牛膝多糖降血糖活性成分的分離鑒定

劉鑠菲， 唐年初， 徐德平

(江南大學 食品學院，江蘇 無錫 214122)

牛膝（Achyranthes bidentata）為多年生草本植物，屬莧科植物，廣泛分布于河南、山東、四川等地[1]。牛膝是保健食品生產(chǎn)原料，在河南焦作一帶用作煲湯滋補佳品[2]，主要成分有多糖、皂苷、蛻皮甾酮、黃酮類和生物堿類等[3-4]，具有多種藥理活性，如消炎鎮(zhèn)痛、抗骨質(zhì)疏松、免疫調(diào)節(jié)等。 現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)牛膝具有降血糖活性[5]，成為中藥降血糖方劑的高頻用藥，牛膝中具有降血糖活性的成分多指向多糖類物質(zhì)，如牛膝粗多糖對血脂代謝的改善作用[6]、牛膝粗多糖對糖尿病模型小鼠和大鼠的降血糖作用[7-8]，以及在高脂飼料中， 隨著牛膝粗多糖添加量的增加，血鸚鵡的血糖含量顯著降低，表現(xiàn)出降血糖作用等[9]，但有關(guān)牛膝多糖構(gòu)成與降血糖活性的關(guān)系鮮有報道。

牛膝多糖的降血糖活性研究不應僅僅局限在粗提物的活性上，應深入研究牛膝多糖降血糖作用的構(gòu)效關(guān)系，為揭示牛膝降血糖機制和開發(fā)利用提供理論依據(jù)。 因此，作者以牛膝為原料，通過水提醇沉法以及多種柱層析手段對牛膝多糖進行提取與純化[10]，結(jié)合動物實驗檢測降血糖活性，篩選出牛膝中具有降血糖活性的多糖，為明確其在糖尿病治療方面的作用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛膝： 購自亳州藥材市場， 經(jīng)鑒定為懷牛膝（Achyranthes bidentata）；硅膠板：山東煙臺芝罘化工廠產(chǎn)品；DEAE-Cellulose 色譜柱、HW-55F 色譜柱、G-5000 PWXL 凝膠柱、G-3000 PWXL 凝膠柱：日本TOSOH 公司產(chǎn)品；Sephacry S-400 色譜柱：美國GE Healthcare 公司產(chǎn) 品；Sephadex G-100 色譜柱： 瑞典Pharmaeia 公司產(chǎn)品； 鏈脲佐菌素（streptozocin，STZ）： 美國Sigma 公司產(chǎn)品 （批號：SLCF1289）；SPF 級雄性ICR 小鼠：浙江維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供 （ 合格證號：20201204Abzz0619000862）； 實驗用水為去離子水；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器

RAT-100 型萃取罐：無錫申科儀器有限公司產(chǎn)品；R-1002 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海申順生物科技有限公司產(chǎn)品；SYB206-100 型恒流泵：天津市科器高新技術(shù)公司產(chǎn)品；UV-2450 型紫外分光光度計： 日本島津公司產(chǎn)品；Avance 500 MHz 型核磁共振儀：美國Bruker 公司產(chǎn)品；Voyager-DE PRO 型質(zhì)譜儀：美國ABI 公司產(chǎn)品；TRACE 1300 型氣相色譜儀：賽默飛世爾科技公司產(chǎn)品；卓越金采型血糖測定儀及試紙：上海羅氏制藥有限公司產(chǎn)品；AU5800 全自動生化分析儀：美國貝克曼庫爾特有限公司產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 牛膝各組分的提取與粗分離 稱取10 kg 牛膝，粉碎后置于100 L 萃取罐中，按照料液比1 g∶10 mL加入體積分數(shù)為75%的乙醇，60 ℃攪拌提取3 h，過濾，取濾液，濾渣按照上述方法重復提取一次，合并兩次濾液進行減壓濃縮得到醇提物。 濾渣繼續(xù)按照料液比1 g∶10 mL 加入去離子水， 相同條件下攪拌提取兩次， 合并濾液減壓濃縮得到牛膝水提液，向水提液中邊攪拌邊加入3 倍體積的無水乙醇，靜置8 h 后過濾得到水提醇沉物和水提醇溶物。

另取500 g 牛膝， 粉碎后置于10 L 萃取罐中，按照料液比1 g∶10 mL 加入體積分數(shù)為75%的乙醇，60 ℃旋轉(zhuǎn)提取3 h，過濾，取出醇提液后，濾渣按照料液比1 g∶10 mL 加入去離子水， 相同條件下得到水提液，將水提液和醇提液合并濃縮至干，即得到牛膝原樣。

1.3.2 牛膝提取物降血糖活性測定

1）STZ 溶液的配制 參照段暉等的方法[11]，準確稱取2.10 g 檸檬酸， 加入100 mL 雙蒸水配成檸檬酸母液，稱為A 液；準確稱取2.94 g 檸檬酸三鈉，加入100 mL 雙蒸水配成檸檬酸鈉母液，稱為B 液。將A、B 液按體積比1.00∶1.32 混合， 用pH 計測定pH，調(diào)溶液pH 為4.0，得到0.1 mol/L 檸檬酸鈉緩沖液。 準確稱取300 mg STZ 溶于30 mL 檸檬酸鈉緩沖液中， 新鮮配制成10 mg/mL 的STZ 溶液， 并用0.22 μm 濾菌器過濾除菌，注意避光配制，現(xiàn)用現(xiàn)配。

2）糖尿病模型的建立與分組 取5 周齡SPF級ICR 雄性健康小鼠80 只， 適應性喂養(yǎng)7 d 后禁食12 h，隨機取70 只小鼠按照150 mg/kg 劑量腹腔注射STZ 溶液， 余下10 只小鼠注射相同劑量的檸檬酸鈉緩沖液，記為空白組。 3 d 后，用血糖儀檢測各組小鼠空腹血糖， 空腹血糖高于11.2 mmol/L 即認為糖尿病模型建造成功[12]。

選造模成功的小鼠50 只，分為模型組、原樣組（A）、水提醇沉組（B）、水提醇溶組（C）、醇提組（D），每組10 只。 分別取適量分離組分用去離子水配制成0.1 g/mL 的樣品溶液，各給藥組按照1.0 g/（kg·d）劑量[13-14]灌胃相應的組分，模型組與空白組則灌胃飲用水，連續(xù)灌胃8 周。

每周記錄一次各組小鼠進食量、飲水量及體質(zhì)量，并對小鼠毛色、尿量、精神狀態(tài)等一般情況進行觀察。 給藥前、給藥第4 周和第8 周測定小鼠空腹血糖。 給藥8 周后，對小鼠摘眼球采血，室溫靜置2 h 后于4 ℃下3 000 r/min 離心15 min 提取血清，用全自動生化分析儀測定HbA1c， 同時取小鼠肝、腎稱質(zhì)量，計算肝臟系數(shù)和腎臟系數(shù)。

1.3.3 水提醇沉組分的分離 取水提醇沉組分，加入適量的去離子水至適宜體積， 上樣至DEAE 柱（5 cm×100 cm），流量恒定為5 mL/min，分別用去離子水和0.05、0.10 mol/L 的NaCl 溶液洗脫， 自動收集器收集洗脫液， 每管10 mL。 采用苯酚硫酸法檢測，根據(jù)洗脫峰分別收集水洗脫液（M）和鹽洗脫液，由于鹽洗脫部分中糖組分極少，不足以支撐后續(xù)的分離，無法進一步研究。

取適量水洗脫液， 濃縮之后上樣到HW-55F（5 cm×150 cm）色譜柱上，用去離子水以5 mL/min的流量洗脫，每管10 mL，收集洗脫液。 采用苯酚硫酸法檢測洗脫組分， 得到洗脫組分M1、M2、M3，經(jīng)多次分離后得到用于動物實驗的各組分的量。

1.3.4 HW-55F 柱水洗脫組分降血糖活性檢測按照1.3.2 的方法建立小鼠糖尿病模型， 測定M1、M2、M3 組分的降血糖活性。

1.3.5 活性組分的純化 將具有降血糖活性的M2組分上樣至Sephacryl S-400 凝膠色譜柱 （3 cm×150 cm），繼續(xù)用去離子水以2 mL/min 的流量洗脫。采用苯酚硫酸法檢測洗脫組分，收集主要組分并反復上此柱分離， 直到洗脫峰為單一對稱峰為止，最后得單一組分N。

1.3.6 多糖N 的純度鑒定 將具有降血糖活性的多糖N 用去離子水配制成質(zhì)量濃度為5 mg/mL 的溶液， 使用紫外分光光度計在波長200~400 nm 進行掃描，檢測其是否含有蛋白質(zhì)吸收峰。 另取適量多糖N 溶液上樣至Sephadex G-100 凝膠色譜柱（3 cm×150 cm）， 用去離子水以2 mL/min 的流量洗脫。 采用苯酚硫酸法測定洗脫液，以確定是否為單一峰。

1.3.7 多糖N 的單糖組成分析 按劉冰等的方法[15]，稱取20 mg 多糖N， 加入2 mL 1 mol/L 的硫酸，在安培管中用沸水浴水解5 h，取出冷卻后，水解液用BaCO3固體中和至pH 為7，離心取上清液備用。

將上述上清液移至具塞試管中，加入10 mg 鹽酸羥胺、適量肌醇和0.5 mL 無水吡啶溶解，加塞，90 ℃恒溫水浴振蕩30 min； 冷卻至室溫后， 加入0.5 mL 乙酸酐，加塞，90 ℃恒溫水浴振蕩30 min，冷卻至室溫，即得單糖乙?；苌铩?取6 種標準單糖：鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖及半乳糖各10 mg，按上述方法制備乙?；苌铩?/p>

將1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）衍生化樣品進行氣相色譜分析， 參數(shù)如下：DB-1701 石英毛細管色譜柱 （0.53 mm×30 m×1.5 μm）； 檢測器：FID（氫火焰離子化檢測器）；柱溫采用程序升溫，起始溫度為120 ℃，停留2 min 后，以10 ℃/min 升溫至195 ℃，停留1 min 后，以3 ℃/min 升溫至240 ℃，停留10 min。

1.3.8 多糖N 的相對分子質(zhì)量測定 從色譜洗脫曲線中可知多糖N 的保留時間較長，說明多糖N 的相對分子質(zhì)量較小，取多糖N 直接進行質(zhì)譜分析[16]，測定相對分子質(zhì)量。

1.3.9 多糖N 的核磁共振測定 多糖N 先進行重水（D2O）交換二次，再以重水為溶劑，進行1H-NMR和13C-NMR 等分析。

1.3.10 數(shù)據(jù)處理 數(shù)據(jù)采用SPSS 26.0 統(tǒng)計學軟件分析，結(jié)果以平均值±標準差表示。 組間比較采用方差齊性檢驗，P＜0.05 為差異顯著。

2 結(jié)果與討論

2.1 牛膝提取物不同組分降血糖活性

與空白組相比，模型小鼠毛發(fā)干枯暗淡、精神不佳、墊料濕臟，出現(xiàn)明顯的“三多一少”癥狀（即多飲、多食、多尿和體質(zhì)量減輕），這是機體在長期高血糖狀態(tài)下的典型表現(xiàn)[17]，主要是因為血糖過高造成滲透性利尿，導致“多尿”，進而引起口渴多飲，又因營養(yǎng)物質(zhì)流失而出現(xiàn)多食卻消瘦的現(xiàn)象。 各組小鼠進食量、飲水量與體質(zhì)量變化見圖1~圖3，前28 d 各給藥組小鼠“三多一少”癥狀與模型組類似，隨著給藥的進行，后28 d 有不同程度的改善，其中B組小鼠“三多一少”癥狀改善最為明顯。

圖1 各組小鼠進食量變化Fig. 1 Changes in food intake of mice in each group

圖2 各組小鼠飲水量變化Fig. 2 Changes in water consumption of mice in each group

圖3 各組小鼠體質(zhì)量變化Fig. 3 Changes in body weight of mice in each group

糖尿病的“三多一少”癥狀，在中醫(yī)理論中被稱作“消渴癥”，由淤血阻絡、熱毒內(nèi)盛、傷陰耗氣等所致，因此選用的治療藥物多為活血化瘀、清熱解毒及補益類中草藥[18]，牛膝也正是因為具有以上功效而被用于治療糖尿病。 根據(jù)小鼠“三多一少”癥狀的定量分析，活性組分主要存在于牛膝水提醇沉物中。

各組小鼠肝臟系數(shù)、腎臟系數(shù)見表1。模型組肝臟系數(shù)和腎臟系數(shù)明顯高于空白組， 異常肥大，A組、B 組和D 組的肝臟系數(shù)和腎臟系數(shù)相比于模型組顯著降低（P＜0.05），與空白組接近，趨于正常，表明牛膝原樣、水提醇沉物和醇提物可緩解糖尿病小鼠肝、腎病理性肥大。 糖尿病小鼠在持續(xù)高血糖狀態(tài)下會出現(xiàn)肝、腎病變，如異常的血脂代謝誘發(fā)肝硬化、脂肪肝等，腎小球基底膜增厚，系膜擴張，出現(xiàn)腎小球硬化和腎小管間質(zhì)性纖維化等病理改變，導致肝臟、腎臟等臟器出現(xiàn)異常肥大[7]。 從各組小鼠肝臟系數(shù)、腎臟系數(shù)的比較結(jié)果上可以看出，牛膝原樣、牛膝水提醇沉物和醇提物均具有緩解臟器肥大的作用。

表1 腎臟系數(shù)和肝臟系數(shù)Table 1 Kidney and liver weight indexs

各組分對小鼠空腹血糖和糖化血紅蛋白的影響見表2。給藥前，模型組小鼠和各給藥組小鼠之間的空腹血糖無顯著性差異， 均高于空白組小鼠，說明糖尿病小鼠造模成功。 在給藥第4 周，與模型組相比，B 組小鼠血糖明顯下降； 在給藥第8 周，B 組小鼠血糖比模型組顯著降低（P＜0.05），具有降血糖作用。A 組小鼠在第8 周仍為高血糖狀態(tài)，與模型組無差異，而牛膝經(jīng)過水提醇沉得到的B 組樣品才表現(xiàn)出降血糖功效，出現(xiàn)這一結(jié)果的原因可能是經(jīng)過提取分離，B 組分富集了降血糖活性成分，故在相同給藥劑量下，B 組表現(xiàn)出優(yōu)于A 組的降血糖效果。

表2 牛膝各組分對小鼠FPG 和HbA1c 的影響（n=10）Table 2 Effects of various components of Achyranthes bidentata on FBG and HbA1c in mice（n=10）

HbA1c 是由紅細胞中的血紅蛋白與血清中的糖類發(fā)生非酶反應所產(chǎn)生的產(chǎn)物，其測定結(jié)果與檢測前是否空腹、是否注射胰島素、是否服用降糖藥物等因素無關(guān)[19]，故比空腹血糖更能準確反應機體血糖水平。 在第8 周時，B 組小鼠的HbA1c 顯著低于模型組（P＜0.05），進一步證明牛膝水提醇沉物具有降血糖效果。

從以上結(jié)果可以看出，牛膝不同組分具有降血糖的作用，其中牛膝醇提物與水提醇沉物均具有緩解糖尿病小鼠臟器病變的效果，水提醇沉物同時具有降血糖活性。

2.2 牛膝水提醇沉組分的分離結(jié)果

牛膝水提醇沉物經(jīng)DEAE 柱分離，其洗脫曲線如圖4 所示。 水洗脫有一個主峰，而NaCl 溶液洗脫只有一個很小的洗脫峰，表明水提醇沉物中多糖主要在水洗脫部分，進一步得出牛膝多糖以中性多糖為主，收集水洗脫物濃縮到適當體積。

圖4 DEAE 纖維素柱洗脫曲線Fig. 4 Elution curve of DEAE cellulose column

將水洗脫物用HW-55F 凝膠色譜柱繼續(xù)用水洗脫分離，其洗脫曲線見圖5。有3 個不同保留時間的洗脫峰，依照洗脫順序分別記為M1、M2、M3。 從保留時間判斷，3 個洗脫組分的相對分子質(zhì)量以M1為最大，M2 介于中間，M3 最小。

圖5 HW-55F 凝膠柱洗脫曲線Fig. 5 Elution curve of HW-55F gel column

2.3 M1、M2、M3 組分降血糖活性檢測

將給藥3 個組分的小鼠分為M1 組、M2 組、M3組，3 個組分對小鼠FPG 和HbA1c 的影響見表3。在給藥第4 周，M2 組小鼠的FPG 呈下降趨勢，在給藥第8 周，M2 組小鼠的FPG 和HbA1c 均顯著低于模型組（P＜0.05），由此可得M2 組分具有降血糖活性，而M1、M3 組分沒有該活性。 牛膝多糖中具有降血糖活性的組分主要為中等相對分子質(zhì)量的M2，而大相對分子質(zhì)量和小相對分子質(zhì)量的組分都沒有該活性。

表3 M1、M2、M3 組分對小鼠FPG 和HbA1c 的影響（n=10）Table 3 Effects of components M1，M2 and M3 on FPG and HbA1c in mice（n=10）

2.4 活性組分的純化

具有降血糖活性的M2 組分反復經(jīng)Sephacryl S-400 凝膠色譜柱純化，直到洗脫峰為單一對稱峰，其洗脫曲線如圖6 所示，結(jié)果表明得到了一個單一多糖，記為N。

圖6 Sephacryl S-400 凝膠柱洗脫曲線Fig. 6 Elution curve of Sephacryl S-400 gel column

2.5 多糖N 的結(jié)構(gòu)分析

2.5.1 純度鑒定 多糖N 經(jīng)過Sephadex G-100（3 cm×150 cm）凝膠色譜柱洗脫，其洗脫曲線如圖7所示。 從圖中看到也為單一對稱峰。 另外，在260~280 nm 下檢測時無紫外吸收峰，表明N 為純多糖。

圖7 Sephadex G-100 凝膠柱洗脫曲線Fig. 7 Elution curve of Sephadex G-100 gel column

2.5.2 單糖組成分析 多糖N 水解經(jīng)乙酰化后氣相色譜結(jié)果只看到一個峰，經(jīng)與標準品對比，與葡萄糖峰一致，說明多糖N 含有葡萄糖殘基。 結(jié)合核磁分析多糖N 含有果糖， 由于酮糖不易進行衍生化，實驗中使用的PMP 柱前衍生化法無法檢測出果糖，而未呈現(xiàn)果糖的色譜峰。

2.5.3 相對分子質(zhì)量測定結(jié)果 多糖N 的質(zhì)譜如圖8 所示，分子離子峰（[M-H]-）質(zhì)荷比為1 800.5，確定該多糖N 相對分子質(zhì)量為1 801.5， 每組系列峰中相鄰兩峰之間的m/z 均相差162， 表明多糖的糖殘基單元為己糖，即多糖N 由11 個糖殘基組成，說明N 的相對分子質(zhì)量較小，這與前面的結(jié)果一致。

圖8 多糖N 的TOF-MS ES 圖譜Fig. 8 TOF-MS ES spectra of polysaccharide N

2.5.4 核磁共振分析 多糖N 為白色無定形粉末， 其1H-NMR 譜、13C-NMR 譜、135DEPT 譜見圖9、圖10、圖11。1H-NMR 圖譜中僅在δ 為5.290 處有一弱信號，為糖上的端基H 信號，δ 為4.780 處是重水殘存的信號峰，δ 為3.371~4.077 處的信號峰為糖上 的 端 基H 信 號。 在13C-NMR 圖 譜 中，δ 為103.037~104.067 處有3 組糖端基的碳信號，而1HNMR 譜無相應的端基H 信號， 說明多糖中是以酮糖為主要組成單元， 結(jié)合135DEPT 譜可見δ 為63.210~59.854 處都是CH2上的碳信號，從化學位移進一步分析得出這些酮糖為果糖，有3 個果糖殘基且都為β 構(gòu)型。 碳譜中還存在一組弱的碳信號，分別 在 δ 為 92.367、76.162、75.066、72.491、70.984、61.141 處，這是一組葡萄糖信號，從δ 為92.367 處的化學位移信號來看，葡萄糖為α-構(gòu)型。從豐度看δ為103.037 處的碳信號與δ 為92.367 處的碳信號接近，可以判斷該果糖殘基與葡萄糖相連，葡萄糖中其他碳并未成鍵，說明葡萄糖是該多糖的起點。δ 為81.007 和80.147 處的碳信號應為果糖C3、C5的碳信號， 果糖之間是以β-1，2 糖苷鍵連接構(gòu)成主鏈，并在C6位上形成側(cè)鏈。 該結(jié)構(gòu)（見圖12）與王昌盛報道的牛膝果聚糖完全一致[20]。

圖9 多糖N 的 1H-NMR 圖譜Fig. 9 1H-NMR spectrum of polysaccharide N

圖10 多糖N 的13C-NMR 圖譜Fig. 10 13C-NMR spectrum of polysaccharide N

圖11 多糖N 的135DEPT 圖譜Fig. 11 135DEPT spectrum of polysaccharide N

圖12 牛膝多糖N 結(jié)構(gòu)式Fig. 12 Structural formula of polysaccharide N from Achyranthes bidentata

3 結(jié) 語

通過STZ 誘導糖尿病小鼠實驗，篩選出牛膝中具有降血糖活性的多糖，并經(jīng)分離純化，鑒定多糖構(gòu)成。

經(jīng)STZ 誘導糖尿病小鼠實驗證明水提醇沉物具有降血糖活性。 水提醇沉物經(jīng)DEAE-Cellulose、HW-55F 分離， 得到相對分子質(zhì)量不同的3 個組分，經(jīng)動物實驗得出中等相對分子質(zhì)量的多糖具有降血糖活性。

作者將該活性組分經(jīng)Sephacryl S-400 凝膠柱進一步純化，得到單一多糖N。在紫外分光光度計下鑒定不含蛋白質(zhì)。經(jīng)Sephadex G-100 凝膠柱鑒定為均一多糖， 經(jīng)質(zhì)譜測定相對分子質(zhì)量為1801.5，該多糖由1 分子葡萄糖和10 分子果糖組成， 以葡萄糖分子為起點，與果糖C2相連，果糖之間以β-1，2糖苷鍵連接形成主鏈，支鏈連接在果糖的C6上。 經(jīng)STZ 誘導糖尿病小鼠實驗證明其具有降血糖活性，是牛膝發(fā)揮降血糖作用的主要成分。