草烏甲素對大鼠膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎的作用*

楊建浩 楊云皓 喻雙雨 何成松

(西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科,四川 瀘州 646000)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis, RA)是一種慢性、進(jìn)行性炎性疾病,其主要表現(xiàn)為對稱性的多關(guān)節(jié)炎,可能會導(dǎo)致關(guān)節(jié)和關(guān)節(jié)周圍結(jié)構(gòu)損傷和系統(tǒng)性炎癥[1]。RA的病理特征主要包括滑膜組織增生、炎癥細(xì)胞浸潤以及關(guān)節(jié)軟骨的破壞三個方面[2]。既往有研究顯示,RA在全球范圍內(nèi)的患病率約為0.24%[3],而在我國RA的患病率為0.36%～0.42%[4]。目前的研究對RA發(fā)病機(jī)制有了較深的認(rèn)識,但是在臨床治療方面仍存在較多困難,缺乏較為安全有效的治療方法。草烏甲素是一種現(xiàn)代植物藥,其具有抗炎、鎮(zhèn)痛和一定免疫調(diào)節(jié)作用,廣泛用于治療慢性疼痛的患者[5]。本研究采用膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎(Collagen-induced arthritis,CIA)大鼠作為本研究的實驗動物模型,其與RA的發(fā)病機(jī)制在諸多方面存在著相似之處,包括滑膜增生、炎癥浸潤等,是目前研究RA的模型之一[6]。本研究旨在探究草烏甲素對大鼠膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎的作用,同時為臨床上使用該藥治療RA提供更多依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 8周齡雄性SD大鼠20只,體質(zhì)量為180～220 g,由西南醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供,飼養(yǎng)等級為SPF級,動物許可證編號:SCXK(川)2018-17。本動物實驗經(jīng)西南醫(yī)科大學(xué)實驗動物倫理委員會討論審議通過(批準(zhǔn)文號:SWMU20220023)。

1.2 主要藥品、試劑與儀器 草烏甲素(白色粉末,純度大于98%)購于成都曼思特生物科技有限公司,弗氏完全佐劑及牛Ⅱ型膠原蛋白購于上海碧云天生物技術(shù)研究公司,膠原蛋白購于上海金穗生物科技有限公司,IL-6試劑盒、TNF-α試劑盒、MMP-3試劑盒以及HE染色試劑盒購于武漢恒意賽生物科技有限公司。臺式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠),恒溫培養(yǎng)箱(上海精宏實驗設(shè)備有限公司),PCR儀(杭州博日科技)。

1.3 方法

1.3.1 建立CIA大鼠模型 將牛Ⅱ型膠原蛋白溶于0.5%的冰醋酸中,提前預(yù)冷,終濃度為4 mg/mL,隔夜4 ℃,在冰浴條件下,將上述溶液加入相同體積的完全弗氏佐劑,使兩者充分乳化;首次免疫在大鼠的足、尾根部多點皮內(nèi)注射牛型膠原乳劑(按0.3 mL/只)進(jìn)行[7],首次免疫7 d后在足、尾根再次使用上述乳劑加強(qiáng)免疫;加強(qiáng)免疫21 d后,使用CIA模型評分進(jìn)行評估,評分大于6分表示造模成功。關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分標(biāo)準(zhǔn)[6]如下。0分:無關(guān)節(jié)腫脹;1分:單個關(guān)節(jié)腫脹;2分: 2個關(guān)節(jié)腫脹;3分:2個以上的關(guān)節(jié)腫脹評;4分:全部關(guān)節(jié)腫脹。

1.3.2 實驗分組 20只SPF級SD大鼠隨機(jī)分為對照組(5只)和誘導(dǎo)模型組(15只)。將誘導(dǎo)模型組中造模成功的CIA大鼠隨機(jī)分為模型組、低劑量草烏甲素治療組、高劑量草烏甲素治療組。低劑量草烏甲素治療組和高劑量草烏甲素治療組分別按照50、100 μg/kg腹腔注射草烏甲素溶液,同時于對照組和模型組的大鼠腹腔內(nèi)注射同等劑量的生理鹽水,每日1次,連續(xù)給藥30 d。第31天時處死大鼠,取大鼠的腹主動脈血,高速離心后獲取上層血清,同時獲取大鼠后踝關(guān)節(jié)滑膜組織保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定TNF-α、IL-6、IL-17、MMP-3水平 解凍血清,4 ℃ 條件下2000 g離心15 min,吸取上清液。按照ELISA 試劑盒說明書,測定每組大鼠血清中的TNF-α、IL-6、IL-17、MMP-3的水平。

1.3.4 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)測定大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織中MMP-3 mRNA的表達(dá)水平 引物購自武漢金開瑞生物工程有限公司,經(jīng)人工合成提供。GAPDH上游引物序列:AACAGCAACTCCCA TTCTTCC,下游引物序列:TGGTCCAGGGTTTCT TACTCC;MMP-3上游引物序列:AGTTCCTTGGG CTGAAGATGAC,下游引物序列:CCTGGAGAAT GTGAGTGGGG。提取各組大鼠滑膜組織總RNA,利用M-MLV Reverse Transcriptase試劑盒(ELK Biotechnology,EQ002)合成cDNA。利用QuFast SYBR Green PCR Master Mix試劑盒(ELKRT-Biotechnology,EQ001)檢測MMP-3 mRNA表達(dá)水平,反應(yīng)條件:95 ℃ 1 min,95 ℃ 15 s,58 ℃ 20 s,72 ℃ 45 s,共40個循環(huán)。根據(jù)計算公式2-ΔΔCt得出MMP-3 mRNA相對表達(dá)量。

1.3.5 Western Blot檢測關(guān)節(jié)滑膜組織中MMP-3蛋白表達(dá)水平 使用BCA蛋白濃度測定試劑盒,對滑膜組織進(jìn)行蛋白濃度測定。用SDS-PAGE凝膠電泳分離相同蛋白量的血清蛋白樣本,同時轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,室溫下加入封閉液孵育PVDF膜1 h后,加入抗MMP-3(武漢三鷹,17873-1-AP)、GAPDH(美國abcam公司,ab181602)的特異性一抗在4 ℃過夜孵育。次日加入對應(yīng)的二抗常溫孵育1 h。用ECL化學(xué)發(fā)光法檢測蛋白熒光信號。以GAPDH作為內(nèi)參蛋白計算MMP-3蛋白的相對表達(dá)量。

1.3.6 HE染色觀察滑膜組織病理情況 給藥至第31天處死大鼠,獲取大鼠的后踝關(guān)節(jié)滑膜組織,通過固定、脫鈣、石蠟包埋及切片進(jìn)行處理。HE染色:將準(zhǔn)備好的切片,經(jīng)二甲苯、梯度濃度酒精脫蠟后,用蘇木素染色10 min,蒸餾水沖洗,酸性乙醇分化3 s,蒸餾水沖洗1 min,入伊紅染色3 min,蒸餾水沖洗、脫水、透明、封片,最后在顯微鏡下觀察切片。

2 結(jié)果

2.1 草烏甲素對大鼠血清中IL-6、IL-17、TNF-α、MMP-3的影響 與對照組相比,模型組大鼠血清中的IL-6、IL-17、TNF-α、MMP-3水平明顯升高(均P<0.05)。草烏甲素治療組大鼠血清IL-6、IL-17、TNF-α、MMP-3水平較模型組明顯降低(均P<0.05),且呈劑量依賴性(P<0.05),當(dāng)草烏甲素的劑量達(dá)到最高水平(100 μg/kg)時,對IL-6、IL-17、TNF-α、MMP-3表達(dá)水平的抑制作用最為顯著。見表1。

表1 草烏甲素對CIA模型大鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-17、MMP-3含量的比較

2.2 草烏甲素對大鼠滑膜組織中MMP-3 mRNA表達(dá)的影響 與對照組相比,模型組大鼠滑膜組織的MMP-3 mRNA水平升高(均P<0.05)。予以草烏甲素治療后大鼠滑膜組織中的MMP-3 mRNA水平降低(均P<0.05),其中對MMP-3 mRNA的調(diào)節(jié)作用呈劑量依賴性(均P<0.05)。見圖1。

圖1 草烏甲素對CIA模型大鼠滑膜組織MMP-3mRNA表達(dá)的影響

2.3 草烏甲素對大鼠滑膜組織中MMP-3蛋白水平的影響 與對照組相比,模型組大鼠滑膜組織中的MMP-3蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)。予以草烏甲素治療后的大鼠滑膜組織中的MMP-3蛋白表達(dá)水平降低(均P<0.05)。見圖2。

圖2 草烏甲素對CIA模型大鼠滑膜組織中MMP-3蛋白水平的影響

2.4 草烏甲素對大鼠踝關(guān)節(jié)組織病理學(xué)的影響 HE染色后觀察大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織增生及炎癥細(xì)胞浸潤的情況,與對照組相比,模型組滑膜組織增生明顯伴有炎癥細(xì)胞大量浸潤;與模型組相比,高劑量草烏甲素組滑膜組織未見明顯增生伴有少量炎癥細(xì)胞浸潤,見圖3。提示,草烏甲素可以改善CIA大鼠關(guān)節(jié)滑膜處的滑膜增生和炎癥浸潤。

圖3 HE染色觀察草烏甲素對CIA模型大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織病理學(xué)的影響(100×)

3 討論

RA是一種慢性、系統(tǒng)性、侵蝕性、全身性自身免疫性疾病,以滑膜增生及炎性細(xì)胞浸潤為主要的病理特點[8]。臨床治療RA的藥物目前包括糖皮質(zhì)激素、非甾體抗炎藥(NSAIDs)、疾病改善抗風(fēng)濕藥物(DMARDs)以及生物制劑。糖皮質(zhì)激素及非甾體抗炎藥可有效緩解RA疼痛及僵硬;DMARDs藥物包括羥氯喹、甲氨蝶呤、來氟米特等,可改善風(fēng)濕病情;生物制劑是靶向抑制免疫和炎癥反應(yīng)中的特定分子,進(jìn)而改善風(fēng)濕病情[9]。草烏甲素是一種從烏頭屬植物滇西嘟拉中分離得到的C-19二萜雙酯型生物堿,其具有鎮(zhèn)痛、抗炎作用,并有一定的免疫調(diào)節(jié)功能[10]。本研究選用CIA大鼠作為研究RA的實驗?zāi)Ｐ?因其在發(fā)病機(jī)制上與RA有很多相似之處,包括關(guān)節(jié)腫脹、滑膜增生、炎性細(xì)胞浸潤等[11]。龍麗等[12]研究表明草烏甲素能提高佐劑關(guān)節(jié)炎(Adjuvant-induced arthritis,AIA)的鎮(zhèn)痛作用,主要與血清PGE2及提升內(nèi)源性β-內(nèi)啡肽水平有關(guān),其中AIA動物模型也是研究RA的動物模型之一,其主要表現(xiàn)為T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫反應(yīng)。筆者本次使用的CIA動物模型則包括細(xì)胞免疫反應(yīng)和體液免疫反應(yīng)兩個方面,相比與AIA動物模型更與人類相似。

胡建楣等[13]研究表明高草烏甲素對佐劑性關(guān)節(jié)炎性大鼠足腫脹有顯著抑制作用,其主要是降低大鼠血清TNF-α、IL-2、CIA和PGEa水平而發(fā)揮抗炎作用。CIA大鼠模型建立成功后,使用不同劑量的草烏甲素處理CIA大鼠,病理結(jié)果顯示,草烏甲素治療組的CIA大鼠滑膜組織增生和炎癥細(xì)胞浸潤減輕,提示草烏甲素對大鼠膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎具有一定的治療作用。

TNF-α是炎癥因子,其主要是通過活化的單、巨噬細(xì)胞產(chǎn)生,具有殺傷和抑制腫瘤細(xì)胞,以及可以促進(jìn)細(xì)胞增殖和分化的生物學(xué)特性,從而參與自身免疫疾病的發(fā)生和發(fā)展[14]。在RA患者體內(nèi),TNF-α是一種高表達(dá)的促炎因子[15]。TNF-α可以促進(jìn)其他促炎因子的釋放,如IL-6同時進(jìn)一步強(qiáng)化炎癥反應(yīng),在RA的疾病活動中有重要的作用[16]。既往有研究表明,IL-6在免疫調(diào)節(jié)、造血、炎癥和腫瘤等方面具有廣泛的生物學(xué)活性[17]。IL-17由輔助性T細(xì)胞產(chǎn)生,在體內(nèi)可以促進(jìn)粒細(xì)胞集落刺激因子和趨化因子的產(chǎn)生,具有強(qiáng)大的致炎作用[18]。隨著促炎因子的產(chǎn)生增多,增加的中性粒細(xì)胞參與誘發(fā)滑膜炎癥反應(yīng)的機(jī)率,從而加劇體內(nèi)了軟骨和骨的破壞[19]?；|(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)是屬于鋅依賴性的內(nèi)肽酶,因其具有降解細(xì)胞外基質(zhì)中各種蛋白質(zhì)的作用,被認(rèn)為是一類負(fù)責(zé)降解細(xì)胞外基質(zhì)分子的酶,細(xì)胞外基質(zhì)分子作為參與生物組織重塑中的重要調(diào)節(jié)因子[20]。有研究發(fā)現(xiàn)MMPs 可以在關(guān)節(jié)軟骨中表達(dá),因為其具有降解Ⅲ～Ⅶ型膠原及多種纖維連接蛋白的作用,并且在RA疾病活動時表達(dá)進(jìn)一步升高,從而被認(rèn)為是參與軟骨降解最重要的蛋白酶[21]。MMP-3在RA患者中水平較高反映了疾病活動和結(jié)構(gòu)損傷[22],被認(rèn)為是RA疾病活動度、疾病結(jié)局可預(yù)測性和治療反應(yīng)的可靠標(biāo)志物[23]。

本實驗通過ELISA對大鼠血清中的細(xì)胞因子進(jìn)行檢測,發(fā)現(xiàn)CIA大鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-17、MMP-3水平均顯著高于正常大鼠,而接受草烏甲素治療的CIA大鼠TNF-α、IL-6、IL-17、MMP-3水平可顯著降低(P<0.05),且呈劑量依賴性降低,提示草烏甲素具有一定抗炎作用。同時在本研究實驗中檢測CIA 大鼠滑膜組織中MMP-3的mRNA以及蛋白表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)CIA大鼠滑膜組織中 MMP-3的表達(dá)含量均顯著高于正常大鼠,而接受草烏甲素治療的CIA大鼠,MMP-3表達(dá)水平明顯下降(P<0.05)。由此可知草烏甲素對于 CIA 大鼠具有一定的治療作用,但其作用機(jī)制目前還尚不明確,可能與抗炎作用有關(guān),有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

草烏甲素可以抑制炎癥因子分泌和降低MMP-3的表達(dá),對大鼠膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎具有一定的治療作用,在RA的治療上具有良好的應(yīng)用前景。