苦蕎對(duì)發(fā)酵豆乳納豆激酶活力、風(fēng)味及抗氧化活性的影響

王淼霜， 仝艷軍， 蔣雨橋， 楊瑞金*1,

（1. 江南大學(xué) 食品科學(xué)與資源挖掘全國重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 江蘇 無錫 214122；2. 江南大學(xué) 食品學(xué)院， 江蘇 無錫 214122）

心腦血管疾?。╟ardiovascular disease，CVD）是造成我國居民死亡的首要病因之一[1]。 從病理上來看， 形成CVD 的主要原因是纖維蛋白在循環(huán)系統(tǒng)的累積。 外源性纖維蛋白溶解酶可有效溶解纖維蛋白并改善血流情況，如尿激酶、鏈激酶、納豆激酶（nattokinase，NK）等[2]。 其中，NK 是近幾十年來的研究熱點(diǎn)，與其他纖維蛋白溶解酶相比，NK 不僅具有成本低、療效好、有效時(shí)間長(zhǎng)、安全性高的特點(diǎn)，還具有多種CVD 的預(yù)防和緩解作用，如抗血栓、抗高血壓、抗動(dòng)脈粥樣硬化、降脂和神經(jīng)保護(hù)等[3]。

目前市場(chǎng)上納豆激酶的主要來源是納豆、納豆激酶膠囊、納豆激酶片劑，但這些產(chǎn)品存在成本高、有異味、吞咽困難等缺點(diǎn)。 關(guān)于納豆的制作分為固態(tài)發(fā)酵和液態(tài)發(fā)酵兩大類。 相比固態(tài)發(fā)酵，液態(tài)發(fā)酵更適用于納豆激酶的大量工業(yè)化生產(chǎn)及提取純化[4-5]。 發(fā)酵豆乳是在液態(tài)豆乳中接種納豆芽孢桿菌，經(jīng)發(fā)酵后獲得的營(yíng)養(yǎng)豐富的發(fā)酵豆制品， 但發(fā)酵豆乳產(chǎn)品刺鼻的“氨臭味”常常使消費(fèi)者望而卻步。

有研究表明“氨臭味”的主要來源為揮發(fā)性鹽基氮和含硫化合物[6]，納豆產(chǎn)品的揮發(fā)性鹽基氮未有國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，但存在相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。 鄭丹妮利用多菌種復(fù)合發(fā)酵低“氨臭味”的納豆，最終產(chǎn)品中揮發(fā)性鹽基氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)為198.66 mg/hg， 酶活力為341.25 U/g[7]。 為了改善納豆的“氨臭味”，許多研究人員從發(fā)酵底物入手進(jìn)行創(chuàng)新。 陳樂樂等在以高蛋白質(zhì)大豆為原料制備納豆過程中加入超甜玉米，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著超甜玉米質(zhì)量分?jǐn)?shù)的提高，納豆激酶活力呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，揮發(fā)性鹽基氮呈現(xiàn)持續(xù)降低的趨勢(shì)；高蛋白質(zhì)大豆和超甜玉米質(zhì)量比為8∶2 時(shí)，納豆的揮發(fā)性鹽基氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)為32.87 mg/g，納豆激酶活力達(dá)到1 134.76 U/g[8]。 張杰等通過糯米與小黃豆復(fù)合發(fā)酵獲得品質(zhì)較好的納豆，結(jié)果表明“氨臭味” 顯著降低， 揮發(fā)性鹽基氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15.41 mg/hg，納豆激酶活力為382.32 U/g[9]。 趙謀明等在納豆菌液態(tài)基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加不同谷物（糙薏仁、玉米、蕎麥、糙米）并采用不同的谷物處理方式探究對(duì)納豆激酶活力的影響，結(jié)果表明采用浸泡蒸煮的方式處理谷物并添加糙米可顯著促進(jìn)納豆菌產(chǎn)納豆激酶[10]。此外，有文獻(xiàn)報(bào)道以糙米作為發(fā)酵底物，采用納豆芽孢桿菌發(fā)酵，總必需氨基酸和脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加， 粗蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)減少，2，2-二苯基-1-苦基肼（DPPH）自由基清除能力顯著增加[11]。由上述報(bào)道可見谷物對(duì)納豆的納豆激酶活力、揮發(fā)性鹽基氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)等方面存在積極影響，在納豆制作方面具有應(yīng)用價(jià)值。

谷物通常具有良好的生物活性[12-16]，比如：苦蕎具有降血脂、抗氧化、增強(qiáng)人體免疫力的作用；燕麥經(jīng)枯草芽孢桿菌發(fā)酵后可提升其蛋白質(zhì)含量。 作者以實(shí)驗(yàn)室前期研究中篩選出的一株高產(chǎn)納豆激酶且產(chǎn)“氨臭味”少的納豆芽孢桿菌JNFE0127 作為發(fā)酵菌株。 通過添加不同谷物（苦蕎、糙米、薏米、藜麥、燕麥粉）探究納豆芽孢桿菌JNFE 0127 產(chǎn)納豆激酶的能力，確定使其產(chǎn)酶量高的谷物種類；然后研究該谷物不同添加量對(duì)納豆芽孢桿菌JNFE 0127發(fā)酵豆乳的納豆激酶活力、風(fēng)味及抗氧化活性的影響。 該研究提高了液態(tài)發(fā)酵豆乳制品的酶活力并改善其風(fēng)味，為產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

納豆芽孢桿菌JNFE 0127 （Bacillus natto JNFE 0127，簡(jiǎn)稱為JNFE 0127）：作者所在實(shí)驗(yàn)室前期篩選并保存；大豆、苦蕎、糙米、薏米、藜麥、燕麥：購自京東商城；牛凝血酶（1 000 U/g）、牛纖維蛋白原：沈陽拜英生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；2，4，6-三吡啶基三嗪（純度98%）、2，2-二苯基-1-苦基肼（純度98%）、5，6-二苯基-3-（2-吡啶基）-1，2，4-三嗪-4，4’-二磺酸單鈉鹽（純度97%）：北京沃凱生物科技有限公司產(chǎn)品；其余試劑均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LE2002E 型分析天平、FE28 型pH 計(jì)：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司產(chǎn)品；LDZX-50KBS 型立式壓力蒸汽滅菌器： 上海申安醫(yī)療器械廠產(chǎn)品；DRP-9082 型電熱恒溫培養(yǎng)箱： 上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司產(chǎn)品；MQD-S3R 型振蕩培養(yǎng)箱：上海旻泉儀器有限公司產(chǎn)品；HH-4 型數(shù)顯恒溫水浴鍋：常州國華電器有限公司產(chǎn)品；UV-1800PC 型紫外可見分光光度計(jì)： 上海美譜達(dá)儀器有限公司產(chǎn)品；Super Mini Dancer 桌面型迷你離心機(jī)：生工生物工程（上海）股份有限公司產(chǎn)品；高速冷凍離心機(jī)：賽默飛世爾科技（上海）有限公司產(chǎn)品；KQ52000DE 型數(shù)控超聲波清洗機(jī)：昆山市超聲儀器有限公司產(chǎn)品；破壁機(jī)： 九陽股份有限公司產(chǎn)品；4500A 型多功能粉碎機(jī)：永昌市展帆工貿(mào)有限公司產(chǎn)品；快速氣相色譜電子鼻：法國Alpha MOS S.A.有限公司產(chǎn)品。

1.3 培養(yǎng)基的配制

LB 固體培養(yǎng)基：胰蛋白胨質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.0%、酵母提取物質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%、氯化鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.0%、瓊脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.0%。

活化培養(yǎng)基：無水葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%、大豆蛋白胨質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.0%、氯化鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%。

基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基：酵母粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.50%、葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.50%、CaCl2質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.02%、NaCl 質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.20%、MgSO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.05%，0.1 mol/L K2HPO4/KH2PO4緩沖液調(diào)pH 至7.2。

發(fā)酵豆乳培養(yǎng)基：大豆粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)11.1%、水質(zhì)量分?jǐn)?shù)89.9%。

1.4 方法

1.4.1 種子發(fā)酵液的制備 將保藏于-80 ℃甘油管中的JNFE 0127 菌液劃線接種到LB 固體培養(yǎng)基上，37 ℃恒溫培養(yǎng)10 h； 分別挑取JNFE 0127 單菌落接種于活化培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min 培養(yǎng)12 h，即為種子發(fā)酵液。

1.4.2 樣品的制備

1）基礎(chǔ)發(fā)酵液的制備 取活化的JNFE 0127種子發(fā)酵液按照體積分?jǐn)?shù)2%接種于基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min 分別培養(yǎng)24、36、48、60、72、96 h。

2）不同谷物發(fā)酵乳的制備 在基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加苦蕎粉、薏米粉、糙米粉、藜麥粉、燕麥粉，添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1%、3%、6%，裝液量50 mL，115 ℃滅菌30 min，冷卻后按照體積分?jǐn)?shù)2%接入活化的種子發(fā)酵液， 于39 ℃、200 r/min 培養(yǎng)24、36、48、60、72、96 h。

3）不同質(zhì)量比的發(fā)酵豆乳制備 將大豆清洗并浸泡12 h，瀝干后加入濕豆質(zhì)量8 倍的水用破壁機(jī)打漿5 min， 再添加體積分?jǐn)?shù)9%的42 型果葡糖漿， 使用高速剪切分散機(jī)以10 000 r/min 剪切15 min。采用相同方法處理谷物。將不同質(zhì)量比的大豆?jié){和谷物漿（3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3）以及純豆乳和純谷物漿裝入250 mL 三角瓶中， 裝液量100 mL，105 ℃滅菌25 min，冷卻后接入體積分?jǐn)?shù)2%的種子發(fā)酵液，39 ℃、200 r/min 搖瓶發(fā)酵12 h。

1.4.3 NK 活力的測(cè)定 參考Astrup 等的方法測(cè)定NK 活力[17]。 將滅菌生理鹽水置于37 ℃水浴鍋中保溫， 取0.15 g 纖維蛋白原溶于15 mL 生理鹽水，37 ℃水浴溶解10 min， 制成纖維蛋白原溶液。 將100 μL 凝血酶（10 U/mL）溶于400 μL 生理鹽水中，制成2 U/mL 的凝血酶溶液。 將1.25 g 瓊脂粉加入125 mL 去離子水中，加熱至完全溶解。 待瓊脂溶液溫度降低至55 ℃左右時(shí)， 與配好的纖維蛋白原溶液和凝血酶溶液快速混勻并立即倒平板， 每個(gè)板25~27 mL。 待完全凝固后打孔。 在纖維蛋白原平板孔內(nèi)加入10 μL 發(fā)酵液，37 ℃靜置培養(yǎng)18 h， 用游標(biāo)卡尺測(cè)量透明圈直徑。1 min 轉(zhuǎn)化1 μmoL 底物所需酶量為1 個(gè)酶活力單位（U）。

1.4.4 pH 及酸度的測(cè)定

1）pH 的測(cè)定 使用pH 計(jì)測(cè)定發(fā)酵液pH。

2）酸度的測(cè)定 配置0.1 mol/L 氫氧化鈉溶液并用鄰苯二甲酸氫鉀（KHP）進(jìn)行標(biāo)定，取10 mL 發(fā)酵液加20 mL 滅菌水，混勻，用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定直至終點(diǎn)（pH 8.3）[18]。 記錄消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積V1，按公式（1） 計(jì)算：

式中：X 為樣品的酸度，°T；c 為氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，mol/L；V1為滴定所消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mL；V2為空白組消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mL；m 為樣品的質(zhì)量，g。

1.4.5 揮發(fā)性鹽基氮的測(cè)定 參考GB 5009.228—2016《食品中揮發(fā)性鹽基氮的測(cè)定》[19]。 取10 mL 樣品于消化管中，加入75 mL 水，振蕩均勻，浸漬30 min。待浸漬結(jié)束后，加入1 g 氧化鎂，立刻連接到凱氏定氮儀上，設(shè)置加堿體積和加水體積均為0，蒸餾時(shí)間180 s。 將1 份甲基紅乙醇溶液與5 份溴甲酚綠乙醇溶液混合作為指示劑，量取30 mL 硼酸接收液，滴加10 滴混合指示劑，以指示劑顏色的變化來判斷終點(diǎn)。 揮發(fā)性鹽基氮質(zhì)量濃度的計(jì)算見公式（2）：

式中：ρ 為樣品揮發(fā)性鹽基氮質(zhì)量濃度，mg/dL；V1為消耗鹽酸的體積，mL；V2為空白組消耗鹽酸的體積，mL；c1為鹽酸滴定液的濃度，mol/L；V 為樣品的體積，mL。

1.4.6 抗氧化活性的測(cè)定

1）總抗氧化能力的測(cè)定 采用文獻(xiàn)[20]的方法， 將0.3 mol/L 醋酸緩沖液 （pH 3.6）、10 mmol/L TPTZ 溶 液、20 mmol/L FeCl3溶液按體 積比10∶1∶1混合得到FRAP 工作液。 取發(fā)酵液1 mL，5 000 g 離心10 min，取離心后的上清液100 μL，加入2.4 mL FRAP 工作液， 空白組取去離子水100 μL， 加入2.4 mL FRAP 工作液， 分別混勻后37 ℃水浴10 min，在593 nm 下用分光光度計(jì)測(cè)吸光度。 依照FeSO4·7H2O 標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算總抗氧化能力。

2）DPPH 自由基清除能力的測(cè)定 參考Ai 等的方法[21]稍加改動(dòng)。 在1 mL 發(fā)酵液中加入4 mL 去離子水混勻，5 000 g 離心10 min， 取上清液500 μL，加入500 μL 0.2 mmol/L DPPH 溶液（用體積分?jǐn)?shù)95%乙醇定容），空白組取100 μL 體積分?jǐn)?shù)95%乙醇，加入500 μL 0.2 mmol/L DPPH 溶液，分別混勻后25 ℃避光水浴30 min，設(shè)定檢測(cè)波長(zhǎng)為517 nm。DPPH 自由基清除能力按公式（3）計(jì)算：

式中：Y 為樣品的DPPH 自由基清除能力，%；As為樣品組的吸光度；Ac為空白組的吸光度。

3）亞鐵離子螯合能力的測(cè)定 參照文獻(xiàn)[22]的方法測(cè)定亞鐵離子螯合能力。 量取10 mL 發(fā)酵液，5 000 g 離心10 min， 準(zhǔn)確取3 mL 上清液加入50 μL 2 mmol/L FeCl3溶液、200 μL 5 mmol/L 菲洛嗪溶液和750 μL 去離子水，空白組取3.75 mL 去離子水 加 入50 μL 2 mmol/L FeCl3溶 液 和200 μL 5 mmol/L 菲洛嗪溶液，分別混勻后25 ℃孵育30 min，在562 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。 亞鐵離子螯合能力按公式（4）計(jì)算：

式中：Z 為樣品的亞鐵離子螯合能力，%；A1為樣品組的吸光度；A0為空白組的吸光度。

1.4.7 電子鼻測(cè)定 取10 mL 發(fā)酵液于20 mL 氣相樣品瓶中，旋緊瓶蓋，按大豆含量遞減的順序擺放，重復(fù)兩次，首尾各放一個(gè)空瓶作為空白樣，采用HeraclesII 系統(tǒng)進(jìn)行自動(dòng)測(cè)定，分析軟件為該儀器配套軟件。

1.4.8 數(shù)據(jù)處理 利用SPSS 20.0 進(jìn)行方差分析及ANOVA 差異顯著性分析（P<0.05 為差異顯著）。 利用Origin 9.0 軟件處理數(shù)據(jù)并繪圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 谷物對(duì)JNFE 0127 發(fā)酵產(chǎn)NK 能力及pH 的影響

2.1.1 谷物對(duì)JNFE 0127 發(fā)酵產(chǎn)NK 能力的影響近年來液態(tài)發(fā)酵制備NK 產(chǎn)品已經(jīng)成為趨勢(shì)。 選擇特色的發(fā)酵底物，并對(duì)發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化可以實(shí)現(xiàn)底物的高效利用。 趙謀明等以糙米為底物，通過優(yōu)化納豆芽孢桿菌液態(tài)發(fā)酵條件， 制備具有高NK 活力和富含谷物多酚的發(fā)酵產(chǎn)物[23]。 作者選擇消費(fèi)者普遍認(rèn)可的苦蕎、燕麥、藜麥等5 種富含膳食纖維、蛋白質(zhì)、多酚、礦物質(zhì)等成分[12-16]的健康谷物作為添加物展開研究。 如圖1 所示，將JNFE 0127 在不添加谷物的基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵，48 h 時(shí)產(chǎn)酶量最高，可達(dá)到6 000 U/mL 以上。 在基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中添加不同谷物后，產(chǎn)酶量顯著提高。 值得注意的是，在發(fā)酵時(shí)間和谷物添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)一致的條件下，不同谷物對(duì)JNFE 0127 發(fā)酵產(chǎn)NK 能力的影響不同。用同一種谷物進(jìn)行發(fā)酵時(shí)，添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)影響產(chǎn)酶量的大小， 添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%時(shí)， 產(chǎn)酶量普遍更高。 添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%的苦蕎粉發(fā)酵96 h 時(shí)，其產(chǎn)酶量為23 326.23 U/mL，與基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基相比提高301.96%。 目前文獻(xiàn)報(bào)道的納豆芽孢桿菌產(chǎn)酶量為300~15 000 U/mL[24-27]。 比如，王艷平等利用納豆芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵花生粕制備NK， 經(jīng)正交優(yōu)化后產(chǎn)酶量為3 162 U/mL[28]。 根據(jù)以上信息可以說明添加苦蕎粉可以明顯提升產(chǎn)酶能力。 此外，當(dāng)谷物添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)一定時(shí)，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，產(chǎn)酶量顯示出達(dá)到峰值后回落的變化規(guī)律。 因此發(fā)酵時(shí)間是產(chǎn)酶能力的重要影響因素。 在發(fā)酵過程中，應(yīng)及時(shí)終止發(fā)酵預(yù)防酶回落現(xiàn)象，劉文濤等也發(fā)現(xiàn)了該現(xiàn)象[29]。

圖1 谷物對(duì)JNFE 0127 發(fā)酵產(chǎn)NK 的影響Fig. 1 Effect of grains on NK production by fermentation of JNFE 0127

2.1.2 谷物對(duì)JNFE 0127 發(fā)酵過程pH 的影響pH是評(píng)價(jià)微生物生長(zhǎng)過程的一項(xiàng)重要指標(biāo)。 依據(jù)pH可以了解菌株的生長(zhǎng)周期、對(duì)培養(yǎng)基的適應(yīng)能力以及NK 的穩(wěn)定性等情況。 由圖2 可知， 在發(fā)酵過程中， 發(fā)酵體系的pH 呈現(xiàn)先減小后增加的趨勢(shì)，在24~60 h 發(fā)酵階段，pH 基本逐漸降低， 在發(fā)酵60 h時(shí)pH 為5.6 左右； 發(fā)酵60~96 h， 體系pH 逐漸升高， 在96 h 發(fā)酵結(jié)束后， 體系pH 基本均在6.0 以上。 當(dāng)JNFE 0127 處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，快速消耗培養(yǎng)基中的碳源和氮源等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，同時(shí)會(huì)分泌酸性代謝產(chǎn)物，如奎尼酸、琥珀酸等[30]，使pH 逐漸降低；在進(jìn)入穩(wěn)定期后，培養(yǎng)基中可供直接利用的碳源被逐步消耗完畢，JNFE 0127 會(huì)將有機(jī)酸作為碳源，氮源中的碳元素也會(huì)被利用，并以氨的形式釋放氮元素，導(dǎo)致培養(yǎng)基pH 升高；進(jìn)入衰亡期后，由于菌體自溶的原因，培養(yǎng)基的pH 會(huì)進(jìn)一步升高。此處培養(yǎng)基pH 的變化規(guī)律與上述JNFE 0127 的生長(zhǎng)周期一致。

圖2 谷物對(duì)JNFE 0127 發(fā)酵中pH 的影響Fig. 2 Effect of grains on pH in JNFE 0127 fermentation

2.2 大豆和苦蕎質(zhì)量比對(duì)發(fā)酵豆乳NK 活力的影響

大豆與苦蕎按不同質(zhì)量比復(fù)配后進(jìn)行發(fā)酵，NK活力的結(jié)果見圖3。隨著苦蕎添加量的增加，發(fā)酵液中的酶活力出現(xiàn)峰值。 當(dāng)大豆與苦蕎質(zhì)量比為2∶1時(shí)，發(fā)酵液中NK 活力最高，可達(dá)到4 460.28 U/mL；與純大豆發(fā)酵液相比，酶活力提高了61.42%。 由此得出，復(fù)配谷物有利于提高發(fā)酵豆乳酶活力，與其他研究者的結(jié)論一致[16]。 然而隨著苦蕎添加量繼續(xù)增加，發(fā)酵體系中酶活力逐漸降低，在純苦蕎發(fā)酵體系中NK 活力只有2 018.10 U/mL。根據(jù)前人的研究可知，苦蕎本身含有單寧和蘆丁成分[31]，單寧和蘆丁具有一定的抗菌性， 可抑制納豆芽孢桿菌的生長(zhǎng)，進(jìn)而使產(chǎn)酶量降低[32]。 此外，酸性環(huán)境以及缺乏某些生長(zhǎng)補(bǔ)充劑也會(huì)限制其生長(zhǎng)速度[33]。

圖3 谷物質(zhì)量比對(duì)發(fā)酵豆乳酶活力的影響Fig. 3 Effects of grain mass ratios on enzyme activity of fermented soybean milk

2.3 大豆和苦蕎質(zhì)量比對(duì)發(fā)酵豆乳pH 及酸度的影響

由于發(fā)酵體系中氮源含量的不同以及JNFE 0127 生長(zhǎng)狀態(tài)的差異，發(fā)酵前后的pH 和酸度也會(huì)有所差異。如圖4（a）所示，發(fā)酵前各體系的pH 無差異， 均為6.5~6.6， 發(fā)酵后各體系的pH 降至5.6 左右，并且隨著苦蕎添加量的增加，發(fā)酵后體系的pH呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)， 純大豆和純苦蕎體系發(fā)酵后pH分別為5.74 和5.52。 另外，由圖4（b）可知，純苦蕎發(fā)酵液的酸度最大（25.3 °T），與純大豆的酸度相比較，提高了27.78%。 一方面，苦蕎含有較多氨基酸類、多酚類等酸性物質(zhì)，會(huì)使酸度升高[34]；另一方面，在發(fā)酵過程中微生物產(chǎn)生的酶（纖維素酶、蛋白酶等）能打破多酚和其他取代基之間的聯(lián)系以釋放可溶性及游離性酚類化合物，也會(huì)使發(fā)酵液酸度升高[35]。

圖4 谷物質(zhì)量比對(duì)發(fā)酵豆乳pH 及酸度的影響Fig. 4 Effects of grain mass ratios on pH and acidity of fermented soybean milk

2.4 大豆和苦蕎質(zhì)量比對(duì)發(fā)酵豆乳風(fēng)味物質(zhì)的影響

2.4.1 大豆和苦蕎質(zhì)量比對(duì)發(fā)酵豆乳揮發(fā)性鹽基氮質(zhì)量濃度的影響 揮發(fā)性鹽基氮包含氨類、甲胺、二甲胺、三甲胺等化合物，通常是判斷納豆芽孢桿菌發(fā)酵豆乳不良風(fēng)味的一項(xiàng)重要指標(biāo)。 在JNFE 0127 發(fā)酵過程中，產(chǎn)生的蛋白酶或微生物分解體系含有的蛋白質(zhì)及發(fā)酵過程中產(chǎn)生的游離氨基酸，會(huì)釋放揮發(fā)性氨類物質(zhì)，產(chǎn)生不良?xì)馕禰36-37]。 結(jié)果如圖5 所示， 發(fā)酵液中揮發(fā)性鹽基氮質(zhì)量濃度隨苦蕎添加量增加先降低后穩(wěn)定。 在大豆與苦蕎質(zhì)量比為1∶3 時(shí)，發(fā)酵體系中揮發(fā)性鹽基氮質(zhì)量濃度最低，為2.63 mg/dL， 與純大豆發(fā)酵體系相比， 降低了39.12%；另外，大豆與苦蕎質(zhì)量比為2∶1 的復(fù)配體系中，揮發(fā)性鹽基氮質(zhì)量濃度為3.45 mg/dL，相比純大豆發(fā)酵降低了20.14%。 這與董岳峰的研究結(jié)果類似[12]，其研究表明苦蕎中淀粉糖含量較高，在納豆芽孢桿菌發(fā)酵過程中添加苦蕎，可以提高復(fù)配發(fā)酵體系中的碳氮比，從而減少游離氨形成，改善風(fēng)味[12]。

圖5 谷物質(zhì)量比對(duì)發(fā)酵豆乳揮發(fā)性鹽基氮質(zhì)量濃度的影響Fig. 5 Effects of grain mass ratios on volatile base nitrogen mass concentration in fermented soybean milk

2.4.2 發(fā)酵豆乳的電子鼻分析結(jié)果 納豆芽孢桿菌發(fā)酵的不良風(fēng)味主要來自大豆本身的豆腥味和其發(fā)酵過程中產(chǎn)生的揮發(fā)性鹽基氮、生物胺等不良風(fēng)味物質(zhì)，電子鼻可以快捷地測(cè)定其不良風(fēng)味的主要來源，有助于進(jìn)行針對(duì)性改良。 結(jié)果如圖6 所示，大豆與苦蕎不同復(fù)配發(fā)酵體系的電子鼻測(cè)定數(shù)據(jù)主要有4 個(gè)峰位， 保留時(shí)間-色譜柱號(hào)分別為16.54-1、50.67-1、19.99-2、61.02-2。 經(jīng)過Alphasoft軟件分析，16.54-1、19.99-2 對(duì)應(yīng)氨氮類化合物，是發(fā)酵豆乳中不良風(fēng)味的主要來源；50.67-1、61.02-2對(duì)應(yīng)己醛等豆腥味的主要來源物質(zhì)。 隨著苦蕎添加量的增加，4 種主要物質(zhì)的峰面積逐漸降低，即含量逐漸降低。 該結(jié)果表明大豆與苦蕎復(fù)配可以有效改善發(fā)酵豆乳的不良風(fēng)味，與上述測(cè)定的揮發(fā)性鹽基氮結(jié)果一致。

圖6 不同復(fù)配發(fā)酵體系所產(chǎn)豆乳的電子鼻分析Fig. 6 Electronic nose analysis of fermented soybean milk with different compound fermentation system

2.4.3 發(fā)酵豆乳的主成分分析結(jié)果 由圖7 可知，主成分1 和主成分2 累積貢獻(xiàn)率高達(dá)99.690%。 另外，如果兩樣品之間的距離越近，表示其整體的氣味信息越接近，差異越小，反之則越大。 各組在PCA分布圖中空間相對(duì)獨(dú)立，可以很好地區(qū)分不同復(fù)配發(fā)酵體系，也進(jìn)一步說明不同發(fā)酵體系中風(fēng)味特征存在差異。 其中，純大豆發(fā)酵體系和大豆與苦蕎質(zhì)量比1∶3 的復(fù)配發(fā)酵體系風(fēng)味信息較為相近， 大豆與苦蕎質(zhì)量比為2∶1 和3∶1 的復(fù)配發(fā)酵體系風(fēng)味信息較為相近，純苦蕎發(fā)酵體系與其他發(fā)酵體系整體風(fēng)味信息差異較大。 此外，沿PC1 軸自左向右分布的樣品中，苦蕎添加量依次增加。 結(jié)合電子鼻及揮發(fā)性鹽基氮測(cè)定結(jié)果可知，第一主成分為可接受的風(fēng)味，第二主成分為異味。

圖7 不同組別發(fā)酵豆乳的信號(hào)強(qiáng)度主成分分析Fig. 7 Principal component analysis of signal strength of fermented soybean milk in different groups

2.5 大豆和苦蕎質(zhì)量比對(duì)發(fā)酵豆乳抗氧化活性的影響

通過測(cè)定發(fā)酵液總抗氧化能力、DPPH 自由基清除能力以及亞鐵離子螯合能力來評(píng)價(jià)不同組的抗氧化水平。 結(jié)果如表1 所示，大豆與苦蕎質(zhì)量比為2∶1 時(shí)，發(fā)酵豆乳的總抗氧化能力（16.34 mmol/L）、DPPH 自由基清除能力（93.02%）以及亞鐵離子螯合能力（56.43%）均顯著高于純大豆及純苦蕎發(fā)酵體系， 與純大豆發(fā)酵體系相比分別提高96.39%、14.51%、34.17%。苦蕎中含有大量的酚類物質(zhì)，隨著發(fā)酵體系中苦蕎的增加，酚類物質(zhì)含量增加[38]。 Liu等發(fā)現(xiàn)結(jié)合酚不能被人體內(nèi)的酶系統(tǒng)直接消化，經(jīng)過微生物發(fā)酵后可發(fā)揮更高的生物活性[39]。 Caizhi等進(jìn)一步研究表明酚類物質(zhì)是植物性食品中的主要抗氧化劑，主要以與纖維素、胺和脂質(zhì)部分結(jié)合的共軛形式存在[40]；發(fā)酵過程能夠?qū)⒐曹椃宇惢衔镛D(zhuǎn)化為游離形式，從而增強(qiáng)抗氧化活性[29]。

表1 不同復(fù)配發(fā)酵體系所得豆乳的抗氧化活性Table 1 Antioxidant properties of soybean milk with different compound fermentation system

3 結(jié) 語

通過添加苦蕎、糙米、薏米、藜麥、燕麥粉可明顯提高JNFE 0127 液體發(fā)酵的產(chǎn)酶能力，其中苦蕎效果最好，當(dāng)添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%時(shí)，產(chǎn)酶量由原來的5 803.12 U/mL 提高到23 326.23 U/mL。 在發(fā)酵豆乳制備中，隨著苦蕎添加量的增加，酶活力出現(xiàn)峰值，揮發(fā)性鹽基氮質(zhì)量濃度呈現(xiàn)先降低后維持穩(wěn)定的趨勢(shì)， 抗氧化活性呈現(xiàn)先升高再降低的趨勢(shì)。當(dāng)大豆與苦蕎質(zhì)量比為2∶1 時(shí)， 揮發(fā)性鹽基氮質(zhì)量濃度可降低到3.45 mg/dL， 比純大豆發(fā)酵得到的發(fā)酵豆乳降低20.14%； 總抗氧化能力、DPPH 自由基清除能力以及亞鐵離子螯合能力分別提高到16.34 mmol/L、93.02%和56.43%， 也均高于純大豆發(fā)酵得到的發(fā)酵豆乳。 該研究在確保NK 活力足夠的條件下，為開發(fā)產(chǎn)品風(fēng)味更易被消費(fèi)者接受、食用更方便的納豆食品提供借鑒。