抑制乳腺癌細(xì)胞的侵襲 細(xì)胞侵襲實驗結(jié)果顯示對照組中MCF-7細(xì)胞侵襲率為(98.32±12.45)%,丙泊酚組中MCF-7細(xì)胞侵襲率為(62.05±9.72)%;對照組中BT474細(xì)胞侵襲率為(102.32±17.56)%, 丙泊酚組中BT474細(xì)胞侵襲率為(58.25±6.23)%。與對照組相比,丙泊酚(10 mg/mL)處理顯著抑制體外乳腺癌MCF-7和BT474細(xì)胞的侵襲(P<0.05),見圖2。

2.3 丙泊酚可誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡 實驗結(jié)果顯示,對照組中MCF-7細(xì)胞凋亡率為(4.32±1.23)%,丙泊酚組中MCF-7細(xì)胞凋亡率為(28.37±5.12)%,對照組中BT474細(xì)胞侵襲率為(3.75±0.98)%, 丙泊酚組中BT474細(xì)胞侵襲率為(32.26±6.23)%。與對照組相比,丙泊酚治療顯著誘導(dǎo)了MCF-7和BT474細(xì)胞在48 h孵育后的凋亡(P<0.01),見圖3A。Western blot結(jié)果證明,丙泊酚通過降低MCF-7和BT474細(xì)胞中的Bcl-2和Bcl-w表達(dá)誘導(dǎo)體外細(xì)胞凋亡(圖3B)。提示丙泊酚可誘導(dǎo)體外乳腺癌細(xì)胞凋亡。

圖3 丙泊酚誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡

2.4 丙泊酚對PI3K、AKT和mTOR表達(dá)的影響 為了分析丙泊酚對乳腺癌的抑制作用,我們研究了MCF-7細(xì)胞中PI3K/AKT/mTOR信號通路的變化。Western blot實驗結(jié)果顯示,丙泊酚組中體外MCF-7細(xì)胞PI3K、AKT和mTOR的蛋白表達(dá)水平相比于對照組均下降(P<0.01),見圖4A,同時也降低了MCF-7細(xì)胞中PI3K和AKT的磷酸化水平(P<0.01),見圖4B。

2.5 丙泊酚與乳腺癌細(xì)胞生長的關(guān)系 為了分析丙泊酚與乳腺癌細(xì)胞生長的關(guān)系,我們對PI3K進(jìn)行過表達(dá)處理,結(jié)果顯示,過表達(dá)PI3K逆轉(zhuǎn)了丙泊酚降低MCF-7細(xì)胞中AKT和mTOR的表達(dá)水平以及AKT的磷酸化水平,見圖5A。另外過表達(dá)PI3K還可逆轉(zhuǎn)丙泊酚抑制體外MCF-7細(xì)胞的生長和侵襲,病理切片顯示MCF-7細(xì)胞的細(xì)胞異型性在過表達(dá)PI3K后增加,見圖5B～E。

圖5 丙泊酚與乳腺癌細(xì)胞生長的關(guān)系

2.6 丙泊酚治療MCF-7小鼠模型的體內(nèi)療效 我們進(jìn)一步探索了丙泊酚在MCF-7小鼠模型中的抗癌作用。與PBS處理的小鼠相比,丙泊酚顯著抑制腫瘤生長(圖6A)。免疫組織學(xué)結(jié)果顯示,丙泊酚顯著下調(diào)腫瘤切片中PI3K、AKT和mTOR的表達(dá)(圖6B)。TUNEL實驗結(jié)果顯示,與PBS治療的腫瘤相比,丙泊酚增加了腫瘤切片中凋亡小體的數(shù)量 (圖6C、D)。HE染色結(jié)果顯示,與PBS治療時的腫瘤病理組織相比,丙泊酚使用后抑制了腫瘤細(xì)胞的生長,組織中細(xì)胞的異型性比對照組低 (圖6E)。表明丙泊酚治療可以抑制MCF-7小鼠模型的腫瘤生長,促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

圖6 丙泊酚治療MCF-7小鼠模型的體內(nèi)療效

3 討論

丙泊酚用于某些手術(shù)、測試或程序中誘導(dǎo)或維持麻醉[9]。以往研究顯示,丙泊酚具有抗腫瘤的特性,包括誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡、抑制癌細(xì)胞的粘附、遷移和侵襲[10-11]。丙泊酚可通過靶向受體的耐藥機(jī)制,對激素受體陽性的晚期乳腺癌表現(xiàn)出了有效的抑制作用[12]。腫瘤細(xì)胞凋亡在調(diào)節(jié)機(jī)體免疫應(yīng)答與調(diào)控腫瘤組織血管系統(tǒng)中起著至關(guān)重要的作用[13-14]。Gao等[15]研究發(fā)現(xiàn),丙泊酚可以通過誘導(dǎo)caspase依賴的凋亡抑制吉西他濱耐藥胰腺癌細(xì)胞的生長。另外丙泊酚對Caki-1腎癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性活性調(diào)節(jié)伴隨著凋亡相關(guān)microRNA簇和Bcl2家族基因表達(dá)的調(diào)節(jié)[16-17]。有研究表明,丙泊酚在乳腺癌治療中的安全性及有效性高,且有利于患者的進(jìn)一步病理分析[18]。丙泊酚對乳腺癌細(xì)胞的作用機(jī)制及對乳腺癌患者預(yù)后的影響也有學(xué)者進(jìn)行了一系列的探索[19]:例如,丙泊酚通過下調(diào)TGF-β1抑制乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力;丙泊酚通過下調(diào)IL-6抑制乳腺癌細(xì)胞的體外遷移和血管擬態(tài)形成;以及丙泊酚通過抑制Wnt信號誘導(dǎo)的EMT,來降低乳腺癌細(xì)胞侵襲遷移能力[20-21]。本研究體內(nèi)外實驗結(jié)果顯示,丙泊酚對乳腺癌細(xì)胞生長和侵襲的抑制作用,同時丙泊酚治療顯著降低了乳腺癌細(xì)胞中抗凋亡基因Bcl-2和Bcl-w蛋白表達(dá),提示丙泊酚可通過調(diào)節(jié)乳腺癌細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的表達(dá)來誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,從而抑制乳腺癌的生長。

PI3K在調(diào)節(jié)細(xì)胞的存活、增殖和分化等許多細(xì)胞過程中具有重要作用,AKT表達(dá)為AKT1、AKT2和AKT3,分別由PKBα、PKBβ和PKBγ基因編碼[22]。PI3K/AKT/mTOR信號通路與乳腺癌間也存在著一系列的關(guān)系[23]。有研究表明PI3K/AKT信號通路的激活能抑制癌細(xì)胞的生長和存活[24]。其中mTOR是涉及PI3K/AKT信號通路的重要組成部分,PI3K/AKT通路是乳腺癌中潛在的治療靶點,而PI3K抑制劑在乳腺癌臨床治療中也逐漸發(fā)揮著越來越重要的作用[25]。研究表明經(jīng)丙泊酚治療的轉(zhuǎn)移性腎細(xì)胞癌可能伴有PI3K/Akt/mTOR信號通路的成分[26]。Zhang等[27]研究表明,丙泊酚通過PD-L1/Nanog途徑在體外減少乳腺癌干細(xì)胞乳腺球形成。有研究表明,丙泊酚聯(lián)合來曲唑通過PI3K/mTOR途徑抑制人乳腺癌MCF-7/Aro干細(xì)胞的生長[28]。本研究通過結(jié)合體內(nèi)、體外實驗的方法,采用Western blot檢測發(fā)現(xiàn)丙泊酚治療處理后,治療組中乳腺癌MCF-7細(xì)胞中PI3K、AKT和mTOR的蛋白表達(dá)和磷酸化水平降低,說明丙泊酚可通過PI3K/AKT/mTOR信號通路發(fā)揮抑制作用。PI3K進(jìn)行過表達(dá)處理后逆轉(zhuǎn)了乳腺癌MCF-7細(xì)胞中AKT和mTOR的表達(dá)水平以及AKT的磷酸化水平,說明PI3K為丙泊酚上游作用靶點。結(jié)果表明,丙泊酚通過下調(diào)PI3K/AKT/mTOR信號通路抑制人乳腺癌細(xì)胞體外生長,說明ATK在丙泊酚介導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞體外生長抑制中發(fā)揮作用。丙泊酚通過抑制PI3K和mTOR表現(xiàn)出良好的臨床療效,可能通過緩解代償性AKT激活進(jìn)一步改善ER(+)乳腺癌細(xì)胞的治療[28]。但本研究樣本量有限,且未探討不同劑量丙泊酚對實驗結(jié)果的影響,有待今后設(shè)計多中心臨床試驗進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

丙泊酚能夠抑制乳腺癌細(xì)胞的體外生長、侵襲和凋亡,還能抑制MCF-7小鼠乳腺癌腫瘤的生長,其機(jī)制可能是通過調(diào)控PI3K/AKT/mTOR信號通路來實現(xiàn)的。