新型冠狀病毒感染治療藥物研究進(jìn)展

朱峻良，戴權(quán)，朱韌，龍思會(huì)*，余文穎

（1. 中國(guó)藥科大學(xué)江蘇省生物活性天然產(chǎn)物研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京210009；2. 武漢工程大學(xué)化工與制藥學(xué)院綠色化工過(guò)程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430205）

1 引言

自2007年頒布了管理全球衛(wèi)生應(yīng)急措施的《國(guó)際衛(wèi)生條例》以來(lái)，世界衛(wèi)生組織（WHO）共宣布了6次“國(guó)際公共衛(wèi)生緊急事件”，其均由RNA病毒引起。冠狀病毒也屬于RNA病毒，具有較高的變異能力，目前有7種能感染人的冠狀病毒，分別為人冠狀病毒229E（hCoV-229E）、人冠狀病毒NL63（hCoV-NL63）、人冠狀病毒OC43（hCoV-OC43）、人冠狀病毒HKUI1（hCoV-HKUI1）、嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒（SARS-CoV）、中東呼吸綜合征病毒（MERS-CoV）和嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（也稱新型冠狀病毒、SARS-CoV-2）。其中SARS-CoV、MERS-CoV和SARS-CoV-2對(duì)人類(lèi)危害較大，且造成的并發(fā)癥嚴(yán)重威脅人類(lèi)的生命安全，此次新型冠狀病毒感染（COVID-19）疫情便是由SARS-CoV-2引起[1]。

自COVID-19疫情發(fā)生以來(lái)，世界各國(guó)人民的生命安全遭受到嚴(yán)重威脅，SARS-CoV-2經(jīng)過(guò)多次突變，現(xiàn)流行的突變株已逐漸成為奧密克戎變種的亞型XXB.1.16和XBB.1.5，與之前的突變株相比，其具備傳播速度更快和免疫逃逸能力更強(qiáng)的特點(diǎn)。

2023年5月8日，國(guó)務(wù)院聯(lián)防聯(lián)控機(jī)制召開(kāi)新聞發(fā)布會(huì)，介紹了COVID-19疫情不再構(gòu)成“國(guó)際關(guān)注的突發(fā)公共衛(wèi)生事件”后的防控工作。雖然COVID-19疫情不再構(gòu)成“國(guó)際關(guān)注的突發(fā)公共衛(wèi)生事件”，但并不意味著COVID-19疫情作為全球健康威脅已經(jīng)結(jié)束，病毒正在不斷變異，疾病危害仍然存在；我們需要高度關(guān)注高齡老人，以及沒(méi)有接種疫苗的、有基礎(chǔ)病的人群，因?yàn)檫@類(lèi)人群還沒(méi)有脫離首次或二次感染后進(jìn)展為重癥的風(fēng)險(xiǎn)。

回首過(guò)去，人類(lèi)與RNA病毒進(jìn)行了幾十年的抗?fàn)帲涣⒆憬袢?，SARS-CoV-2對(duì)我們的威脅逐漸消散，但似乎是病毒自身的不斷變異，促使人類(lèi)擁有了相對(duì)的免疫力，從而贏得暫時(shí)的勝利；展望未來(lái)，面對(duì)下一次與RNA病毒的抗?fàn)帲覀兡芊窀鶕?jù)以往經(jīng)驗(yàn)，設(shè)計(jì)出能夠治療病毒感染的有效藥物？因此，對(duì)COVID-19治療藥物的研發(fā)不應(yīng)停止，反而需要更進(jìn)一步的探索，從而啟示未來(lái)的抗病毒藥物研發(fā)，讓人類(lèi)能夠真正地戰(zhàn)勝RNA病毒。

本文介紹了SARS-CoV-2感染機(jī)制，并綜述了在研的COVID-19治療藥物研究進(jìn)展，旨在為相關(guān)新藥的進(jìn)一步研發(fā)提供參考。

2 SARS-CoV-2感染機(jī)制

SARS-CoV-2感染主要是由病毒刺突蛋白（spike protein，S蛋白）的S1亞基與血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2（ACE2）結(jié)合引起的內(nèi)吞過(guò)程（見(jiàn)圖1）[2]。SARS-CoV-2的S蛋白擁有一個(gè)獨(dú)特的S1/S2弗林蛋白酶（furin）可識(shí)別位點(diǎn)，在S1亞基與ACE2結(jié)合后的融合過(guò)程中起著關(guān)鍵作用[3]。S1亞基與ACE2結(jié)合后，S蛋白融合體需要用蛋白酶如呋喃酶、胰蛋白酶和跨膜絲氨酸蛋白酶2（TMPRSS2）進(jìn)行裂解，以促進(jìn)膜融合過(guò)程[4]。在病毒進(jìn)入細(xì)胞并解除包膜后，SARS-CoV-2在細(xì)胞內(nèi)溶解，將核衣殼蛋白（N蛋白）和病毒基因組RNA釋放到細(xì)胞質(zhì)中，用于翻譯病毒基因組的開(kāi)放閱讀框（ORF1a和ORF1b）和合成2種大型復(fù)制酶多聚蛋白（pp1a和pp1ab）[5]。與ORF1b的翻譯規(guī)則相反，pp1a與pp1ab的C端擴(kuò)展形式是通過(guò)核糖體移碼產(chǎn)生的，翻譯的核糖體從ORF1a閱讀框轉(zhuǎn)移到ORF1b閱讀框[6]。一般認(rèn)為這種核糖體移碼是為了調(diào)節(jié)pp1a和pp1ab的比例[7]。然后，ORF1a編碼的蛋白酶自動(dòng)分解pp1a和pp1ab蛋白，產(chǎn)生16種非結(jié)構(gòu)型蛋白（nsp）。木瓜蛋白酶樣蛋白酶（PLpro）識(shí)別并特異性切割pp1a或pp1ab的裂解位點(diǎn)Nsp1/2、Nsp2/3和Nsp3/4，產(chǎn)生nsp1 ～4[8]，其余的裂解位點(diǎn)由3C樣蛋白酶（3CLpro或Mpro）識(shí)別并切割，產(chǎn)生nsp5 ～ 16[9]。RNA依賴性RNA聚合酶（RdRp，也稱nsp12）和解旋酶（nsp13）一起形成復(fù)制-轉(zhuǎn)錄復(fù)合物（RTC）。RTC的形成有利于冠狀病毒的復(fù)制和亞基因組RNA的合成，這套亞基因組RNA編碼了幾種結(jié)構(gòu)和附屬蛋白[10]。RTC的疏水結(jié)構(gòu)域附著在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的限制膜上，從而產(chǎn)生冠狀病毒復(fù)制結(jié)構(gòu)[11]。然后，全長(zhǎng)的正鏈基因組RNA被轉(zhuǎn)錄成全長(zhǎng)的負(fù)鏈模板以合成新的基因組RNA，同時(shí)合成重疊的亞基因組負(fù)鏈模板。亞基因組mRNA隨后被合成，并翻譯產(chǎn)生4個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白和6個(gè)附屬蛋白[12]。翻譯之后，病毒組裝迅速進(jìn)行，膜蛋白（M蛋白）、包膜蛋白（E蛋白）和S蛋白插入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。這些蛋白沿著分泌途徑遷移到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-高爾基體中間室后，與核衣殼和基因組RNA組裝形成的螺旋狀核衣殼多聚體相互作用而形成成熟的病毒顆粒。最后，含有病毒的囊泡與質(zhì)膜融合，通過(guò)細(xì)胞外滲釋放[13]。

圖1 SARS-CoV-2感染宿主細(xì)胞的機(jī)制Figure 1 Mechanisms by which SARS-CoV-2 infects host cells

S蛋白的中和抗體可阻斷S蛋白受體結(jié)合域（RBD）與ACE2結(jié)合，阻止病毒感染[14]。TMPRSS2已被證明參與病毒入侵過(guò)程，靶向該蛋白的藥物可能是抑制病毒進(jìn)入的有效方案[15]。Mpro和PLpro是pp1a和pp1ab轉(zhuǎn)化為nsp的關(guān)鍵蛋白酶，因此對(duì)病毒復(fù)制十分重要；另外，PLpro的結(jié)構(gòu)類(lèi)似于人體的去泛素化蛋白酶，其介導(dǎo)抗病毒蛋白去泛素化和去泛素樣蛋白15（ISG15）化，從而誘導(dǎo)人巨噬細(xì)胞分泌ISG15，而細(xì)胞外非偶聯(lián)的ISG15可發(fā)揮細(xì)胞因子樣作用，反饋性地刺激巨噬細(xì)胞，加劇新冠病毒引發(fā)巨噬細(xì)胞釋放大量炎癥細(xì)胞因子、誘導(dǎo)炎癥損害，故PLpro亦是新冠病毒影響宿主固有免疫的關(guān)鍵。因此，抑制該靶點(diǎn)有兩方面作用，一是抑制病毒復(fù)制，二是抑制病毒引起的炎癥，解除病毒對(duì)宿主的免疫干擾作用。

3 可作用于病毒靶標(biāo)的藥物

3.1 RNA依賴性RNA聚合酶抑制劑

RdRp與RNA合成密切相關(guān)，由于其明確的作用機(jī)制和高度保守的特點(diǎn)，能夠?yàn)樗幬镩_(kāi)發(fā)帶來(lái)兩大潛在益處：一方面，能夠開(kāi)發(fā)出有效的RdRp抑制劑，不懼新冠病毒突變；另一方面，參照過(guò)往抗病毒藥物研發(fā)歷程，不少具有RdRp靶向作用的老藥或許能夠用于COVID-19治療，極大地縮短研發(fā)周期。因此，RdRp一直是抗RNA病毒藥物研發(fā)的熱門(mén)靶點(diǎn)[16]。

疫情初期，為了第一時(shí)間發(fā)現(xiàn)能用于治療COVID-19的藥物，老藥新用成為首選的策略。由于藥物的開(kāi)發(fā)過(guò)程漫長(zhǎng)而代價(jià)高昂，重新利用已知藥物治療COVID-19是公認(rèn)的一種快速而有效的方法[17]。許多用于抗SARS-CoV和MERS-CoV的已上市或在研藥物及其他FDA批準(zhǔn)的抗病毒藥物都被用于抗SARS-CoV-2的研究，盡管取得了一定的進(jìn)展，但仍需要足夠的臨床數(shù)據(jù)來(lái)確定其是否真正具有治療COVID-19的功效[18]。

瑞德西韋（remdesivir）是抗SARS-CoV-2藥物研發(fā)中老藥新用的一個(gè)案例，該藥由吉利德科學(xué)公司開(kāi)發(fā)，用于治療埃博拉病毒病和馬爾堡病毒感染，后來(lái)研究人員發(fā)現(xiàn)其對(duì)SARS-CoV-2也有很好的療效。瑞德西韋于2020年10月22日成為第一個(gè)獲得FDA批準(zhǔn)的用于緊急治療COVID-19的藥物，通過(guò)干擾RdRp來(lái)發(fā)揮抗病毒作用[19]，其給藥方式為靜脈注射。瑞德西韋在SARS-CoV-2感染的Vero E6細(xì)胞系中的半數(shù)最大有效濃度（EC50）為6.6 μmol ·L-1，半數(shù)細(xì)胞毒性濃度（CC50）大于100 μmol · L-1，選擇性指數(shù)（SI）為15。在SARS-CoV-2感染的Calu-3細(xì)胞中，EC50為0.42 μmol · L-1，EC90為1.08 μmol · L-1[20]。然而多項(xiàng)臨床研究表明，瑞德西韋對(duì)總體死亡率、機(jī)械通氣時(shí)間和住院時(shí)間沒(méi)有影響[21]。

由默沙東公司開(kāi)發(fā)的molnupiravir（EIDD-2801/MK4482），于2021年11月4日獲英國(guó)藥監(jiān)局批準(zhǔn)上市，成為全球第一款獲批用于治療成人輕度至中度COVID-19的口服藥物。該藥物是一種核糖核苷類(lèi)似物，通過(guò)抑制RdRp而顯示出強(qiáng)大的抗SARSCoV-2活性[22]。Ⅰ期臨床試驗(yàn)表明，molnupiravir作為一種新型口服抗病毒藥物，在健康受試者中有很好的耐受性和安全性[23]。在Ⅱ期臨床試驗(yàn)中，輕度至中度COVID-19患者接受為期5 d的molnupiravir治療，結(jié)果表明該藥可降低SARS-CoV-2的轉(zhuǎn)錄并成功阻止SARS-CoV-2的復(fù)制和COVID-19的進(jìn)展[24]。Ⅲ期臨床試驗(yàn)結(jié)果顯示，molnupiravir治療組患者的重癥/病死率降低了50%[25]。該藥已于2022年12月30日在我國(guó)獲批。

阿茲夫定（azvudine，F(xiàn)NC）片是我國(guó)自主研發(fā)的口服小分子COVID-19治療藥物。該藥由鄭州大學(xué)?？?biāo)教授等人研發(fā)，通過(guò)抑制RdRp而抑制SARSCoV-2在體內(nèi)的復(fù)制。一項(xiàng)臨床試驗(yàn)表明，阿茲夫定有助于患者更快康復(fù)，縮短核酸轉(zhuǎn)陰時(shí)間[26]。另一項(xiàng)臨床研究表明，阿茲夫定幾乎治愈了所有的COVID-19患者，并顯示出比瑞德西韋更好的治療效果[27]。2022年7月25日，國(guó)家藥品監(jiān)督管理局應(yīng)急附條件批準(zhǔn)阿茲夫定片新增適應(yīng)證，用于治療普通型COVID-19成年患者。

由我國(guó)創(chuàng)新藥企君實(shí)生物研發(fā)的口服抗病毒藥物VV116，通過(guò)其核苷三磷酸形式靶向病毒RdRp而發(fā)揮作用，于2021年11月在烏茲別克斯坦獲批用于治療COVID-19患者。該藥在SARS-CoV-2感染的Vero E6細(xì)胞系中的IC50為0.67±0.24 μmol · L-1，EC50為0.39 μmol · L-1，并且可以明顯減少感染小鼠體內(nèi)的病毒滴度，改善炎癥[28]。Ⅰ期臨床試驗(yàn)表明，VV116在健康受試者中表現(xiàn)出良好的安全性和耐受性[29]。該藥已于2023年1月29日在我國(guó)獲批用于治療輕中度COVID-19患者。

Sch?fer等[30]研發(fā)了一種RdRp抑制劑GS-621763，其被證實(shí)在SARS-CoV-2感染的細(xì)胞系和人類(lèi)原代細(xì)胞培養(yǎng)物中具有抗SARS-CoV-2活性，且呈劑量依賴性抑制病毒復(fù)制。

3.2 3C樣蛋白酶抑制劑與木瓜蛋白酶樣蛋白酶抑制劑

在所有冠狀病毒中，PLpro和3CLpro對(duì)于從pp1a和pp1ab的氨基末端釋放幾種nsp非常關(guān)鍵，故這2種蛋白酶對(duì)SARS-CoV-2的復(fù)制和翻譯都至關(guān)重要。

3.2.1 3C樣蛋白酶抑制劑 由輝瑞研發(fā)的復(fù)方制劑Paxlovid，每粒由300 mg nirmatrelvir（PF-07321332）和100 mg利托那韋（ritonavir）組成。Nirmatrelvir是一種3CLpro的強(qiáng)效抑制劑，能有效抑制SARSCoV-2與相關(guān)變異株以及其他冠狀病毒的體外復(fù)制，可治愈感染了SARS-CoV-2 貝塔或德?tīng)査儺愔甑慕饌}(cāng)鼠[31]。Paxlovid于2021年12月獲得美國(guó)FDA的緊急使用授權(quán)，截至目前，已在全球10個(gè)國(guó)家被批準(zhǔn)或被授權(quán)緊急使用。與安慰劑相比，癥狀出現(xiàn)后3和5 d內(nèi)啟動(dòng)Paxlovid治療，可分別將住院或死亡風(fēng)險(xiǎn)降低89%和88%[32]。

由日本鹽野義制藥（Shionogi）開(kāi)發(fā)的S-217622是一種口服非共價(jià)、非肽的3CLpro抑制劑的臨床候選藥物。該藥在感染SARS-CoV-2的小鼠中顯示了出色的口服生物利用度和顯著的療效[32]。Ⅱ期臨床試驗(yàn)結(jié)果顯示，連續(xù)服用S-2176223 d，80%的受試者其SARS-CoV-2檢測(cè)呈陰性；連續(xù)服藥5 d后，100%的受試者其體內(nèi)SARS-CoV-2完全消失[33-34]。

除了以上已經(jīng)完成臨床試驗(yàn)或正在進(jìn)行臨床研究的藥物，還有多個(gè)候選化合物取得了不同程度的進(jìn)展。例如：Rathnayake等[35]研發(fā)的GC376及其衍生物為SARS-CoV-2的3CLpro抑制劑，在Vero E6細(xì)胞系和小鼠模型中均可發(fā)揮抗病毒作用，是一種潛在的抗SARS-CoV-2藥物；Jin等[36]研發(fā)的3CLpro抑制劑卡莫氟（carmofur），其脲基可與3CLpro活性位點(diǎn)中的Cys145共價(jià)結(jié)合，共價(jià)結(jié)合后其脂肪側(cè)鏈將占據(jù)疏水性S2亞位點(diǎn)；Hasnain團(tuán)隊(duì)研發(fā)了依布硒（ebselen）及其衍生物，并探索了該類(lèi)化合物與3CLpro的結(jié)合模式，結(jié)果表明這些化合物對(duì)SARS-CoV-2具有潛在抑制作用[37]。

3.2.2 木瓜蛋白酶樣蛋白酶抑制劑 PLpro是pp1a和pp1ab轉(zhuǎn)化為nsp的關(guān)鍵蛋白酶，對(duì)病毒復(fù)制十分關(guān)鍵；另外，PLpro的結(jié)構(gòu)類(lèi)似于人體的去泛素化蛋白酶，還可以從信號(hào)蛋白中去除宿主泛素和ISG15以抑制先天免疫反應(yīng)，因此，抑制該靶點(diǎn)不僅可以抑制病毒復(fù)制，還可抑制病毒引起的炎癥，解除病毒對(duì)宿主的免疫干擾作用。

3.3 解旋酶抑制劑

nsp13是由病毒基因組編碼的具備5'-3'定向解旋酶、ATP酶和RNA 5'-三磷酸酶活性[39]的多功能蛋白質(zhì)，其與其他nsp協(xié)同組裝成復(fù)制轉(zhuǎn)錄復(fù)合物，從而參與病毒RNA的復(fù)制與轉(zhuǎn)錄[40-43]，是病毒基因組復(fù)制與轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵[44]；另外，nsp13還具備高度保守的特點(diǎn)，SARS-CoV和SARS-CoV-2的nsp13之間只有單一的氨基酸差異，故其被認(rèn)為可能是抗COVID-19的一個(gè)很有前景的靶點(diǎn)。針對(duì)該靶點(diǎn)報(bào)道的抑制劑主要有巴拿寧、5-羥基色酮衍生物[45-46]和SSY A10-001[47]，其體外細(xì)胞活性均在微摩爾級(jí)范圍，然而由于這些抑制劑可與ATP競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合位點(diǎn)，故也能與體內(nèi)其他具備ATP酶活性的酶結(jié)構(gòu)域進(jìn)行結(jié)合而產(chǎn)生副作用，如何得到選擇性良好和活性更佳的抑制劑是該靶點(diǎn)相關(guān)藥物研發(fā)所面臨的一大挑戰(zhàn)。

3.4 結(jié)構(gòu)蛋白抑制劑

S蛋白是位于病毒表面，形狀類(lèi)似皇冠的結(jié)構(gòu)蛋白，以三聚體形態(tài)存在，在病毒感染的初始過(guò)程中發(fā)揮極其重要的作用。其能被宿主細(xì)胞表面的ACE2受體識(shí)別并結(jié)合，進(jìn)而完成病毒附著過(guò)程。然而，由于編碼該蛋白的基因組很容易受到環(huán)境的壓力而發(fā)生變異，極大地升高了藥物研發(fā)的失敗率，故針對(duì)該靶點(diǎn)的小分子藥物研發(fā)并不多，但其卻是疫苗和抗體藥物研發(fā)的熱點(diǎn)[17]。

E蛋白是新冠病毒中最小的，也是人們最不了解的一種結(jié)構(gòu)蛋白，它在不同的病毒亞型中高度保守。研究尚未完全闡明E蛋白在病毒入侵、復(fù)制和釋放中的作用。病毒顆粒包膜中的E蛋白通過(guò)與其他結(jié)構(gòu)蛋白相互結(jié)合而發(fā)揮作用。E蛋白和M蛋白相互作用，維持病毒顆粒的形狀并促進(jìn)其釋放[48-49]。缺乏E蛋白會(huì)顯著降低病毒滴度和子代病毒的成熟度，甚至產(chǎn)生無(wú)感染功能的子代病毒[50]，這表明E蛋白在病毒產(chǎn)生和成熟中的重要性。針對(duì)該靶點(diǎn)的抑制劑有hexamethylene amiloride（HMA）和amantadine（AMT）及兩者組合物，HMA和AMT是廣泛的病毒通道蛋白抑制劑，除了對(duì)冠狀病毒有作用外，它們對(duì)HIV、雞傳染性支氣管炎病毒（IBV）和小鼠肝炎病毒（MHV）也有良好的抑制作用[51-53]。

M蛋白是SARS-CoV-2中含量最多的結(jié)構(gòu)蛋白[54]，具有3個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，屬于跨膜蛋白[55]，其能與E蛋白、S蛋白、N蛋白穩(wěn)定結(jié)合以促進(jìn)SARS-CoV-2核心結(jié)構(gòu)的組裝[56]。

N蛋白主要功能是將病毒基因組RNA包裝成長(zhǎng)螺旋核糖核酸（RNP）復(fù)合物，并通過(guò)與M蛋白相互作用而參與病毒粒子的組裝[57]。N蛋白參與冠狀病毒復(fù)制周期和宿主細(xì)胞對(duì)病毒感染的反應(yīng)[58]，因此，它也是COVID-19藥物研發(fā)的潛在靶點(diǎn)。相關(guān)化合物根據(jù)作用機(jī)制可以分為以下兩類(lèi)。一類(lèi)為直接抑制RNA與N蛋白的結(jié)合從而阻止RNP的形成。到目前為止，已經(jīng)有一些針對(duì)其他冠狀病毒的小分子化合物通過(guò)虛擬篩選被認(rèn)為是SARS-CoV-2的候選抑制劑，例如靶向RNA結(jié)合位點(diǎn)、可抑制hCoV-OC43復(fù)制的化合物PJ34和H3[59]。另一類(lèi)為阻斷正常N蛋白寡聚化或觸發(fā)異常RNP形成。我國(guó)臺(tái)灣省中興大學(xué)的候明宏團(tuán)隊(duì)通過(guò)虛擬篩選得到的5-芐基氧代精氨酸（化合物代號(hào)：P3）是一種新型的MERS-CoV抑制劑，該化合物可介導(dǎo)MERS-CoV N蛋白中的N末端域（N-NTD）非天然二聚化并誘導(dǎo)N蛋白聚集。基于結(jié)構(gòu)的研究表明，P3靶向N-NTD間相互結(jié)合的界面，并同時(shí)與兩種N-NTD原聚體中的疏水口袋相互作用[60]。然而這兩類(lèi)小分子抑制劑對(duì)SARS-CoV-2是否有效還有待進(jìn)一步研究。

4 可作用于宿主細(xì)胞靶標(biāo)的藥物

4.1 血管緊張素轉(zhuǎn)化酶-2抑制劑

ACE2是一種羧肽酶，全長(zhǎng)805個(gè)氨基酸，它能從底物的C末端去除一個(gè)氨基酸。作為腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)的組成部分，ACE2在正常生理學(xué)中的主要作用是將腎素和ACE產(chǎn)生的血管緊張素Ⅰ和血管緊張素Ⅱ分別轉(zhuǎn)化為血管緊張素1-9和血管緊張素1-7。在病毒感染過(guò)程中，ACE2通過(guò)識(shí)別并結(jié)合SARS-CoV-2表面的S蛋白而使病毒蛋白附著在細(xì)胞表面，進(jìn)一步通過(guò)膜融合進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，是病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞的關(guān)鍵靶點(diǎn)。然而有趣的是，ACE2的催化活性對(duì)于病毒的結(jié)合并不是必需的，并且催化口袋也不是與病毒的結(jié)合位點(diǎn)，因此，ACE2催化位點(diǎn)的傳統(tǒng)小分子抑制劑不能阻斷SARS-CoV-2的感染[61]。有專家提出模擬人ACE2設(shè)計(jì)出可溶性重組ACE2蛋白競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合S蛋白，以阻斷新冠病毒S蛋白與宿主ACE2的結(jié)合，從而達(dá)到治療目的。然而，截至目前，還沒(méi)有此類(lèi)分子作為抗SARS-CoV-2感染候選藥物進(jìn)入臨床試驗(yàn)。

4.2 跨膜絲氨酸蛋白酶2抑制劑

TMPRSS2是一種具有絲氨酸蛋白酶活性的Ⅱ型跨膜蛋白，其主要生理作用和底物特異性尚未明確。盡管如此，它在呼吸道病毒感染中的作用，特別是對(duì)SARS-CoV的作用已經(jīng)得到了很好的證實(shí)[62-64]。在SARS-CoV-2感染過(guò)程中，病毒S蛋白的S1亞基與ACE2結(jié)合后，弗林蛋白酶將S1-S2的連接處切割，露出S2亞基的S2'位點(diǎn)，該位點(diǎn)可被TMPRSS2或體內(nèi)其他組織蛋白酶識(shí)別并切割，從而激活膜融合過(guò)程。與內(nèi)體其他組織蛋白酶的切割途徑相比，TMPRSS2切割是SARS-CoV-2感染的首選途徑。因此，TMPRSS2抑制劑被認(rèn)為是治療COVID-19的潛在藥物靶點(diǎn)。

開(kāi)拓藥業(yè)（Kintor Pharmaceutical Limited）研發(fā)的普克魯胺（pruxelutamide），可降低ACE2和TMPRSS2的表達(dá)而抑制SARS-CoV-2侵入宿主細(xì)胞。該藥曾在巴拉圭獲得緊急使用授權(quán)，用于中重度住院COVID-19患者。

近年來(lái)，我國(guó)應(yīng)用型本科院校發(fā)展取得了一些成績(jī)。在教育部的指導(dǎo)下，以應(yīng)用技術(shù)大學(xué)為辦學(xué)定位的地方本科院校發(fā)起并成立了應(yīng)用技術(shù)大學(xué)（學(xué)院）聯(lián)盟。截止到2018年6月，已有172所高校加入了該聯(lián)盟。

小分子化合物N-0385由Jean團(tuán)隊(duì)研發(fā)，可通過(guò)抑制TMPRSS2阻止病毒進(jìn)入人體。體內(nèi)與體外研究結(jié)果均表明N-0835具有顯著的治療效果[65]。

4.3 弗林蛋白酶抑制劑

弗林蛋白酶是一種1型膜結(jié)合蛋白酶，其主要功能為切割新冠病毒S1與S2連接處多堿基位點(diǎn)（Arg-Arg-Ala-Arg），釋放出S1亞基，以露出S2亞基的S2'位點(diǎn)，故S1/S2邊界的裂解是S2'位點(diǎn)裂解的前提條件[66]。研究人員對(duì)弗林蛋白酶切割位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)突變，以探究弗林蛋白酶切割位點(diǎn)是否與SARS-CoV-2感染和致病有關(guān)。結(jié)果顯示，與未突變的病毒相比，突變的病毒復(fù)制速度顯著下降[67]，表明弗林蛋白酶切割位點(diǎn)在SARS-CoV-2感染中的關(guān)鍵作用。弗林蛋白酶抑制劑癸酰-RVKR-CMK已被證明能夠有效抑制SARS-CoV-2的感染，然而截至目前，還沒(méi)有任何這種作用機(jī)制的分子進(jìn)入治療COVID-19的臨床試驗(yàn)。

4.4 組織蛋白酶L抑制劑

盡管大部分情況下SARS-CoV-2被TMPRSS2激活，但S2'位點(diǎn)的切割也可以由組織蛋白酶，特別是組織蛋白酶L介導(dǎo)。如果靶細(xì)胞表達(dá)的TMPRSS2不足，或者病毒-ACE2復(fù)合物沒(méi)有遇到TMPRSS2，則與ACE2結(jié)合的病毒通過(guò)網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用內(nèi)化到溶酶體中，S2'位點(diǎn)被組織蛋白酶L切割。設(shè)計(jì)出具有選擇性的組織蛋白酶L抑制劑是抗COVID-19藥物研發(fā)的另一個(gè)思路。Liu團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)出的MPI8可以選擇性抑制SARS-CoV-23CLPro和宿主組織蛋白酶L。因?qū)M織蛋白酶L選擇性較高，故MPI8不僅具有良好的抗病毒活性，且對(duì)宿主細(xì)胞的潛在毒性較低[68]。

5 具有抗SARS-CoV-2活性的化合物研究近況

經(jīng)文獻(xiàn)調(diào)研，具有抗SARS-CoV-2活性的部分化合物的體外和體內(nèi)研究近況見(jiàn)表1，其中大部分化合物抑制活性為微摩爾到納摩爾級(jí)，具有良好的抗病毒活性。

表1 具有抗SARS-CoV-2活性的化合物及其臨床前研究情況Table 1 Compounds with anti-SARS-CoV-2 activity and their preclinical studies

6 結(jié)語(yǔ)與展望

在過(guò)去的幾十年里，出現(xiàn)了3種導(dǎo)致人類(lèi)嚴(yán)重疾病的冠狀病毒：SARS-CoV、MERS-CoV和SARS-CoV-2；未來(lái)，還可能會(huì)有新的病毒出現(xiàn)并威脅人類(lèi)健康。令人備受鼓舞的是，科學(xué)家在SARSCoV-2的傳播與發(fā)病機(jī)制，以及診斷、預(yù)防和治療方面均取得了巨大研究進(jìn)展，并從以往的抗疫工作中吸取了寶貴的經(jīng)驗(yàn)教訓(xùn)。因此，在面對(duì)未來(lái)可能新出現(xiàn)的冠狀病毒疫情時(shí)，不論是對(duì)病毒的生物學(xué)探索還是疫苗和治療方法的開(kāi)發(fā)，都會(huì)以前所未有的速度推進(jìn)。當(dāng)然，目前該領(lǐng)域仍有許多懸而未決的問(wèn)題，例如，是什么原因?qū)е铝薙ARS-CoV-2優(yōu)先進(jìn)行TMPRSS2切割途徑？SARS-CoV-2的變異是否有規(guī)律可循？能否用人工智能等手段預(yù)測(cè)病毒的變異行為，為疫苗和小分子藥物的研發(fā)提前布局？解決這些問(wèn)題可能有助于開(kāi)發(fā)能有效對(duì)抗冠狀病毒的新工具。

筆者所在課題組曾發(fā)現(xiàn)一種可同時(shí)共價(jià)靶向3CLpro和PLpro的活性分子（代號(hào)：LY1），已進(jìn)行了體內(nèi)和體外抗病毒活性和機(jī)制的研究，初期結(jié)果顯示LY1通過(guò)其邁克爾受體位點(diǎn)與3CLpro和PLpro催化活性中心的半胱氨酸殘基以不可逆共價(jià)的方式結(jié)合（見(jiàn)圖2），并且對(duì)病毒蛋白酶的結(jié)合是特異的。LY1對(duì)SARS-CoV-2具有顯著的抗病毒活性，對(duì)3CLpro和PLpro滅活效率良好，急性毒性研究結(jié)果顯示小鼠和大鼠能較好地耐受該活性分子。后續(xù)研究正在進(jìn)行中。

圖2 LY1與3CLpro和PLpro的結(jié)合模式Figure 2 Binding mode of LY1 with 3CLpro and PLpro