動(dòng)態(tài)光散射傳感器在食品安全檢測(cè)中的應(yīng)用進(jìn)展

冷遠(yuǎn)逵， 范思雨， 胡馨予， 熊勇華,3

（1. 南昌大學(xué) 食品學(xué)院，江西 南昌 330031； 2. 南昌大學(xué) 前湖學(xué)院，江西 南昌 330031; 3. 南昌大學(xué) 中德聯(lián)合研究院，江西 南昌 330047）

動(dòng)態(tài)光散射（dynamic light scattering，DLS）技術(shù)自1970 年商業(yè)化以來(lái)， 已成為粒度分析測(cè)量的常規(guī)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)， 用于測(cè)量溶液或懸浮液中納米、微米級(jí)別顆粒的尺寸分布情況[1]。 其基本原理是測(cè)量粒子散射光強(qiáng)度隨時(shí)間的波動(dòng)規(guī)律，分析得出粒子的布朗運(yùn)動(dòng)擴(kuò)散速度， 從而通過(guò)Stokes-Einstein 方程得到粒子的流體力學(xué)直徑（水化粒徑）。 因具有操作簡(jiǎn)單、 成本低、 響應(yīng)速度快和重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)，Cohen 等早在1975 年就提出以特異性識(shí)別分子修飾的聚合物微球作為探針，通過(guò)DLS 技術(shù)測(cè)量因目標(biāo)物引起微球聚集而導(dǎo)致的粒徑變化來(lái)定量分析目標(biāo)物的方法[2]。 然而由于聚合物微球光散射能力較弱，該方法在實(shí)際應(yīng)用時(shí)易受到樣品基質(zhì)中生物分子、膠體顆粒等物質(zhì)的散射信號(hào)干擾，導(dǎo)致靈敏度偏低、穩(wěn)定性不足。因此，構(gòu)建DLS 傳感器的關(guān)鍵在于選擇具有較強(qiáng)光散射能力的信號(hào)探針。 金納米顆粒（gold nanoparticles，AuNPs）具有較強(qiáng)的光散射能力， 比直徑相近的聚合物微球強(qiáng)2~3 個(gè)數(shù)量級(jí)，可有效屏蔽復(fù)雜樣品基質(zhì)引起的背景信號(hào)干擾，顯著提高DLS 傳感器的檢測(cè)靈敏度[3]。 同時(shí)AuNPs 具有易于制備、粒徑可控、易于生物修飾等優(yōu)點(diǎn)，且相比于同樣具備強(qiáng)光散射能力的銀納米材料，其膠體穩(wěn)定性和生物相容性更好。 近年來(lái)，以AuNPs 為信號(hào)探針構(gòu)建AuNP-DLS 傳感器受到廣泛關(guān)注，成功用于食品危害物[4-6]、環(huán)境污染物[1]、藥物[7]、臨床標(biāo)志物[8-9]等的高靈敏檢測(cè)。

作者從傳感器構(gòu)建策略、探針設(shè)計(jì)原則等方面闡述了近年來(lái)AuNP-DLS 傳感器的方法學(xué)研究進(jìn)展，總結(jié)了其在真菌毒素[5]、有毒金屬離子[6]、食源性致病菌[10]等食品危害因子檢測(cè)中的應(yīng)用情況，并探討了該領(lǐng)域的發(fā)展趨勢(shì)和面臨的主要挑戰(zhàn)。

1 DLS 傳感器方法學(xué)研究進(jìn)展

1.1 DLS 傳感器構(gòu)建策略

DLS 傳感器可測(cè)量?jī)煞N信號(hào)：水化粒徑和散射光強(qiáng)度。因此，AuNP-DLS 傳感器的核心在于目標(biāo)物引起AuNPs 粒徑或散射光強(qiáng)度的變化。 目前AuNP-DLS 傳感器主要通過(guò)以下3 種方式來(lái)實(shí)現(xiàn)信號(hào)輸出：1）基于目標(biāo)物引起的AuNPs 聚集；2）基于目標(biāo)物引起的AuNPs 有序組裝或解組裝；3）基于標(biāo)記免疫分析技術(shù)建立目標(biāo)物和AuNPs（與AuNPs 磁珠或酶標(biāo)板載體結(jié)合的部分或游離的部分）濃度之間的劑量關(guān)系。

1.1.1 基于AuNPs 聚集的DLS 傳感器 這類(lèi)傳感器最常見(jiàn)的構(gòu)建方法是基于目標(biāo)物與AuNPs 探針的特異性識(shí)別作用（免疫識(shí)別、核酸雜交、配位鍵等）直接介導(dǎo)探針聚集。 以特異性識(shí)別分子修飾的AuNPs 為探針構(gòu)建的DLS 傳感器已被用于蛋白質(zhì)[11]、核酸[12]、小分子[13]和離子[1]等物質(zhì)的均相免洗高靈敏檢測(cè)。 Wang 等以單抗和多抗分別修飾的50 nm 和10 nm AuNPs 作為探針， 構(gòu)建乙肝表面抗原的DLS均相免疫分析方法（見(jiàn)圖1（a））[11]。 以目標(biāo)物引起探針聚集導(dǎo)致的粒徑增大為定量信號(hào)，該方法檢測(cè)乙肝表面抗原的靈敏度較常規(guī)酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）提高了80 倍。 Miao 等以?xún)煞N寡核苷酸修飾的AuNPs 為探針檢測(cè)雙鏈DNA[14]。 兩種寡核苷酸鏈分別與目的DNA 不同區(qū)域雜交形成三鏈體結(jié)構(gòu)， 引發(fā)AuNPs聚集， 進(jìn)而通過(guò)檢測(cè)粒徑變化實(shí)現(xiàn)對(duì)DNA 的高靈敏分析，檢測(cè)限（limit of detection，LOD）低至500 fmol/L。 一般地，顆粒的散射光強(qiáng)度與粒徑呈正相關(guān)關(guān)系，因此探針聚集同時(shí)也會(huì)導(dǎo)致散射光強(qiáng)度的增加。 有研究者以對(duì)巰基苯胺修飾的AuNPs 為DLS探針，利用三硝基甲苯（trinitrotoluene，TNT）與對(duì)巰基苯胺之間的π-π 相互作用介導(dǎo)探針聚集的原理來(lái)檢測(cè)TNT[13]。以散射光強(qiáng)度變化為定量信號(hào)，該方法檢測(cè)TNT 的LOD 達(dá)100 pmol/L。

圖1 基于AuNPs 聚集的DLS 傳感器Fig. 1 DLS sensors based on AuNPs aggregation

第二種常見(jiàn)方法是基于目標(biāo)物間接調(diào)控AuNPs 探針的交聯(lián)反應(yīng)。Miao 等以?xún)煞N寡核苷酸鏈修飾的AuNPs （Oligo1-AuNP、Oligo2-AuNP） 為探針，以能同時(shí)與Oligo1、Oligo2 進(jìn)行雜交的寡核苷酸鏈Oligo3 為交聯(lián)探針構(gòu)建葡萄糖傳感器 （見(jiàn)圖1（b））[15]。 葡萄糖在葡萄糖氧化酶 （glucose oxidase，GOx）、Fe2+級(jí)聯(lián)催化下產(chǎn)生羥自由基（·OH），·OH 可降解Oligo3，從而調(diào)控AuNPs 探針的聚集反應(yīng)。 該方法通過(guò)粒徑變化檢測(cè)葡萄糖， 線(xiàn)性范圍為0.05~5.00 pmol/L，LOD 為38 pmol/L。 Lu 等報(bào)道的檢測(cè)植物微小RNA（microRNA）的無(wú)酶催化均相DLS 傳感器原理[16]見(jiàn)圖1（c）。 microRNA 可與二苯基環(huán)辛炔（DBCO） 修飾的寡核苷酸探針probe A 和疊氮基（N3）修飾的寡核苷酸探針probe B 雜交形成夾心結(jié)構(gòu)， 促使probe A 與probe B 發(fā)生點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)并連接起來(lái)，所形成的probe A-probe B 鏈同時(shí)與probe A’修飾的AuNPs 和probe B’ 修飾的AuNPs 雜交，導(dǎo)致AuNPs 發(fā)生聚集。 由于目標(biāo)microRNA 實(shí)現(xiàn)了循環(huán)利用，信號(hào)得到放大，該方法LOD 達(dá)78.6 fmol/L。

AuNPs 溶液膠體穩(wěn)定性的基礎(chǔ)是表面配體（如檸檬酸） 提供的表面電荷和親水性。 因此， 調(diào)控AuNPs 的表面配體，可影響其膠體穩(wěn)定性從而引發(fā)AuNPs 聚集。寡核苷酸鏈修飾的AuNPs 具有很好的膠體穩(wěn)定性， 但當(dāng)寡核苷酸鏈脫落或者裂解后，AuNPs 膠體穩(wěn)定性變差，從而在高鹽離子濃度下發(fā)生團(tuán)聚。 基于此原理，Xiong 等以5′-TTTCTTCTTC GTTGTTT-3′修飾的AuNPs 為探針構(gòu)建Hg2+傳感器（見(jiàn)圖1（d））[6]。 Hg2+與寡核苷酸鏈結(jié)合形成T-Hg2+-T，寡核苷酸鏈形成雙鏈結(jié)構(gòu)而脫離AuNPs 表面，加入高濃度NaCl，AuNPs 發(fā)生聚集，粒徑變大，該方法LOD 達(dá)0.43 nmol/L。

1.1.2 基于AuNPs 組裝結(jié)構(gòu)的DLS 傳感器 由于聚集的無(wú)序性以及容易受到樣本基質(zhì)影響等缺陷，導(dǎo)致基于AuNPs 聚集的DLS 傳感器信號(hào)穩(wěn)定性不足。 相比較而言，基于AuNPs 有序自組裝結(jié)構(gòu)形成的信號(hào)或組裝體解組裝過(guò)程的信號(hào)更加可控和穩(wěn)定。 目前，基于AuNPs 組裝結(jié)構(gòu)的DLS 傳感器中，AuNPs 組裝體形成主要分為以下4 種方式：1）基于與目標(biāo)物特異性結(jié)合作用形成AuNPs 低聚體；2）以DNA 為框架進(jìn)行自組裝；3）在微生物模板表面自組裝；4）在納米顆粒模板表面自組裝。

在基于特異性識(shí)別作用直接介導(dǎo)AuNPs 聚集的體系中，當(dāng)控制AuNPs 顆粒表面特異性識(shí)別分子的數(shù)量時(shí)，可使AuNPs 在目標(biāo)物存在時(shí)組裝成低聚體，甚至是二聚體結(jié)構(gòu)[17-18]。 如Seow 等以寡核苷酸鏈修飾的AuNPs 為探針構(gòu)建針對(duì)let7a（microRNA）的均相DLS 傳感器[17]。通過(guò)對(duì)比平均每個(gè)AuNPs 上偶聯(lián)的寡核苷酸分子數(shù)為2、5、10 個(gè)時(shí)AuNPs 的目標(biāo)物介導(dǎo)組裝行為，發(fā)現(xiàn)偶聯(lián)寡核苷酸越多，AuNPs粒徑變化越明顯。 單個(gè)AuNPs 表面平均有10 個(gè)寡核苷酸分子時(shí)，其粒徑變化最明顯，但有趨近于無(wú)序聚集的趨勢(shì)， 信號(hào)的穩(wěn)定性變差。 而當(dāng)平均有5個(gè)寡核苷酸分子時(shí)，AuNPs 在let7a 存在時(shí)會(huì)穩(wěn)定組裝成低聚體，LOD 達(dá)100 fmol/L。

Li 等開(kāi)發(fā)了一種基于AuNPs 自組裝的端粒酶?jìng)鞲衅鳎ㄟ^(guò)對(duì)癌細(xì)胞或尿液中端粒酶的高靈敏檢測(cè)可實(shí)現(xiàn)膀胱癌的診斷（見(jiàn)圖2（a））[19]。 在端粒酶作用下，底物（telomerase substrate，TS）末端延伸n 次重復(fù)序列（TTAGGG），該重復(fù)序列可以作為啟動(dòng)子，觸發(fā)兩個(gè)發(fā)夾探針（H1 和H2）之間的雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（hybridization chain reaction，HCR） 形成雙鏈DNA。該HCR 產(chǎn)物DNA 旁邊帶有大量寡核苷酸支鏈可與互補(bǔ)序列修飾的AuNPs 探針雜交， 因此AuNPs在HCR 產(chǎn)物上形成有序組裝體， 導(dǎo)致水化粒徑的急劇增大。 該方法可檢測(cè)僅從4 個(gè)MCF-7 細(xì)胞中提取的端粒酶含量。 Zou 等報(bào)道了一種基于AuNPs探針在目標(biāo)DNA 的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增產(chǎn)物核酸框架上自組裝的DLS 均相傳感器， 其檢測(cè)艾滋病病毒（human immunodeficiency virus，HIV）DNA 的 LOD 達(dá) 1.8 amol/L[20]。 近期該課題組通過(guò)引入核酸適配子，利用上述原理設(shè)計(jì)了可檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物CA-125 的PCR-DLS 傳感器，LOD 低至1.1 fg/mL[21]。

圖2 基于AuNPs 組裝體結(jié)構(gòu)的DLS 傳感器Fig. 2 DLS sensors based on AuNPs assemblies

對(duì)于病毒[22]、細(xì)菌[10]等微生物目標(biāo)物，免疫AuNPs 探針會(huì)以目標(biāo)物為模板在其表面形成組裝體，從而導(dǎo)致粒徑增大。 如Driskell 等以抗體修飾的AuNPs 為免疫探針來(lái)檢測(cè)PR8 型流感病毒[22]。 在病毒顆粒濃度較低時(shí)，免疫AuNPs 探針會(huì)在病毒顆粒表面自組裝形成“核心-衛(wèi)星”組裝結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致粒徑增大。 該方法LOD 小于100 TCID50/mL，靈敏度較商業(yè)診斷試劑盒提高1~2 個(gè)數(shù)量級(jí)。

Wang 等開(kāi)發(fā)了一種等離子體 “核心-衛(wèi)星”結(jié)構(gòu)納米組裝探針用于microRNA-21 的檢測(cè)[23]（見(jiàn)圖2（b））。 其中，核心AuNPs 和衛(wèi)星AuNPs 通過(guò)DNA鏈連接，目標(biāo)物microRNA-21 通過(guò)鏈置換反應(yīng)可使衛(wèi)星AuNPs 脫落引發(fā)解組裝。 而燃料DNA 鏈又通過(guò)鏈置換反應(yīng)使microRNA-21 重新解離出來(lái)實(shí)現(xiàn)循環(huán)利用， 從而使信號(hào)得到放大。 該方法對(duì)microRNA-21 的定量檢測(cè)范圍為5~150 pmol/L，LOD 為0.24 pmol/L。

1.1.3 基于免疫標(biāo)記技術(shù)的非均相DLS 傳感器AuNPs 探針與目標(biāo)物特異性結(jié)合后，無(wú)論是游離的還是結(jié)合的探針部分均會(huì)產(chǎn)生目標(biāo)物引起的濃度差，從而表現(xiàn)出散射光強(qiáng)度的差異。 Chao 等以片狀二氧化錳修飾的AuNPs（MnO2-pAuNP）作為免疫標(biāo)記材料構(gòu)建了檢測(cè)前列腺特異性抗原 （prostatespecific antigen，PSA） 的超靈敏DLS 免疫分析方法（見(jiàn)圖3（a）)[24]。 樣本中存在PSA 時(shí)，酶標(biāo)板上會(huì)捕獲一定量的MnO2-pAuNP 免疫探針，通過(guò)谷胱甘肽（glutathione，GSH） 消解MnO2殼層可釋放大量的AuNPs 到溶液中，通過(guò)檢測(cè)溶液中AuNPs 引起的散射光強(qiáng)度，可以對(duì)PSA 進(jìn)行定量分析。 由于MnO2-pAuNP 是載有多個(gè)AuNPs 的組裝體，且溶液中基本無(wú)背景干擾，因此該方法LOD 低至1 fmol/L。 在此模式的基礎(chǔ)上，Yu 等根據(jù)金屬有機(jī)框架 （metalorganic framework，MOF） 大 量 裝 載 和 可 控 釋 放AuNPs，以及AuNPs 釋放后可控生長(zhǎng)的原理設(shè)計(jì)了檢測(cè)甲胎蛋白（alpha-fetoprotein，AFP）的DLS 免疫分析方法（見(jiàn)圖3（b）)[25]。 當(dāng)存在AFP 時(shí)，一定量的MOF@AuNP 會(huì)結(jié)合在酶標(biāo)板上，MOF 在堿性條件下消解釋放出大量的小粒徑AuNPs（4 nm）到溶液中，然后加入生長(zhǎng)液（鹽酸羥胺和氯金酸）使4 nm AuNPs 生長(zhǎng)成大粒徑AuNPs， 光散射能力得到放大。 通過(guò)測(cè)定散射光強(qiáng)度對(duì)AFP 定量分析，該方法LOD 為0.36 pg/mL。

圖3 基于免疫標(biāo)記技術(shù)的DLS 傳感器Fig. 3 DLS sensors based on immunolabelled technology

1.2 AuNPs 探針對(duì)傳感器靈敏度的影響

構(gòu)建AuNP-DLS 傳感器的核心在于設(shè)計(jì)合適的AuNPs 探針， 其對(duì)檢測(cè)靈敏度的影響至關(guān)重要。而AuNPs 的形貌、 粒徑是影響其光散射能力的關(guān)鍵，AuNPs 探針的濃度是影響其對(duì)外界刺激敏感性的關(guān)鍵， 因此探針的形貌、 粒徑及使用濃度對(duì)AuNP-DLS 傳感器的檢測(cè)性能影響很大。

理論上，AuNPs 探針粒徑越大， 其光散射能力越強(qiáng)，檢測(cè)靈敏度越高。 但是粒徑過(guò)大的AuNPs 膠體穩(wěn)定性不足，信號(hào)穩(wěn)定性變差，同時(shí)大顆粒與目標(biāo)物結(jié)合時(shí)可能會(huì)存在位阻效應(yīng)反而降低其結(jié)合率[22]。 Kalluri 等構(gòu)建了基于AuNPs 聚集的As3+傳感器，探究了AuNPs 的粒徑對(duì)檢測(cè)靈敏度的影響。 結(jié)果表明，LOD 隨著AuNPs 粒徑的增大而逐漸降低，當(dāng)粒徑為110 nm 時(shí)，LOD 低至3 pg/mL[26]。Huang 等報(bào)道了基于AuNPs 免疫探針檢測(cè)單增李斯特菌的均相免洗免疫分析技術(shù)[4]。 單增李斯特菌表面存在多個(gè)抗原表位，可結(jié)合多個(gè)AuNPs 探針形成組裝結(jié)構(gòu)，使納米尺寸的AuNPs 探針表觀水化粒徑達(dá)到微米級(jí)別，從而使隱身的細(xì)菌“顯形”。 他們探究了探針粒徑對(duì)靈敏度的影響。 結(jié)果表明，30、70、100 nm的AuNPs 探針對(duì)應(yīng)的最佳工作濃度分別為2.640、0.044、0.022 pmol/L。 大粒徑探針光散射能力更強(qiáng)、所需工作濃度更低、檢測(cè)靈敏度更高。 基于100 nm AuNPs 探針的DLS 傳感器LOD 最低， 達(dá)0.35 CFU/mL，結(jié)合免疫磁分析方法，生菜樣品中LOD 為0.22 CFU/g。 多枝狀金納米花 （gold nanoflowers，AuNFs）因有更大的比表面積，而具有更強(qiáng)的光散射能力，且能修飾更多的識(shí)別分子從而獲得高親和力的探針，另外其膠體穩(wěn)定性也更高，所以理論上是更理想的DLS 傳感器探針。 Zhan 等以AuNFs 為探針構(gòu)建了相似的DLS 均相免洗免疫傳感器，實(shí)現(xiàn)對(duì)大腸桿菌O157：H7 的高靈敏檢測(cè)[10]。 同時(shí)也探討了AuNFs 粒徑對(duì)檢測(cè)靈敏度的影響。 結(jié)果顯示，基于120 nm AuNFs 的DLS 傳感器靈敏度最高，其線(xiàn)性范圍為6~60 000 CFU/mL，LOD 為2.7 CFU/mL，實(shí)現(xiàn)單菌水平檢測(cè)。 金納米棒 （gold nanorods，AuNRs）是應(yīng)用最廣的異形AuNPs，通過(guò)對(duì)其“頂端”或“長(zhǎng)邊”進(jìn)行定點(diǎn)修飾，可實(shí)現(xiàn)“頭對(duì)頭”或“肩并肩” 的定向自組裝。 Wang 等將抗體、 微囊藻毒素LR-卵清蛋白（MC-LR-OVA）修飾的AuNRs 作為自組裝探針， 構(gòu)建了針對(duì)微囊藻毒素LR（microcystin LR，MC-LR）的競(jìng)爭(zhēng)免疫DLS 傳感器。 通過(guò)將抗體、MC-LR-OVA 定點(diǎn)修飾在AuNRs 的“頂端”或“長(zhǎng)邊”，分別實(shí)現(xiàn)了AuNRs 探針的“頭對(duì)頭”或“肩并肩” 的定向自組裝。 目標(biāo)物MC-LR 的存在會(huì)破壞AuNRs 探針的自組裝， 從而使AuNRs 組裝體的尺寸發(fā)生變化。 通過(guò)分析組裝體尺寸檢測(cè)目標(biāo)物，“頭對(duì)頭”或“肩并肩”組裝模式的DLS 傳感器LOD 分別為5.00、0.45 ng/mL[27]。

理論上，當(dāng)探針濃度越低時(shí)，其對(duì)外界刺激（包括目標(biāo)物）越敏感（受目標(biāo)物影響而發(fā)生聚集等現(xiàn)象的探針占比更高）。 然而，當(dāng)探針濃度過(guò)低時(shí)，基質(zhì)內(nèi)生物分子的散射信號(hào)會(huì)成為不可忽視的背景信號(hào)，信噪比反而下降。Driskell 等在PR8 型流感病毒A 的AuNP-DLS 免疫分析方法中，探討了AuNPs濃度對(duì)檢測(cè)靈敏度的影響。 結(jié)果表明，在能充分抑制背景信號(hào)的基礎(chǔ)上，探針濃度越低，檢測(cè)靈敏度越高[22]。

2 DLS 傳感器的食品安全檢測(cè)應(yīng)用現(xiàn)狀

近年來(lái)，農(nóng)獸藥殘留、重金屬污染、致病微生物污染、超劑量或超范圍使用添加劑等食品安全問(wèn)題嚴(yán)重威脅國(guó)人飲食安全和生命健康。 如何高效、便捷地對(duì)食品鏈中有毒有害物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)是保障人民“舌尖上的安全”的關(guān)鍵。 AuNP-DLS 傳感器因其簡(jiǎn)單、快速、成本低廉、高靈敏度、可實(shí)現(xiàn)均相免洗檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)， 成為優(yōu)良的食品危害物檢測(cè)技術(shù)平臺(tái)。 DLS 傳感器用于食品安全檢測(cè)的研究見(jiàn)表1。

表1 AuNP-DLS 傳感器在食品安全檢測(cè)中的應(yīng)用研究現(xiàn)狀Table 1 Research status of the application of AuNP-DLS sensors for food contamination detection

2.1 檢測(cè)重金屬

重金屬污染在我國(guó)食品安全問(wèn)題上占據(jù)相當(dāng)大的比重，其蓄積性、慢性毒性等特點(diǎn)導(dǎo)致其對(duì)人體健康影響巨大。 AuNP-DLS 傳感器已應(yīng)用于汞[6]、銅[28]、鉛[29]、砷[26]等多種重金屬的高靈敏檢測(cè)。

Miao 等基于Cu2+依賴(lài)型DNA 酶和檸檬酸修飾的AuNPs 構(gòu)建了均相Cu2+傳感器[28]。DNA 酶與底物結(jié)合成雙鏈結(jié)構(gòu)， 無(wú)法吸附在AuNPs 表面， 加入NaCl 后AuNPs 會(huì)發(fā)生聚集；而加入Cu2+后，活化的DNA 酶切割底物DNA，釋放出一段單鏈DNA 并吸附在AuNPs 表面，可阻止AuNPs 聚集。 根據(jù)水化粒徑變化值可估算Cu2+濃度， 定量檢測(cè)范圍為0.1~20.0 nmol/L，LOD 為60 pmol/L。 此外，他們利用Pb2+依賴(lài)型DNA 酶和寡核苷酸修飾的AuNPs 構(gòu)建了均相Pb2+傳感器[29]。 AuNPs 探針可通過(guò)與底物DNA 互補(bǔ)雜交而發(fā)生聚集，然而Pb2+存在時(shí)，活化的酶催化切斷底物DNA，從而阻止AuNPs 聚集。 最低可檢測(cè)35 pmol/L 的Pb2+。 Kalluri 等以GSH、二硫蘇糖醇和半胱氨酸共修飾的AuNPs 為探針構(gòu)建了讀取比色信號(hào)和DLS 信號(hào)的均相As3+傳感器。 As3+與3 種配體均可通過(guò)配位作用結(jié)合引起AuNPs 聚集，從而導(dǎo)致等離子共振峰（比色信號(hào)）和粒徑的急劇變化。 結(jié)果顯示，DLS 檢測(cè)As3+的靈敏度（3 pg/mL）遠(yuǎn)高于比色信號(hào)靈敏度（1 ng/mL）[26]。

2.2 檢測(cè)生物毒素

生物毒素是廣泛存在的食品污染物，尤其以真菌毒素對(duì)糧油及其制品的污染問(wèn)題最受關(guān)注[38]。 以抗體為識(shí)別分子、以AuNPs 為信號(hào)輸出探針的DLS免疫學(xué)分析方法可檢測(cè)0.1~100.0 pg/mL 的毒素，靈敏度較常規(guī)ELISA 方法高約2 個(gè)數(shù)量級(jí)[5，27，30]。 如Zhang 等以免疫磁珠為載體，以抗原-牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA） 復(fù)合物修飾的30 nm AuNPs 為信號(hào)輸出探針，構(gòu)建競(jìng)爭(zhēng)DLS 免疫分析方法檢測(cè)牛奶中的黃曲霉毒素M（aflatoxin M，AFM）。在形成免疫復(fù)合物后進(jìn)行磁分離，通過(guò)檢測(cè)溶液的散射光強(qiáng)度實(shí)現(xiàn)對(duì)AFM 的快速定量分析，LOD 達(dá)27.5 pg/mL[30]。 基于AuNPs 的等離子共振吸收為輸出信號(hào)的等離子共振ELISA （plasmonic ELISA，pELISA）是近年來(lái)比較受歡迎的高靈敏比色分析技術(shù)。 Zhan 等以GOx 為酶標(biāo)記物，構(gòu)建針對(duì)黃曲霉毒素B1（aflatoxin B1，AFB1） 的競(jìng)爭(zhēng)免疫分析方法[5]。GOx 可與體系中的辣根過(guò)氧化物酶（HRP）級(jí)聯(lián)催化葡萄糖產(chǎn)生·OH，引發(fā)靜電吸附在AuNPs 探針表面的酪胺發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)， 進(jìn)而導(dǎo)致AuNPs 聚集，通過(guò)DLS 分析粒徑變化可檢測(cè)低至0.12 pg/mL 的AFB1。 該方法比競(jìng)爭(zhēng)pELISA 和常規(guī)ELISA 方法的靈敏度分別提高了153 倍和385 倍。

2.3 檢測(cè)農(nóng)獸藥殘留和非法添加物

近年來(lái)，我國(guó)農(nóng)獸藥殘留和非法添加物引起的食品安全事件頻發(fā)，社會(huì)影響極其惡劣[39]。乙酰膽堿酯酶催化乙酰膽堿水解可產(chǎn)生帶正電的膽堿，其可使帶負(fù)電的檸檬酸修飾的AuNPs 發(fā)生聚集。 Alami等基于這一原理設(shè)計(jì)了針對(duì)農(nóng)藥對(duì)氧磷的DLS 傳感器。 對(duì)氧磷會(huì)抑制體系中乙酰膽堿酯酶活性，阻止乙酰膽堿水解生成膽堿，從而導(dǎo)致AuNPs 聚集程度下降。 該方法的LOD 為75.5 pmol/L，由于靈敏度極高，在檢測(cè)實(shí)際樣品時(shí)可進(jìn)行大比例稀釋?zhuān)瑥亩山档娃r(nóng)藥殘留中基質(zhì)效應(yīng)的影響，提高檢測(cè)準(zhǔn)確性[31]。Levin 等利用小分子目標(biāo)物的競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)可抑制納米顆粒（分別修飾抗體、BSA-抗原復(fù)合物）之間的聚集，構(gòu)建了DLS 快速均相免疫分析方法來(lái)檢測(cè)氯霉素。 并對(duì)比了AuNPs、磁珠、聚合物微球等探針的檢測(cè)性能， 發(fā)現(xiàn)AuNPs 體系的檢測(cè)靈敏度最高，LOD 達(dá)2.4 ng/mL， 定量檢測(cè)范圍為5~10 000 ng/mL[32]。Ma 等基于靜電作用可誘導(dǎo)檸檬酸修飾的AuNPs 探針聚集， 實(shí)現(xiàn)牛奶中三聚氰胺的特異性快速檢測(cè)，LOD 為50 ng/mL[33]。

2.4 檢測(cè)致病菌

微生物污染是目前我國(guó)乃至全球面臨的首要食品安全問(wèn)題，其中以食源性致病菌最為常見(jiàn)[40]。目前平板培養(yǎng)法是檢測(cè)食源性致病菌的金標(biāo)準(zhǔn)方法，但其存在耗時(shí)長(zhǎng)（通常需要24~48 h）、操作煩瑣等缺陷，無(wú)法實(shí)現(xiàn)對(duì)致病菌的高效監(jiān)測(cè)。 據(jù)研究報(bào)道，AuNP-DLS 分析方法能實(shí)現(xiàn)致病菌或其DNA 的快速（2~4 h）、高靈敏檢測(cè)，是潛在的優(yōu)良篩查技術(shù)。

Huang 和Zhan 等分別以抗體修飾的球狀A(yù)uNPs 和多枝狀A(yù)uNFs 為免疫探針檢測(cè)生菜中單增李斯特菌和牛奶中的大腸桿菌O157：H7，分別達(dá)到LOD 為10 CFU/g 和單菌檢測(cè)水平[4，10]。 周寶青將PCR 擴(kuò)增技術(shù)與以擴(kuò)增DNA 為目標(biāo)的AuNP-DLS技術(shù)結(jié)合，檢測(cè)牛奶中沙門(mén)氏菌和大腸桿菌O157：H7，LOD 達(dá)10 CFU/mL[34]。 Mcvey 等 以RNA 修 飾 的AuNPs 為探針， 開(kāi)發(fā)一種利用核酸內(nèi)切酶控制AuNPs 聚集的方法檢測(cè)致病菌DNA[35]。 AuNPs 表面的RNA 可與目標(biāo)DNA 特異性雜交形成DNA-RNA異源雙鏈結(jié)構(gòu)， 該結(jié)構(gòu)很容易被RNAse H 酶切，從而釋放目標(biāo)DNA 與另一個(gè)RNA 探針雜交，直至所有的RNA 探針被切割， 使暴露在高電解質(zhì)中的AuNPs 聚集并產(chǎn)生粒徑信號(hào)變化。 該傳感器檢測(cè)雞肉中空腸彎曲菌DNA 的LOD 為18 fmol/L，總分析時(shí)間不到3 h。

3 展 望

由于AuNPs 易制備和便于修飾的特點(diǎn)，AuNPDLS 傳感器構(gòu)建過(guò)程非常簡(jiǎn)單， 可實(shí)現(xiàn)均相分析，也可與多種技術(shù)如ELISA[5]和核酸擴(kuò)增[19-20]結(jié)合。 同時(shí)， 由于DLS 儀器的高靈敏性和AuNPs 超強(qiáng)的光散射能力，AuNP-DLS 傳感器具備簡(jiǎn)單、快速和靈敏性高等優(yōu)點(diǎn)，在食品安全、臨床診斷和環(huán)境監(jiān)測(cè)等生化分析領(lǐng)域具有很好的應(yīng)用前景。 然而，這項(xiàng)技術(shù)在走向?qū)嶋H應(yīng)用之前還有一些瓶頸問(wèn)題有待突破。

第一，目前DLS 傳感器在食品安全檢測(cè)中的應(yīng)用研究仍比較有限，缺乏系統(tǒng)性研究，且目前多是用于水、牛奶等少數(shù)幾種食品樣品基質(zhì)中的危害物分析，該類(lèi)技術(shù)抗復(fù)雜食品基質(zhì)干擾的能力需得到更多實(shí)證。 AuNP-DLS 方法的高靈敏性利于通過(guò)樣本稀釋的方法來(lái)降低基質(zhì)效應(yīng)對(duì)探針的干擾，同時(shí)也可以通過(guò)結(jié)合免疫磁分離等技術(shù)減少基質(zhì)干擾。另外，通過(guò)改善AuNPs 表面修飾技術(shù)，制備魯棒性更好的探針至關(guān)重要。

第二，現(xiàn)有檢測(cè)靈敏度仍無(wú)法滿(mǎn)足一些極端痕量物質(zhì)的檢測(cè)需求， 因此檢測(cè)靈敏度需進(jìn)一步提高。 目前，DLS 傳感器幾乎都是以AuNPs （包括球形、多枝狀和棒狀A(yù)uNPs）為信號(hào)輸出探針。 后續(xù)可探究采用光散射能力更強(qiáng)的探針（如銀納米顆?；虬层y殼層的納米材料）[41]來(lái)提高靈敏度。 同時(shí)，多功能探針，如金磁納米粒子[42]可同時(shí)實(shí)現(xiàn)信號(hào)輸出和磁富集功能， 從而構(gòu)建抗基質(zhì)干擾能力更強(qiáng)、靈敏度更高的DLS 傳感器。

第三，DLS 分析技術(shù)目前僅限于實(shí)驗(yàn)室使用，無(wú)法滿(mǎn)足一些現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)或資源匱乏地區(qū)的需求。 因此，開(kāi)發(fā)小型化、便攜式DLS 設(shè)備非常關(guān)鍵。