外泌體治療股骨頭壞死的研究進(jìn)展

王 巖，馬劍雄 董本超，楊培川，李 巖，周麗蕓，孫 磊，靳洪震，盧 斌，田愛(ài)現(xiàn)，王 穎，柏豪豪，馬信龍

股骨頭壞死（osteonecrosis of femoral head，ONFH）是骨科臨床上常見(jiàn)的疾病，多發(fā)生于中青年患者，發(fā)病機(jī)制尚未明確且致殘率較高，嚴(yán)重影響患者的健康和生活。雖然關(guān)節(jié)置換等日趨成熟的手術(shù)技術(shù)幫助廣大ONFH 患者提高了功能恢復(fù)質(zhì)量，但是如何治療早期ONFH 并預(yù)防疾病進(jìn)展，從而延緩關(guān)節(jié)置換的時(shí)間仍然困擾著廣大學(xué)者[1-3]。目前廣泛應(yīng)用的保髖手術(shù)主要包括髓芯減壓法[4]、髓芯減壓聯(lián)合帶血管蒂[5]或不帶血管蒂的骨塊移植[6]、髓芯減壓聯(lián)合多孔材料支撐[7]、干細(xì)胞移植術(shù)[8]、截骨術(shù)[9]等幾大類(lèi)。但是這些方法的臨床療效不統(tǒng)一，仍然有很大一部分ONFH 會(huì)發(fā)展成股骨頭塌陷，最終導(dǎo)致髖關(guān)節(jié)功能喪失，而不得不進(jìn)行關(guān)節(jié)置換術(shù)。關(guān)節(jié)置換術(shù)的費(fèi)用昂貴且存在不少并發(fā)癥，例如感染、假體松動(dòng)與脫位以及假體周?chē)钦鄣?，給患者及社會(huì)帶來(lái)沉重的負(fù)擔(dān)[3-4]。因此，早期診斷并選擇合適的保髖治療手段對(duì)ONFH 患者來(lái)說(shuō)非常關(guān)鍵，能夠在臨床上減輕ONFH 給患者帶來(lái)的痛苦和傷害，造福百姓[5-6]。細(xì)胞治療由于其具有高效修復(fù)作用也逐漸成為促進(jìn)骨組織再生的常用方法，而其中分化能力較強(qiáng)的干細(xì)胞無(wú)疑是首選，然而直接使用干細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)仍存在免疫排斥、血栓形成等問(wèn)題[7]。近期研究發(fā)現(xiàn)，外泌體具備其分泌來(lái)源干細(xì)胞的一些功能，同時(shí)能避免干細(xì)胞療法的多數(shù)風(fēng)險(xiǎn)，有良好的促進(jìn)組織修復(fù)再生的應(yīng)用前景，為ONFH 的治療打開(kāi)了全新的局面[8]。本文綜述了當(dāng)前外泌體在治療ONFH 領(lǐng)域的研究現(xiàn)狀和進(jìn)展，為臨床中ONFH 的治療提供新思路和新方法。

1 ONFH

ONFH 作為一種進(jìn)行性疾病在臨床中實(shí)質(zhì)上是一個(gè)病理演變過(guò)程，壞死部位初始一般發(fā)生在股骨頭的負(fù)重區(qū)，股骨頭內(nèi)骨小梁開(kāi)始發(fā)生損傷，空間結(jié)構(gòu)在非正常應(yīng)力的作用下開(kāi)始出現(xiàn)異常，隨即骨小梁組織開(kāi)始針對(duì)損傷進(jìn)行修復(fù)，與此同時(shí)損傷和修復(fù)反復(fù)交替進(jìn)行，當(dāng)損傷大于修復(fù)時(shí)，最終導(dǎo)致整個(gè)股骨頭的壞死和塌陷。ONFH 在骨科疾病中是一類(lèi)致殘率較高的常見(jiàn)病，Mont 等[10]的研究表明，未來(lái)10 年內(nèi)全球ONFH 患者的總數(shù)仍會(huì)逐年增高。據(jù)統(tǒng)計(jì)，目前國(guó)內(nèi)ONFH 的患者數(shù)量大約達(dá)到了750 萬(wàn)，與此同時(shí)每年還會(huì)新增大量病例，其數(shù)量高達(dá)30 萬(wàn)～40 萬(wàn)左右，給我們的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)造成了很大的負(fù)擔(dān)，是目前世界骨科疾病領(lǐng)域非常棘手的難題之一[11]。國(guó)內(nèi)ONFH 流行病學(xué)顯示，我國(guó)ONFH 最常發(fā)生在40 歲以后的人群中，其中男性患者的發(fā)病時(shí)間比女性患者更早一些，且男性患者的數(shù)量約為女性患者的2 倍[12]。

當(dāng)前的研究將ONFH 的發(fā)病因素大致分為創(chuàng)傷性和非創(chuàng)傷性兩種類(lèi)型，創(chuàng)傷性因素主要包括由于外傷引起的股骨頸骨折和髖關(guān)節(jié)脫位等；非創(chuàng)傷性因素主要包括糖皮質(zhì)激素的過(guò)量使用、酗酒及一些免疫性疾病合并引起的ONFH[13]。目前來(lái)看國(guó)內(nèi)非創(chuàng)傷性O(shè)NFH 的發(fā)病率非常高且呈逐年遞增的趨勢(shì)，流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，非創(chuàng)傷性O(shè)NFH 大致占該疾病總患病人數(shù)的70%左右[14]。實(shí)際上，從ONFH 的本質(zhì)上來(lái)看，主要是由于股骨頭周?chē)霈F(xiàn)血供受阻以及生物力學(xué)環(huán)境改變等問(wèn)題，從而引起股骨頭內(nèi)骨代謝出現(xiàn)異常，最終導(dǎo)致股骨頭出現(xiàn)壞死和塌陷。這些過(guò)程可能是創(chuàng)傷、術(shù)后復(fù)位不良、糖皮質(zhì)激素、飲酒、血液發(fā)育障礙以及一些其他因素導(dǎo)致的結(jié)果[5]。

關(guān)于ONFH 的發(fā)病機(jī)制眾說(shuō)紛紜，現(xiàn)有研究成果表明ONFH 可能與以下幾個(gè)方面有關(guān)：包括骨細(xì)胞凋亡學(xué)說(shuō)[15-16]、血液凝滯學(xué)說(shuō)[17]、脂質(zhì)代謝紊亂學(xué)說(shuō)[18-19]、骨質(zhì)疏松學(xué)說(shuō)[18]等，但目前沒(méi)有一種理想且明確的假說(shuō)來(lái)完全解釋ONFH 的發(fā)生和發(fā)展，導(dǎo)致在臨床診療過(guò)程中處理該疾病的不確定因素增多，嚴(yán)重影響臨床上的療效[20]。雖然當(dāng)前相關(guān)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域?qū)NFH 的病因、發(fā)病機(jī)制、診斷以及治療等方面均進(jìn)行了大量的研究，但是對(duì)其確切的起源和機(jī)制尚沒(méi)有出現(xiàn)明確的共識(shí)。就目前的研究現(xiàn)狀來(lái)看，ONFH 其實(shí)不僅僅是由一種致病因素所導(dǎo)致的疾病發(fā)生，而是由很多復(fù)雜因素聯(lián)合作用所導(dǎo)致的最終結(jié)果[13]。

迄今為止，臨床上對(duì)于早期ONFH 的治療尚無(wú)有效且理想的手段，而且該疾病發(fā)展進(jìn)程往往難以逆轉(zhuǎn)，大部分患者到晚期后將不可避免地出現(xiàn)股骨頭壞死和進(jìn)一步塌陷，甚至出現(xiàn)髖關(guān)節(jié)的骨性關(guān)節(jié)炎，累及整個(gè)髖部，嚴(yán)重影響患者活動(dòng)，到這種程度后，通常只能采取髖關(guān)節(jié)置換的治療方式來(lái)應(yīng)對(duì)，而關(guān)節(jié)置換的費(fèi)用昂貴且存在不少并發(fā)癥，這些問(wèn)題將會(huì)同時(shí)給患者和社會(huì)帶來(lái)沉重的打擊與負(fù)擔(dān)[21]。因此，探討ONFH 的早期非手術(shù)治療方案始終作為骨科疾病領(lǐng)域的重點(diǎn)及難點(diǎn)，被廣泛探索和研究[22-23]。

2 外泌體

近年來(lái)，細(xì)胞治療在治療多種難治性疾病中的潛力被逐漸挖掘，例如治療晚期肝硬化、ONFH、惡性腫瘤、心肌梗死等。從多種組織中（包括骨髓、滑膜、滑液等）提取的間充質(zhì)干細(xì)胞具有頑強(qiáng)的生命力及較高的多向分化潛能（成軟骨、骨、肌肉、脂肪分化等）[24]。但直接使用細(xì)胞進(jìn)行治療仍具有一定缺陷，例如移植細(xì)胞會(huì)導(dǎo)致免疫排異反應(yīng)、栓塞等[25]。因此，需要找到一種新的治療方法，使其具有細(xì)胞治療的優(yōu)點(diǎn)，但同時(shí)能避免細(xì)胞移植所帶來(lái)的風(fēng)險(xiǎn)。近來(lái)大量研究表明，細(xì)胞治療主要是通過(guò)旁分泌機(jī)制來(lái)提高損傷部位周?chē)屑?xì)胞的活性，而不是簡(jiǎn)單的向特定實(shí)質(zhì)細(xì)胞分化并修復(fù)受損組織。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)在旁分泌機(jī)制中，外泌體發(fā)揮了重要的作用。外泌體最早是在1980 年由Eberhard G.Trams和R.M.Johnstone 發(fā)現(xiàn)并命名。外泌體是由來(lái)源于細(xì)胞內(nèi)的多泡體與細(xì)胞膜融合而形成的，是一種直徑小于150 nm 的囊泡，其在細(xì)胞間通訊中發(fā)揮著重要的作用[26]。外泌體的膜蛋白在靶向結(jié)合過(guò)程中有著重要的作用，內(nèi)含物主要為蛋白質(zhì)和RNA。隨著研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)外泌體功能多樣，其可參與到機(jī)體免疫應(yīng)答、抗原遞呈、細(xì)胞遷移、細(xì)胞分化、腫瘤侵襲等方面的信號(hào)交流。外泌體來(lái)源豐富，機(jī)體的組織、體液、細(xì)胞間都有外泌體的存在。目前分離外泌體的方法主要包括超速離心法、密度梯度離心法、超濾法、免疫磁珠抗體捕獲法、凝膠層析法、商用試劑盒法等。目前研究認(rèn)為，外泌體具有很強(qiáng)的修復(fù)功能，與機(jī)體的新陳代謝、組織修復(fù)、免疫調(diào)節(jié)、腫瘤的發(fā)生和發(fā)展等密切相關(guān)，并減少了諸如血管栓塞、免疫排異等不良反應(yīng)[27-28]。其中，間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的外泌體具備其分泌來(lái)源干細(xì)胞的一些功能，同時(shí)能避免干細(xì)胞療法存在的多數(shù)風(fēng)險(xiǎn)，具有良好的促進(jìn)組織修復(fù)再生的應(yīng)用前景。

外泌體來(lái)源豐富，機(jī)體的組織、體液、細(xì)胞間都有外泌體的存在。不同細(xì)胞來(lái)源的外泌體表現(xiàn)出異質(zhì)性特征和成分。人們發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）廣泛分布于骨髓、脂肪組織、臍帶、羊水等全身，在骨代謝、血管生成、免疫調(diào)節(jié)等方面發(fā)揮著不可或缺的作用[29]。由于MSCs 的多向分化潛能，包括成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞，MSCs 移植已廣泛應(yīng)用于再生醫(yī)學(xué)[30]。目前用于骨再生與修復(fù)研究的干細(xì)胞主要來(lái)源包括臍血間充質(zhì)干細(xì)胞（ucMSCs）、脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞（ADSCs） 和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）。研究證實(shí)，臍血來(lái)源的ucMSCs 具有較弱的成骨分化能力。ADSCs 是一種有前景的間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的外泌體（MSC-Exos），可用于骨再生的來(lái)源。而B(niǎo)MSCs 是成骨細(xì)胞的主要來(lái)源，具有顯著的成骨分化能力。研究表明，BMSCs 比ADSCs 對(duì)成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)條件更敏感。與ADSCs 相比，BMSCs 具有更強(qiáng)的成骨誘導(dǎo)能力[31]。因此，從BMSCs 中提取外泌體用于骨再生修復(fù)更為合理。

3 外泌體在ONFH 領(lǐng)域的應(yīng)用

ONFH 是一類(lèi)復(fù)雜的骨科疾病，無(wú)論是在早期診斷還是治療過(guò)程中，均面臨著一些關(guān)鍵共性難題。其中早期ONFH 只能通過(guò)MRI 掃描來(lái)確定診斷，費(fèi)用昂貴且不方便。尋找一種經(jīng)濟(jì)方便的方法篩選ONFH 十分重要。經(jīng)初步篩查后，可再使用MRI 進(jìn)行掃描進(jìn)一步確診。循環(huán)外泌體代表了多種疾病新的生物標(biāo)志物。針對(duì)循環(huán)外泌體水平是否可以作為ONFH 的診斷生物標(biāo)志物，學(xué)者進(jìn)行了相關(guān)研究。Zhu 等[32]研究首次報(bào)道了類(lèi)固醇誘導(dǎo)的ONFH 患者的循環(huán)外泌體水平顯著低于健康人群。

而在治療方面，近期研究證據(jù)顯示，干細(xì)胞來(lái)源的外泌體可以增強(qiáng)成骨細(xì)胞樣細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的活性，減輕大鼠骨缺損模型的缺損面積，說(shuō)明其可以促進(jìn)骨再生，并增強(qiáng)血管生成[33]。另外，相關(guān)研究進(jìn)一步證實(shí)了外泌體可以有效地減少軟骨細(xì)胞中炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生，并最終增強(qiáng)軟骨組織的再生，從而治療骨性關(guān)節(jié)炎[34]。在ONFH 領(lǐng)域，來(lái)自人類(lèi)滑膜來(lái)源的干細(xì)胞分泌的外泌體可以通過(guò)增強(qiáng)增殖和抗凋亡作來(lái)預(yù)防糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的大鼠ONFH，且人類(lèi)誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞衍生的外泌體可以通過(guò)促進(jìn)血管生成來(lái)預(yù)防ONFH[19-20]。這種外泌體治療在再生治療中發(fā)揮著越來(lái)越重要的作用。然而，與藥物治療不同的是，BMSCs 是位點(diǎn)調(diào)控的，可根據(jù)局部微環(huán)境分泌不同濃度的生物活性因子和信號(hào)[35]。因此，BMSCs 來(lái)源的外泌體能否完全替代外泌體發(fā)揮其治療作用還有待進(jìn)一步研究。此外，還應(yīng)考慮使用外泌體的潛在風(fēng)險(xiǎn)。越來(lái)越多的證據(jù)表明，細(xì)胞通過(guò)釋放和遞送microRNAs 到腫瘤釋放外泌體中進(jìn)行交流[36]。也有報(bào)道稱(chēng)，外泌體載體可以轉(zhuǎn)移與神經(jīng)退行性疾病相關(guān)的毒性蛋白[37]。因此，使用BMSCs 來(lái)源外泌體的安全性也需要進(jìn)一步評(píng)估。所以，在外泌體治療應(yīng)用于臨床之前，還需要進(jìn)行深入地研究，包括標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)、外泌體表征、改進(jìn)分離、產(chǎn)量?jī)?yōu)化、可重復(fù)性、效力測(cè)定方法的開(kāi)發(fā)以及特定臨床適應(yīng)證的劑量確定等，都需要進(jìn)一步深入探討。

由于股骨頭壞死病因不同，來(lái)源不同的外泌體發(fā)揮的作用也不相同。對(duì)于激素性股骨頭壞死來(lái)說(shuō)，BMSCs 來(lái)源的外泌體可以上調(diào)與骨修復(fù)有關(guān)的生長(zhǎng)因子、骨形態(tài)發(fā)生蛋白、轉(zhuǎn)錄生長(zhǎng)因子等，從而誘導(dǎo)BMSCs 向骨分化。來(lái)自富含血小板血漿的外泌體對(duì)糖皮質(zhì)激素內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡具有抗凋亡作用[38-39]；對(duì)于創(chuàng)傷性股骨頭壞死來(lái)說(shuō)，有研究認(rèn)為BMSCs 來(lái)源的外泌體中較低的miR-224-3p水平促進(jìn)創(chuàng)傷性O(shè)NFH 的血管生成[40-41]。然而對(duì)于非創(chuàng)傷性股骨頭壞死組織，CD41 缺失外泌體損害MSCs 的成骨分化和遷移[42]。

此外，目前在骨科領(lǐng)域，有關(guān)外泌體治療相關(guān)骨科疾病的研究相對(duì)較少，尤其在ONFH 的治療研究中，且其作用機(jī)制尚未完全明確。最近有研究發(fā)現(xiàn)，使用基因工程等技術(shù)對(duì)外泌體進(jìn)行修飾或功能化可以達(dá)到更好的治療效果[21]。因此，基于當(dāng)前國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀，探索一種修飾干細(xì)胞來(lái)源外泌體的方法和手段，使其能夠具有治療ONFH 的生物功能，在ONFH 的早期干預(yù)治療研究中是一個(gè)亟待探索的全新領(lǐng)域。

4 總結(jié)與展望

目前ONFH 發(fā)病率呈逐年增高趨勢(shì)，是國(guó)內(nèi)外關(guān)注的熱點(diǎn)和重點(diǎn)。但因其致病機(jī)制仍未明確，目前臨床上尚無(wú)有效的早期治療方式，患者晚期通常只能進(jìn)行髖關(guān)節(jié)置換手術(shù)。但關(guān)節(jié)置換的費(fèi)用昂貴，且后期不可避免地會(huì)出現(xiàn)一些并發(fā)癥，給患者帶來(lái)沉重的身心傷害和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。因此，迫于臨床需求，探討ONFH 的早期非手術(shù)治療方案一直是骨科研究領(lǐng)域的難點(diǎn)和熱點(diǎn)。細(xì)胞治療具有高效修復(fù)作用，逐漸成為促進(jìn)骨組織再生的常用方法，其中分化能力較強(qiáng)的干細(xì)胞無(wú)疑是首選，然而直接使用干細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)仍存在免疫排斥、血栓形成等瓶頸。外泌體具備其分泌來(lái)源干細(xì)胞的一些功能，同時(shí)能避免干細(xì)胞療法的多數(shù)風(fēng)險(xiǎn)，為ONFH 的治療打開(kāi)了全新的局面。雖然目前此領(lǐng)域已有相關(guān)研究顯示其具有一定的效果，但是距離臨床使用和推廣仍有很長(zhǎng)一段路需要探索。