豬圓環(huán)病毒3型與宿主相互作用機制研究進展

孫仁杰,單 穎,安慧婷,王雅婷,謝榮輝,張傳亮,趙靈燕,方維煥,李肖梁,*

(1.浙江省動物疫病預防控制中心,浙江 杭州 311199; 2.浙江省動物預防醫(yī)學重點實驗室,浙江 杭州 310058; 3.浙江大學 動物科學學院,浙江 杭州 310058)

豬圓環(huán)病毒3型(porcine circovirus type 3,PCV3)屬于圓環(huán)病毒科(Circoviridae)圓環(huán)病毒屬(Circovirus),于2015年首次在美國母豬群中通過宏基因組測序技術發(fā)現(xiàn),感染該病毒的母豬表現(xiàn)出繁殖障礙,以及與豬皮炎腎炎綜合征(PDNS)相似的癥狀[1]。作為新發(fā)豬病病原,根據(jù)大量的流行病學回溯性調查研究,目前PCV3已在全球多個國家和地區(qū)的養(yǎng)殖業(yè)豬群和野豬群被檢測到,并且在其他健康動物中也偶有發(fā)現(xiàn)[2-4]。目前發(fā)現(xiàn)的與PCV3感染相關的臨床癥狀包括PDNS、繁殖障礙、呼吸系統(tǒng)紊亂、腹瀉和系統(tǒng)性炎癥反應綜合征[2,5]。

與豬圓環(huán)病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)相同,PCV3也是編碼復制相關蛋白的環(huán)狀單鏈DNA病毒(circular replication-associated protein-encoding single-stranded DNA viruses, CRESS DNA viruses)類群的一員[6]。PCV3基因組為2.0 kb,序列分析預測其至少包含3個開放閱讀框(open reading frame,ORF)。最大的開放閱讀框ORF1位于基因組正義鏈,沿順時針方向轉錄,編碼復制酶蛋白(Rep)。核衣殼蛋白(capsid protein,Cap)由位于基因組互補鏈的ORF2編碼,轉錄方向與ORF1相對。目前ORF3的起始密碼子和功能尚不清楚。此外,PCV3基因組全序列和Cap氨基酸序列與PCV1、PCV2相比同源性較低[1-2]。

受限于基因組大小和自身編碼能力,PCV的復制和增殖在很大程度上依賴于宿主細胞,易引起宿主基因表達的異常和細胞功能形態(tài)的改變。因此,研究病毒與宿主之間的相互作用機制,并鑒定出參與的宿主因子和病毒組分,有助于明晰豬圓環(huán)病毒復制與發(fā)病機制。自PCV3發(fā)現(xiàn)以來,有關流行病學調查、檢測方法建立和基因組演化分析的研究較多。部分實驗室通過瞬轉表達系統(tǒng)、臨床分離和反向遺傳學技術在病毒組分或全病毒水平對PCV3感染致病與宿主響應展開了研究。本文擬通過對PCV3感染引起宿主響應、與PCV3互作宿主因子鑒定和PCV3生命周期等相關的最新研究結果進行綜述,并對相關作用機制進行探討,有助于進一步了解PCV3復制及其感染致病機制。

1 PCV3感染與宿主響應

1.1 PCV3反向遺傳學技術的應用研究

已在患病仔豬或者健康動物的大腦、心臟、脾、腎臟、口腔、血清、鼻腔液、胸腔積液、腹腔液、糞便和精液等大部分組織和體液中檢測到PCV3[3,5,7-8]。大部分研究集中于PCV3的流行病學調查和檢測方法上,缺乏活病毒株來研究其在豬源細胞甚至宿主體內的發(fā)病機制。Jiang等[7]將合成的PCV3線性基因組通過EcoR I和SacI酶切位點與pSK載體連接構建感染性克隆,轉染豬腎上皮細胞(PK-15細胞),連續(xù)傳15代,首次在體外拯救獲得了PCV3毒株。之后,陸續(xù)有研究人員通過在PCV3基因組的酶切位點設計引物進行PCR獲得線性DNA,利用T4連接酶將基因組在體外環(huán)化轉染PK-15細胞或可傳代豬肺泡巨噬細胞(3D4/21細胞),連續(xù)傳代獲得病毒[9-10]。一些科研者嘗試使用多種載體和不同PCV3基因組序列構建感染性克隆質粒,經磷酸鈣或脂質體轉染不同細胞系或小鼠體內拯救均未成功獲得PCV3拯救病毒[11-12]。PCV3拯救病毒在細胞或小鼠體內的傳代增殖能力較弱,說明病毒增殖傳代方法需要進一步研究優(yōu)化,這也是目前有關PCV3致病機制研究較少的原因之一。

1.2 PCV3感染差異蛋白質組學分析

Jiang等[7]通過PCV3感染SPF仔豬的動物試驗發(fā)現(xiàn),病毒感染后可在仔豬肺部組織中觀察到嚴重的病理變化。為進一步了解PCV3與宿主之間的相互作用及其發(fā)病機制,Jiang等[13]利用iTRAQ同位素標記定量結合LC-MS/MS質譜分析,對感染PCV3的無特定病原體仔豬肺部組織的細胞調控蛋白進行差異分析,共檢測到3 429個蛋白,從感染組和對照組的比較分析中篩選到242個差異蛋白,其中上調蛋白100個,下調蛋白142個;差異蛋白質主要涉及細胞代謝、先天免疫反應、主要組織相容性復合體、熱休克蛋白家族和細胞胞吞作用。

1.3 PCV3感染誘導細胞應激反應與相關適應性機制

在感染病毒的細胞中,病毒基因組復制與蛋白質的合成能引起細胞發(fā)生應激反應,從而在感染過程中改變細胞內環(huán)境。為應對病毒感染引起的外源性刺激,宿主細胞演化出多種適應性應答機制,包括未折疊蛋白反應、凋亡、自噬和線粒體自噬,以恢復細胞內環(huán)境穩(wěn)態(tài)。

PCV2感染細胞通過激活AMPK/ERK/mTOR通路誘導細胞自噬,且自噬促進病毒復制[14-15]。Gu等[16]進一步分析發(fā)現(xiàn),PCV2感染通過上調細胞內Ca2+含量,引起胞內Ca2+穩(wěn)態(tài)失衡,繼而激活CaMKKβ/AMPK/mTOR和CaMKKβ/CaMKI/WIPI1通路誘導細胞自噬,Cap是介導這一過程的主要病毒蛋白。那么,PCV3 Cap是否與PCV2 Cap具有相似的功能特性,誘導細胞自噬?Geng等[17]通過質粒轉染和慢病毒介導的基因轉導在HEK-293T細胞中高效表達PCV3 Cap蛋白以研究其誘導細胞自噬的機制,結果表明,PCV3 Cap能通過抑制哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)磷酸化從而誘導細胞發(fā)生自噬,并且泛素-蛋白酶體途徑也參與這一過程。然而,在全病毒水平和宿主豬源細胞上PCV3是否能誘導細胞自噬還有待進一步研究。

細胞凋亡在病毒與細胞的博弈中扮演了重要角色。在感染早期,病毒通過抑制細胞凋亡來促進自身復制增殖;感染后期,病毒誘導細胞凋亡并促進子代病毒的釋放和傳播。因此,在病毒誘導細胞凋亡過程中病毒蛋白的抗細胞凋亡和誘導細胞凋亡活性非常重要[18]。與PCV2相似,PCV3 Cap能通過激活Caspase-9依賴的線粒體途徑誘導PK-15細胞發(fā)生凋亡。并且PCV3 Cap的表達能將細胞周期阻滯于S期,從而抑制PK-15細胞的增殖[19]。

Jiang等[13]對仔豬感染PCV3的肺部組織進行了蛋白質組學分析,篩選到了超氧化物歧化酶2(SOD2),并通過免疫印跡和免疫組化進一步證實了其在PCV3感染后表達水平上調。Chen等[20-21]研究發(fā)現(xiàn),PCV2感染誘導細胞氧化應激,可通過抑制細胞內谷胱甘肽氧化酶1(GPX1)的活性引起細胞內產生過量活性氧(ROS)。Sun等[22]研究發(fā)現(xiàn),PCV2感染誘導的內質網應激和氧化應激之間存在密切聯(lián)系,PCV2感染選擇性激活PERK通路,誘導內質網氧化還原酶1α(endoplasmic reticulum oxidoreductase 1α,ERO1α)表達上調,引起內質網ROS的產生,進而引發(fā)氧化應激。因此,PCV3感染后SOD2表達水平上升可能是感染細胞內氧化還原狀態(tài)失衡所致,即PCV3感染可能誘導氧化應激。

1.4 PCV3感染對宿主細胞先天免疫與炎癥反應的影響

病毒在與宿主的博弈中演化出了一系列策略來削弱或逃逸細胞的抗病毒免疫,從而得以生存并感染增殖。PCV2已被證明是具有免疫抑制作用的病原微生物,能通過與宿主蛋白之間復雜的相互作用調控宿主免疫和炎癥反應[23]。與PCV2相似,臨床感染PCV3的豬個體會出現(xiàn)多器官炎癥,且存在與其他致病性病原共感染的情況,這可能與PCV3感染引起宿主免疫炎癥反應紊亂相關。同時,有研究報道,在健康豬群中也存在PCV3感染,提示PCV3能逃逸宿主抗病毒免疫[2]。

宿主先天免疫反應是細胞通過模式識別受體(PRR)識別病原體攜帶的病原體相關分子模式(PAMP),并激活、介導下游相關免疫信號通路,進而誘導釋放細胞因子和干擾素。在HEK-293T細胞中的研究結果顯示,PCV3 Cap能激活NF-κB信號通路和誘導促炎細胞因子IL-6和TNF-α的轉錄表達。并且PCV3 Cap能上調RIG-I樣受體(RLRs)信號通路中的RIG-I/MDA5和Toll樣受體(RLRs)信號通路中的MyD88的轉錄水平[24]。但PCV3 Cap誘導激活NF-κB信號通路的具體機制有待進一步探索。在3D4/21細胞中瞬時轉染表達PCV3 Rep和Cap能影響促炎細胞因子TNF-α、IL-6和免疫抑制細胞因子IL-10的mRNA轉錄。這與前期研究報道仔豬接種PCV3拯救病毒的體內實驗中,血清IL-10水平持續(xù)上升的結果一致,提示PCV3感染可能通過誘導IL-10上調使宿主產生免疫抑制[7]。李萌[25]初步研究了PCV3相關蛋白誘導3D4/21細胞IL-10表達的分子機制,結果表明,PCV3 Cap相較于Rep可能是誘導IL-10上調表達的主要蛋白;與PCV2 Cap相似,NF-κB信號通路參與PCV3 Cap誘導IL-10表達上調的過程[25]。目前有關PCV3感染對細胞因子表達和炎癥反應影響的研究較少,后續(xù)相關探索將有助于更好理解PCV3亞臨床感染向臨床疾病發(fā)展的進程,以及與其他病原并發(fā)感染的可能性。

干擾素(IFN)具有廣譜抗病毒特性,是宿主先天免疫反應中重要的細胞因子,在宿主抵御病毒感染的過程中發(fā)揮重要作用。PCV2感染細胞能通過相關信號通路誘導IFN-α和IFN-γ表達,且二者能促進PCV2復制[23]。在3D4/21細胞中的研究發(fā)現(xiàn),PCV3 Rep和Cap均能上調IFN-β和IFN-γ的表達,而在誘導IFN-α表達上,Cap和Rep呈現(xiàn)了相反的效應[25]。Jiang等[13]通過蛋白質組學分析發(fā)現(xiàn),在PCV3感染的仔豬中,2′,5′-寡腺苷酸合成酶(OAS1)、干擾素誘導的GTP結合蛋白(Mx1和Mx2)、人干擾素刺激基因表達蛋白15(ISG15)、干擾素誘導的三角形四肽重復蛋白3(IFIT3)和干擾素誘導蛋白44(IFI44)等干擾素刺激基因(ISGs)表達蛋白顯著上調,提示這些ISGs蛋白可能參與PCV3感染誘導的宿主先天免疫應答。申翰欽[26]和Zhang等[27]圍繞PCV3 Cap對外源性DNA誘導細胞產生IFN-β的影響展開研究,結果顯示,PCV3 Cap抑制由刺激IFN表達DNA(ISD)誘導的IFN-β mRNA轉錄、IFN啟動子激活和TANK結合激酶1(TBK1)磷酸化,但不影響環(huán)鳥苷酸-腺苷酸合成酶(cGAS)/干擾素基因刺激蛋白(STING)誘導的IFN啟動子激活,推測PCV3 Cap可能通過干擾cGAS與ISD的結合從而抑制IFN產生。利用蛋白質體外結合實驗、LC/MS及免疫共沉淀技術,研究人員發(fā)現(xiàn)PCV3 Cap能競爭性與G3BP1結合從而抑制cGAS與G3BP1的相互作用,并且證明G3BP1參與DNA誘導的IFN-β產生且存在正向調控作用。因此,PCV3 Cap 通過與G3BP1互作干擾cGAS識別ISD從而抑制IFN表達。申翰欽[26]和Shen等[28]進一步研究PCV3 Cap對IFN-β誘導ISG表達的影響與相關機制,結果顯示,PCV3 Cap抑制IFN-β誘導的IFIT1和IFIT2轉錄,以及干擾素刺激應答元件(ISRE)啟動子的激活,提示其抑制IFN-β激活的兩面神激酶/信號傳導和轉錄激活因子(JAK/STAT)信號通路;然而PCV3 Cap不影響STAT1和STAT2表達、磷酸化水平,以及STAT1和STAT2二聚體的形成;PCV3 Cap雖然能與KPNA1相互作用,但無法競爭阻斷STAT1和KPNA1的結合,以及ISGF3復合體(激活的STAT1和STAT2與IRF9形成)入核;通過一系列pull-down和Co-IP試驗發(fā)現(xiàn),PCV3 Cap可能通過與STAT2羧基端的反式轉錄激活結構域(TAD)結合或與ISGF3的模擬物IRF9-S2C競爭結合ISRE從而抑制IFN-β誘導ISG的產生。以上研究結果表明,PCV3能通過Cap在多個途徑抑制IFN-β介導的抗病毒免疫反應,具備調控宿主先天免疫反應和逃逸宿主抗DNA病毒反應的能力。

表1 與PCV3 Cap互作的宿主蛋白

2 PCV3-宿主蛋白的相互作用

作為單鏈DNA病毒,與PCV1和PCV2類似,PCV3 Cap蛋白可能參與其病毒生命周期的多個階段。為深入了解PCV3在細胞內復制增殖的過程,Song等[29]在PK-15細胞轉染表達PCV3 Cap蛋白和GFP融合蛋白,通過免疫沉淀結合LC-MS/MS質譜技術對宿主細胞內與PCV3 Cap互作的蛋白進行了分析,共鑒定出776個蛋白質,KEGG通路富集分析顯示這些蛋白質主要涉及系統(tǒng)性紅斑狼瘡、壞死、血管平滑肌收縮、腎素分泌、病毒致癌、NOD樣受體介導信號轉導、促性腺激素釋放激素信號轉導、炎癥介質調節(jié)瞬時受體電位通道等,推測系統(tǒng)性紅斑狼瘡、壞死、血管平滑肌收縮和腎素分泌相關通路可能與PCV3感染臨床引起的豬皮炎腎病綜合征有關。

PCV4于2019年在我國湖南省首次發(fā)現(xiàn),臨床癥狀與豬圓環(huán)病毒相關疾病相似,最近在中國和韓國的養(yǎng)殖場被檢測到,被認為是威脅全球養(yǎng)豬業(yè)的潛在重要病原之一[30-34]。2022年,Zhou等[35]利用免疫共沉淀結合LC-MS質譜技術鑒定分析與PCV3或PCV4 Cap相互作用的宿主蛋白,并繪制了相互作用組圖譜,結果顯示,與PCV3 Cap潛在互作蛋白401個,其中有123個蛋白只與PCV3 Cap互作,能同時與PCV3和PCV4 Cap相互作用的蛋白共有278個;基因本體注釋與通路富集分析表明,PCV3 Cap的交集互作蛋白主要參與細胞酰胺代謝、核酸結合、核糖核蛋白復合物結合和ATP依賴的RNA解旋酶活性等細胞信號通路。

目前,通過蛋白組學研究和免疫共沉淀技術驗證了部分宿主蛋白能與PCV3 Cap結合互作,具體的互作蛋白見表1。

3 PCV3生命周期

3.1 參與PCV3生命周期的相關重要宿主因子

對PCV病毒生命周期的研究主要基于PCV1和PCV2,目前對PCV3生命周期和參與其中的細胞宿主蛋白知之甚少。在PCV2感染過程中,病毒粒子主要通過Cap與硫酸肝素、硫酸軟骨素B以不對稱方式的相互作用附著于宿主細胞表面[23,36],其入侵宿主細胞的機制主要有2種:(1)通過網格蛋白介導的胞吞作用或巨胞飲作用;(2)通過依賴Rho-GTP酶類調節(jié)肌動蛋白細胞骨架的方式[23]。然而PCV3 Cap蛋白與PCV2 Cap蛋白不同,其沒有肝素結合基序XBBXBX(B是堿性氨基酸,X是中性或疏水性氨基酸),因此PCV3結合的受體蛋白有待進一步研究明確。2021年,Shi等[37]研究發(fā)現(xiàn),PCV3能通過依賴發(fā)動蛋白-2和網格蛋白介導的內吞途徑進入PK-15細胞,并且Rab5和Rab7在PCV3的運輸和初級、次級內體定位中發(fā)揮了重要作用;內體酸化發(fā)生于病毒脫衣殼和釋放基因組的過程,在PCV3感染前對細胞進行氯化銨處理,感染細胞數(shù)和Cap蛋白的表達顯著下降。作為DNA病毒,PCV基因組的復制和轉錄,以及病毒粒子的裝配均在細胞核內進行,PCV1和PCV2 Cap蛋白的核定位信號序列(NLS)通常由氮端堿性氨基酸組成,主要介導Cap向細胞核內運輸,對病毒的復制和裝配有重要意義。Mou等[38]通過對PCV3 Cap蛋白進行截短并分析其亞細胞定位情況從而鑒定出其NLS。核仁磷酸蛋白(NPM1)是一種多功能蛋白,其參與PCV2病毒生命周期。NPM1能與Cap蛋白結合,是病毒粒子入核的核轉運受體[39]。2021年,Zhou等[40]研究發(fā)現(xiàn),PCV3 Cap氮端的前34個氨基酸殘基為其核仁定位信號(NoLS),NPM1通過PCV3 Cap的NoLS與之結合從而介導其入核,并且NMP1氮端結構域的第48位絲氨酸殘基在其中發(fā)揮重要作用。根據(jù)以上研究,我們初步繪制了PCV3病毒生命周期的模式圖(圖1)。

CME,網格蛋白介導的胞吞作用。

3.2 宿主因子對PCV3復制的影響

目前有關影響PCV3復制的宿主因子的報道僅有NPM1蛋白。Song等[29]發(fā)現(xiàn),NMP1不僅能與PCV3 Cap相互作用,還能影響病毒復制;PCV3感染上調細胞內NPM1表達并且誘導其向核外轉移至細胞質;過表達NPM1能夠促進PCV3復制,細胞內病毒DNA拷貝數(shù)和Cap表達水平均上升;而下調NPM1表達則抑制PCV3的復制,表明NPM1正調控PCV3復制。根據(jù)上述結果,研究人員推測PCV3感染可能誘導NPM1結構和功能改變(包括mRNA轉錄、核糖體生物發(fā)生和蛋白質合成),而改變的NPM1會影響PCV3復制。NPM1調控PCV3復制的分子機制有待進一步探索。

4 展望

PCV3自發(fā)現(xiàn)以來就引起了全球學者的關注和興趣,對PCV3的研究主要聚焦于病原微生物學、病原分子生物學和流行病學等方面,對其起源、遺傳多樣性和進化動態(tài)進行了一系列研究,但關于PCV3的生命周期與致病機制,目前知之甚少。病毒與宿主之間的相互作用決定了宿主細胞的命運和病毒的傳播及存活。豬圓環(huán)病毒與宿主之間存在復雜的互作網絡,其感染過程引起宿主細胞內環(huán)境改變,促使細胞演化出多種適應性應答機制以恢復穩(wěn)態(tài),而豬圓環(huán)病毒可以調控其中的一些信號通路以利于自身復制與增殖。PCV3感染可能引起宿主細胞自噬、凋亡和氧化應激,且對先天免疫與炎癥反應有一定影響。一些宿主蛋白能與PCV3 Cap結合,參與病毒生命周期,或影響病毒復制。值得注意的是,臨床癥狀涉及多系統(tǒng)炎癥和引起的損傷與PCV3感染較為密切,可能與PCV3誘導的細胞凋亡和炎癥相關信號通路有關。臨床還發(fā)現(xiàn),PCV3與其他豬病原體共感染的頻率較高,這可能是由于PCV3引起免疫抑制導致其他病原體繼發(fā)感染。后續(xù)研究可以對上述現(xiàn)象和推論進行探索,剖析相關分子機制。