髓芯減壓聯(lián)合VEGF與膠原基骨移植材料對兔股骨頭缺血壞死的修復作用*

呂亞軍 任立中 李軍 張海靜 張志坤

(河北醫(yī)科大學第一醫(yī)院骨二科,河北 石家莊 050031)

股骨頭壞死(Osteonecrosis of femoral head,ONFH)致殘率高,嚴重影響患者的生活水平[1-3]。股骨頭發(fā)生缺血性壞死后,骨組織表現(xiàn)為血管再生、新骨形成和死骨吸收[4-5]。然而,隨著ONFH疾病的進展,血管再生和新骨形成減弱,而死骨吸收增強[6]。髓芯減壓已廣泛應(yīng)用于ONFH的治療,可降低骨內(nèi)壓力,延緩壞死進程[6]。髓芯減壓所形成的空腔通常需要植骨來完成。膠原基骨修復材料是利用仿生原理由低結(jié)晶度納米級羥基磷灰石與膠原通過物理方法自組裝而成,該成分與天然骨的成分幾乎完成吻合[7- 8]。膠原基骨修復材料具有誘導骨髓間充質(zhì)干細胞向成骨細胞分化的能力及無免疫原性、可降解、易塑形等特性,在骨修復過程中起骨誘導,加快骨愈合的作用[7]。血管再生在骨形成和骨改建過程中至關(guān)重要[9]。血管內(nèi)皮生長因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)是最重要的血管生成因子,具有促進血管內(nèi)皮細胞分裂及血管生成等作用[9-10]。VEGF通過直接吸引內(nèi)皮細胞和破骨細胞,促進成骨細胞的分化,在骨再生過程中對骨形成和修復至關(guān)重要[10-12]。本實驗以兔為研究對象,向股骨頭注入無水乙醇方法構(gòu)建股骨頭壞死模型,采用髓芯減壓聯(lián)合VEGF與膠原基骨移植材料治療兔股骨頭壞死,研究VEGF、膠原基骨修復材料對股骨頭壞死區(qū)域骨修復的影響,探索應(yīng)用髓芯減壓聯(lián)合VEGF與膠原基骨移植材料治療股骨頭壞死的新領(lǐng)域。

1 材料與方法

1.1 動物 24只6月齡SPF級家兔購自河北醫(yī)科大學實驗動物中心,雌雄不限,合格證號為SCXN(冀)2013-1-003,體質(zhì)量(2.21±0.29)kg。家兔飼養(yǎng)在12∶12 h的光明-黑暗周期中,室溫設(shè)定為25 ℃,相對濕度設(shè)定為60%,不限制進食和飲水。本研究已獲得醫(yī)院倫理委員會通過。

1.2 動物模型的建立 參考文獻[13]中的方法建立ONFH兔模型。腹腔注射50 mg/kg戊巴比妥鈉麻醉兔,將兔俯臥位固定,剃毛,消毒,鋪巾。在大轉(zhuǎn)子外側(cè)剪開皮膚和筋膜,分離肌肉,在X線引導下,經(jīng)股骨頭穿刺、克氏針擴髓,然后將無水乙醇1 mL (0.1 mL/min)緩慢注射至股骨頭中心(圖1)。醫(yī)用骨蠟封閉皮質(zhì)骨孔洞,逐層縫合。6周后進行CT掃描,CT檢查中根據(jù)是否觀察到股骨頭壞死、骨密度增高、股骨頭外形改變等特征來判斷建模結(jié)果(圖2)。

圖1 ONFH家兔建模的X線片

圖2 建模6周后的CT圖像

1.3 動物分組和治療 將24只家兔隨機分為模型對照組(A組)、髓芯減壓+自體松質(zhì)骨組(B組)、髓芯減壓+膠原基骨修復材料組(C組)和髓芯減壓+膠原基骨修復材料+VEGF組(D組),每組6只,按照相應(yīng)的治療方法對家兔進行分組治療。腹腔注射50 mg/kg戊巴比妥鈉麻醉兔,將兔俯臥位固定,在大轉(zhuǎn)子外側(cè)剪開皮膚和筋膜,分離肌肉,在X線引導下,用19G骨穿針經(jīng)皮從大轉(zhuǎn)子處鉆入股骨頭區(qū),然后進行藥物治療。B、C和D組家兔均進行髓芯減壓治療,在此基礎(chǔ)上,B組在股骨頭減壓區(qū)植入自體松質(zhì)骨,C組在股骨頭減壓區(qū)植入膠原基骨修復材料(天津市賽寧生物工程技有限公司,國械注準20143461867),D組在股骨頭減壓區(qū)植入膠原基骨修復材料的基礎(chǔ)上,注入600 μg/kg的VEGF蛋白(上海滬震實業(yè)有限公司)。采用醫(yī)用纖維蛋白膠封堵鉆孔。手術(shù)后,家兔每日肌肉注射10萬U青霉素,連續(xù)3 d,以防止感染。

1.4 Western blot檢測蛋白水平 治療12周后,麻醉動物,用空氣栓塞法處死動物,并取出股骨頭,用預冷的DEPC水沖洗,將每個股骨頭用組織研磨機將股骨頭在液氮中粉碎,在RIPA(美國Thermo Fisher公司)中4 ℃孵育30 min。裂解產(chǎn)物隨后在15000 g、4 ℃下離心10 min。通過BCA法測量總蛋白質(zhì)濃度。用12% SDS-PAGE(碧云天生物技術(shù)研究所)對蛋白質(zhì)電泳90 min。然后,將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF上,將膜用5%脫脂乳室溫下封閉1 h。然后將膜與VEGF(1∶1000稀釋)、Collagen I(1∶1000稀釋)、RUNX2(1∶2000稀釋)、OCN(1∶1500稀釋)、Wnt-3a(1∶1000稀釋)、β-catenin(1∶2000稀釋)、GSK-3β(1∶2000稀釋)和β-actin(1∶2000稀釋)一抗在4 ℃孵育過夜。然后將膜與山羊抗兔IgG H&L(HRP)二抗(1:1000稀釋)室溫孵育1 h?？贵w均購自英國Abcam公司。使用增強化學發(fā)光(ECL)底物試劑盒(美國Thermo Fisher公司)顯影。在Image J軟件上分析蛋白質(zhì)條帶的灰度值。β-actin作為內(nèi)參蛋白。

1.5 HE染色觀察家兔股骨頭組織切片形態(tài) 取股骨頭用0.9%氯化鈉沖洗,脫鈣,切成5 mm厚的石蠟切片。進行蘇木精-伊紅(HE)染色(碧云天生物技術(shù)研究所),顯微鏡下觀察切片。隨機選取10個高倍視野,每個視野計數(shù)50個骨陷窩。用空骨陷窩數(shù)除以總骨陷窩數(shù)來計算空骨陷窩的比率。

1.6 骨密度分析系統(tǒng)(QCT PROV 6.1)測量家兔股骨頭的骨密度 采用荷蘭飛利浦 Incisive 64 排CT掃描后,應(yīng)用曼德思維軟件公司的骨密度分析系統(tǒng)(QCT PRO V6.1)測定并分析骨密度(BMD)。

2 結(jié)果

2.1 4組家兔的一般情況 本研究過程中無家兔死亡。A組家兔精神萎靡不振,行動遲緩,皮毛無光澤,皮下脂肪減少,彈跳能力降低。B、C和D組家兔精神狀態(tài)較A組改善,活動靈敏度增加,皮毛呈現(xiàn)光澤,其中D組家兔的一般情況優(yōu)于其他組。

2.2 4組家兔股骨頭組織病理學形態(tài) HE染色結(jié)果顯示,A組出現(xiàn)典型的骨壞死,壞死區(qū)域位于松質(zhì)骨和軟骨下區(qū)域,骨髓結(jié)構(gòu)紊亂,骨髓細胞壞死,碎片聚集,普遍觀察到脂肪生成,脂肪細胞數(shù)量和大小增高,骨小梁變薄,可見大量空隙;與A組相比,B、C和D組骨髓結(jié)構(gòu)紊亂較輕,骨小梁增厚,可見藍染的再生軟骨,空隙較少,脂肪細胞數(shù)量減少,空腔數(shù)量減少;與B、C組比較,D組骨小梁排列較整齊,骨髓中觀察到大量微血管的形成,可見明顯成骨,且壞死區(qū)基本被修復,見圖3。4組空骨陷窩的比率比較差異有統(tǒng)計學意義(F=58.475,P<0.001);與A組相比,B、C和D組家兔股骨頭空骨陷窩的比率均降低(P<0.05);D組家兔股骨頭空骨陷窩的比率小于B、C組(P<0.05),見圖4。

圖3 股骨頭組織蘇木精伊紅(HE)染色圖(400×)

圖4 4組空骨陷窩的比率

2.3 4組家兔股骨頭骨密度比較 4組家兔股骨頭的骨密度比較差異有統(tǒng)計學意義(F=98.524,P<0.001);與A組相比,B、C和D組家兔股骨頭的骨密度均顯著升高(P<0.05);D組家兔股骨頭的骨密度顯著高于B、C組(P<0.05),見圖5。

圖5 4組的骨密度

2.4 4組家兔的股骨頭組織中VEGF、Collagen I、RUNX2和OCN蛋白表達水平比較 Western blot結(jié)果顯示,4組家兔的股骨頭組織中VEGF、Collagen I、RUNX2和OCN蛋白表達水平比較差異有統(tǒng)計學意義(F分別為92.706、48.725、39.251、50.263,均P<0.05);與A組相比,B、C和D組股骨頭組織中VEGF、Collagen I、RUNX2和OCN的蛋白表達水平均升高(P<0.05);D組VEGF、Collagen I、RUNX2和OCN的蛋白表達水平均高于B、C組(P<0.05),見圖6。

圖6 4組股骨頭組織中VEGF、Collagen I、RUNX2和OCN的表達

2.5 4組家兔的股骨頭組織中Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)蛋白的表達水平比較 Western blot結(jié)果顯示,4組家兔的股骨頭組織中Wnt-3a、β-catenin和GSK-3β的蛋白表達比較差異有統(tǒng)計學意義(F分別為138.292、395.503、223.654,均P<0.05);與A組相比,B、C和D組股骨頭組織中Wnt-3a和β-catenin的蛋白表達水平均顯著升高,GSK-3β降低(P<0.05);D組Wnt-3a和β-catenin的蛋白表達水平均顯著高于B、C組,GSK-3β低于B、C組(P<0.05),見圖7。

圖7 4組股骨頭組織中Wnt-3a、β-catenin和GSK-3β的表達

3 討論

在股骨頭壞死早期機械性破壞發(fā)生前,通過髓芯減壓同時去除壞死骨組織已經(jīng)成為一種廣泛認可的治療方法[6]。然而,髓芯減壓所形成的空腔,通常需要植骨來完成。膠原基骨修復材料是利用仿生原理由低結(jié)晶度納米級羥基磷灰石與膠原通過物理方法自組裝而成,該成分與天然骨的成分幾乎完成吻合。膠原基骨修復材料具有誘導骨髓間充質(zhì)干細胞向成骨細胞分化的能力及無免疫原性、可降解、易塑形等特性,在骨修復過程中起骨誘導,加快骨愈合的作用。

VEGF能作用于血管內(nèi)皮細胞并促進其增殖和血管生成[14]。血管再生參與骨形成和骨改建過程[15-16]。骨折愈合過程中,血管再生可促進新骨形成[17]。Gerber等[18]研究表明阻斷內(nèi)源性VEGF活性,骨形成與骨吸收就停止。Midy等[19]報道,VEGF能直接刺激成骨細胞堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)活性,并促進成骨細胞的遷移與分化。膠原基骨修復材料有以下優(yōu)勢:①通過生物酶定向酶切技術(shù),產(chǎn)品無任何排異發(fā)生。②具有貫通性良好的孔隙率和多尺度孔徑,可充分保證血液在其中的流動以及細胞的遷徙與附著。③能夠提高自體誘導的效果和材料在骨重建中的再利用。④參與骨重建的過程完全與機體自身的骨愈合周期吻合,能確保骨組織按人體自身實際需要準確地完成全部自誘導過程,不出現(xiàn)異常刺激。⑤可任意塑形,根據(jù)需要無縫隙完成填充,不遺留殘腔。⑥作為水溶性(非油性)可塑型材料,具有更高的安全性。本課題組采用了一種髓芯減壓聯(lián)合VEGF與膠原基骨移植材料的綜合療法來治療無水乙醇骨內(nèi)注射誘導的兔股骨頭壞死模型,結(jié)果顯示,髓芯減壓聯(lián)合VEGF與膠原基骨移植材料治療12周后的家兔身體狀態(tài)最佳,股骨頭組織病理學改變明顯減輕,股骨頭骨密度最高,壞死區(qū)域基本被修復,治療效果顯著優(yōu)于髓芯減壓+自體松質(zhì)骨組和髓芯減壓+膠原基骨修復材料組。說明髓芯減壓聯(lián)合VEGF與膠原基骨移植材料是治療股骨頭壞死的潛在高效療法,原因可能與膠原基骨修復材料的骨誘導活性以及VEGF的促血管生成活性有密切的關(guān)系。

Collagen I、RUNX2和OCN均是與骨形成和骨重塑密切相關(guān)的蛋白質(zhì),Collagen I可影響成骨細胞的功能,參與調(diào)節(jié)人骨髓間充質(zhì)干細胞骨向分化[20]。RUNX2調(diào)節(jié)成骨細胞、間充質(zhì)干細胞中的相關(guān)成骨基因的轉(zhuǎn)錄、翻譯和定向分化[21]。OCN是一種促進骨形成和礦化的骨基質(zhì)蛋白[22]。本研究檢測了4組家兔的股骨頭組織中Collagen I、RUNX2和OCN的表達水平,結(jié)果顯示,髓芯減壓聯(lián)合VEGF與膠原基骨移植材料最大限度的升高了股骨頭組織中Collagen I、RUNX2和OCN的表達水平,提示骨形成蛋白的高表達也是該療法發(fā)揮作用的機制之一。

Wnt/β-catenin信號通路是骨穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑,該通路的激活可促進骨形成[23]。據(jù)報道,股骨頭缺血性壞死中Wnt/β-catenin信號通路被抑制[24]。Wnt/β-catenin信號通路的激活可促進成骨[25]。本研究結(jié)果顯示,髓芯減壓聯(lián)合VEGF與膠原基骨移植材料最大限度地激活了Wnt/β-catenin信號通路。

4 結(jié)論

應(yīng)用髓芯減壓聯(lián)合VEGF與膠原基骨移植材料治療家兔股骨頭壞死具有良好的效果,可有效促進壞死股骨頭的修復,提高骨密度及成骨蛋白的表達,該治療方法可能是治療股骨頭壞死的新型高效療法,具有較高的臨床研究價值。