新藤黃酸增強侖伐替尼在肝細(xì)胞癌中的敏感性及其機制研究

龐夢迪,孫 靖,賈步云,張忠偉,楊奇奇,陳衛(wèi)東,4,5,唐麗琴

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,安徽 合肥 230012;2.安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部,安徽 合肥 230022;3.安徽中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院,安徽 合肥 230012;4.省部共建安徽道地中藥材品質(zhì)提升協(xié)同創(chuàng)新中心,安徽 合肥 230012;5.中藥復(fù)方安徽省重點實驗室,安徽 合肥 230012;6.中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)附屬第一醫(yī)院,安徽 合肥 230001)

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是最常見的原發(fā)性肝癌,是全球第三大癌癥相關(guān)死亡原因［1］。目前,治療HCC的主要手段有腫瘤病灶切除、化學(xué)治療、放射治療和肝移植等。由于HCC前期無典型癥狀,并且缺乏特異性診斷該病的生物學(xué)標(biāo)志物,患者確診時多已發(fā)展至中晚期,手術(shù)治療的機會降低［2］。侖伐替尼是一種新型的HCC一線治療藥物,在2018年被美國食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)用于HCC的治療［3］,已被證實可顯著改善晚期HCC的無進展生存期［4］。臨床試驗發(fā)現(xiàn),與采用索拉菲尼治療的晚期肝癌患者比較,采用侖伐替尼治療的晚期肝癌患者總生存期更長［5］。然而,由于原發(fā)性或適應(yīng)性耐藥,靶向治療的耐藥情況不容忽視,盡管侖伐替尼是晚期HCC治療的理想靶向藥物,但其治療的總有效率只有24%,并且已有研究［6-8］報道侖伐替尼耐藥病例。侖伐替尼耐藥成為改善肝癌患者預(yù)后的主要障礙［2］,除了迫切需要闡明肝癌患者侖伐替尼耐藥的機制外,另一個策略是尋找可能使侖伐替尼在HCC治療中敏化的候選藥物［9］。有研究［10-12］表明,臨床上采用侖伐替尼聯(lián)合抗程序性死亡受體1藥物派姆單抗、侖伐替尼聯(lián)合吉非替尼治療HCC患者,均取得良好的治療效果。聯(lián)合用藥是目前非常具有前景的腫瘤治療策略,選用作用機制不同的兩種藥物聯(lián)用,發(fā)揮協(xié)同作用,可提高療效而不增加毒性,同時減少耐藥現(xiàn)象的產(chǎn)生,對提高靶向藥物敏感性具有重要的臨床意義。

近年來,中藥抗腫瘤作用在臨床上應(yīng)用得到重視,大量臨床和實驗研究表明,中藥輔助治療腫瘤是一種安全、有效的途徑［13］。中醫(yī)藥在抗惡性腫瘤治療領(lǐng)域取得了一定進展,尤其是在減毒增效、逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥方面,可以達到減輕毒性、增加療效的目的,從而使患者更好地完成規(guī)范化治療［14］。藤黃是藤黃科植物藤黃的干燥樹脂,具有攻毒蝕瘡、破血散結(jié)等功效。新藤黃酸(gambogenic acid,GNA)是從中藥藤黃中分離出來的重要活性成分,現(xiàn)代研究［15］表明,GNA作為藤黃中的活性成分之一,具有良好的抗腫瘤活性。GNA具有多種抗癌活性,因此其作為潛在的抗癌藥物,得到了越來越多的關(guān)注。課題組先前的研究［16］表明,在HepG2細(xì)胞的體外藥效學(xué)實驗中,無毒劑量的GNA可以通過抑制mRNA和蛋白表達而成為ATP結(jié)合轉(zhuǎn)運蛋白B1(ATP-binding cassette transporter B1,ABCB1)和三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運蛋白G2(adenosine triphosphate binding cassette transporter G2,ABCG2)的潛在抑制劑,其機制與下調(diào)孕烷X受體(pregnane X receptor,PXR)表達有關(guān)。課題組后續(xù)研究［17］證實,GNA在一定濃度范圍內(nèi)對HepG2/Adr細(xì)胞具有逆轉(zhuǎn)作用,GNA可影響HepG2/Adr細(xì)胞內(nèi)P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)的功能和表達,增加HepG2/Adr細(xì)胞中阿霉素和紫杉醇的化學(xué)敏感性,逆轉(zhuǎn)HepG2/Adr細(xì)胞的多藥耐藥,并促進細(xì)胞凋亡。本研究觀察GNA協(xié)同侖伐替尼對腫瘤小鼠模型的藥效及作用機制。

1 材料

1.1 主要儀器 十萬分子一電子分析天平(AB135-S):德國梅特勒—托利多公司;超靈敏多功能成像儀(AMERSHAM TMAGER 600):美國General Electric公司;生物組織包埋機(ZT-12M):湖北亞光;顯微鏡(CX41):OLYMPUS。離心機(LC-4016):安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司;電泳儀(DYY-7C):北京市六一儀器廠。

1.2 主要試劑 GNA(純度≥98%)由安徽中醫(yī)藥大學(xué)GNA課題組提供;侖伐替尼(HY10981):MCE公司;PXR抗體(DF6478):江蘇親科生物研究中心有限公司;P-gp(ab170904):艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司;細(xì)胞色素P450 3A4酶(cytochrome P450 3A4,CYP3A4;18227-1-AP)、乳腺癌耐藥蛋白(breast cancer resistant protein,BCRP;27286-1-AP)、B淋巴細(xì)胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2;26593-1-Ig)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2-associated X,Bax;60267-1-Ig)、P53(60283-2-Ig)、cleaved-caspase-3(66470-2-Ig):武漢三鷹生物技術(shù)有限公司;GAPDH(批號 R24404):正寧生物;TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(B014):Ebiogo公司。

1.3 動物 雄性BALB/c小鼠,體質(zhì)量22～25 g,購自杭州子源實驗動物科技有限公司［生產(chǎn)許可證號 SCXK(浙)2019-0004］。所有實驗均得到安徽中醫(yī)藥大學(xué)動物倫理委員會的批準(zhǔn),動物實驗倫理編號為AHUCM-mouse-2022148。小鼠常規(guī)喂養(yǎng),自由飲水,溫度(24.0±2.0)℃,相對濕度(55±5)%,12 h暗光周期,適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

2 方法

2.1 H22荷瘤小鼠模型的建立 H22肝癌細(xì)胞在1640培養(yǎng)基(含10% FBS,1%青霉素鏈霉素)中培養(yǎng),置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),選取對數(shù)生長期的細(xì)胞進行實驗。將細(xì)胞密度用PBS稀釋為1×107/mL,將所述細(xì)胞皮下注射到小鼠右腋,每只小鼠接種0.2 mL,當(dāng)腫瘤體積達到約100 mm3時,將小鼠隨機分為模型組(生理鹽水)、GNA(20 mg/kg)組、侖伐替尼(10 mg/kg)組、GNA(20 mg/kg)+侖伐替尼(10 mg/kg)組,每組10只。各給藥組小鼠連續(xù)灌胃2周,每日1次。給藥結(jié)束后將小鼠處死,收集血液、心、肝、脾、肺、腎和腫瘤組織。血清樣本在4 ℃下,以3 000 r/min離心10 min后收集。將部分肝臟和腫瘤組織固定在10%福爾馬林溶液中進行組織學(xué)分析,其余組織立即冷凍在-80 ℃冰箱以備進一步研究。

2.2 采用蘇木精—伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色法觀察H22荷瘤小鼠主要臟器病理變化 將小鼠心、肝、脾、肺、腎組織在10%甲醛中固定,進行病理檢查,乙醇脫水,二甲苯清洗,石蠟包埋,切片和烘干,HE染色,并在顯微鏡下觀察,以評估GNA和侖伐替尼對動物的安全性。其余腫瘤組織存放于-80 ℃冰箱,備用。

2.3 采用TUNEL熒光染色觀察H22荷瘤小鼠腫瘤組織的凋亡 將H22荷瘤小鼠腫瘤組織切片放入干燥箱烤片,依次過二甲苯、乙醇,將切片流水沖洗干凈,滴加DNase的蛋白酶K,37 ℃培養(yǎng)箱孵育。PBS沖洗3次。滴加TUNEL檢測液,培養(yǎng)箱孵育。PBS沖洗后封片,數(shù)字切片掃描儀掃描熒光切片。

2.4 Western blot法檢測PXR、P-gp、BCRP、CYP3A4、Bcl-2、P53、Bax、cleaved-caspase-3蛋白表達水平 稱取100 mg H22荷瘤小鼠的腫瘤組織,加入RIPA裂解液,冰上裂解,離心,收集上清,采用BCA試劑盒檢測蛋白濃度,加入蛋白上樣緩沖液,進行SDS-PAGE電泳分離,轉(zhuǎn)膜,封閉,加入一抗GAPDH、PXR、P-gp、BCRP、CYP3A4、Bcl-2、P53、Bax、cleaved-caspase-3孵育過夜,清洗后二抗孵育2 h,超靈敏多功能曝光成像儀曝光處理,計算目的蛋白和內(nèi)參蛋白灰度值之比,實驗重復(fù)3次。

3 結(jié)果

3.1 GNA聯(lián)合侖伐替尼對移植瘤模型小鼠腫瘤質(zhì)量及體質(zhì)量的影響 與模型組比較,侖伐替尼組、GNA+侖伐替尼組小鼠腫瘤質(zhì)量顯著降低(P<0.05);與侖伐替尼組比較,GNA+侖伐替尼組小鼠腫瘤質(zhì)量顯著降低(P<0.05)。給藥前后GNA組與侖伐替尼組的小鼠體質(zhì)量無明顯變化(P>0.05),GNA+侖伐替尼組小鼠體質(zhì)量從第7天開始顯著降低(P<0.05)。結(jié)果說明GNA與侖伐替尼聯(lián)用可以顯著抑制荷瘤小鼠體內(nèi)的腫瘤生長,且效果優(yōu)于GNA單用和侖伐替尼單用。見圖1。

注:A.模型組;B.GNA組;C.侖伐替尼組;D. GNA+侖伐替尼組;與模型組比較,*P<0.05;與侖伐替尼組比較,#P<0.05;與給藥第1天比較,aP<0.05

3.2 GNA聯(lián)合侖伐替尼對移植瘤模型小鼠各臟器的影響 與模型組比較,各治療組小鼠的主要器官(心、肝、脾、肺、腎)均未出現(xiàn)明顯病變,提示藥物治療對這些臟器無不良影響;結(jié)合GNA+侖伐替尼組小鼠體質(zhì)量顯著下降,而其余各組小鼠體質(zhì)量無明顯變化,可以認(rèn)為,GNA(20 mg/kg)+侖伐替尼(10 mg/kg)組的給藥劑量比較安全。見圖2。

3.3 GNA聯(lián)合侖伐替尼對移植瘤模型小鼠腫瘤組織細(xì)胞凋亡的影響 與模型組比較,各給藥組均發(fā)生了明顯的細(xì)胞凋亡;GNA+侖伐替尼組細(xì)胞凋亡較侖伐替尼組更加明顯。結(jié)果提示GNA聯(lián)合侖伐替尼增加小鼠異位移植瘤組織的細(xì)胞凋亡。見圖3。

注:綠染的細(xì)胞即為發(fā)生凋亡的細(xì)胞

3.4 GNA聯(lián)合侖伐替尼對移植瘤小鼠模型組織中PXR、P-gp、BCRP、CYP3A4、P53、Bax、Bcl-2、cleaved-caspase-3蛋白表達水平的影響 與模型組比較,GNA組PXR、P-gp蛋白表達水平顯著降低(P<0.05);侖伐替尼組P-gp蛋白表達水平顯著降低(P<0.05),P53、cleaved-caspase-3蛋白表達水平顯著上升(P<0.05);GNA+侖伐替尼組PXR、P-gp、BCRP、CYP3A4、Bcl-2蛋白表達水平顯著降低(P<0.05),P53、Bax、cleaved-caspase-3蛋白表達水平顯著上升(P<0.05)。與侖伐替尼組比較,GNA+侖伐替尼組PXR、P-gp、BCRP、CYP3A4、Bcl-2蛋白表達水平顯著降低(P<0.05),Bax蛋白表達水平顯著上升(P<0.05)。結(jié)果說明GNA與侖伐替尼聯(lián)用抑制了腫瘤組織內(nèi)核受體PXR及下游代謝酶和轉(zhuǎn)運體的表達,增加侖伐替尼在腫瘤組織中的蓄積,提高藥效,并且調(diào)控相關(guān)凋亡蛋白,誘導(dǎo)腫瘤組織的細(xì)胞凋亡。見圖4。

注:A.模型組;B.GNA組;C.侖伐替尼組;D.GNA+侖伐替尼組;與模型組比較,*P<0.05;與侖伐替尼組比較,#P<0.05

4 討論

HCC是世界范圍內(nèi)常見的一種癌癥,是一種高度血管化的腫瘤［18］。HCC的監(jiān)測、診斷和管理取得了較大的進步［19］,盡管該疾病的發(fā)病率在下降,但疾病的特定死亡率仍然很高［20］。GNA是來源于中藥藤黃的主要活性成分,藥理學(xué)研究表明,GNA抗腫瘤活性強、抗癌譜廣。侖伐替尼主要由CYP3A4代謝,并作為ATP結(jié)合盒(ABC)轉(zhuǎn)運蛋白的底物,如P-gp和BCRP,分別由ABCB1和ABCG2基因編碼［21-23］。P-gp、BCRP和多藥耐藥相關(guān)蛋白2也可能在侖伐替尼藥物代謝動力學(xué)中發(fā)揮作用。PXR是核受體超家族的典型成員,PXR可以被內(nèi)源性和外源性物質(zhì)激活。PXR不僅在正常組織中表達,而且在多種類型的人類癌癥中表達,包括骨肉瘤［24］、結(jié)腸癌［25］等。最重要的是,PXR在腫瘤組織中的表達水平通常高于非腫瘤組織。新的研究［26］還表明,PXR參與細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期阻滯、細(xì)胞增殖、血管生成和氧化應(yīng)激等過程,這些過程與癌癥密切相關(guān)。有研究［27］報道,PXR參與糖脂代謝、類固醇激素穩(wěn)態(tài)、膽汁酸代謝等,可通過調(diào)控代謝酶(如CYP3A)和轉(zhuǎn)運體(如P-gp)的表達,來消除異源生物質(zhì)和內(nèi)毒素可能對機體造成的損傷。目前,尚未有研究闡明核受體與耐藥現(xiàn)象之間的關(guān)系。本研究旨在探討GNA通過調(diào)控PXR增強HCC對侖伐替尼的敏感性,詮釋GNA協(xié)同治療HCC的優(yōu)勢和機制,為侖伐替尼的聯(lián)合用藥提供科學(xué)依據(jù)。

研究表明,PXR與腫瘤細(xì)胞的凋亡有關(guān),并且可能是多藥耐藥的重要因素。2005年,Zucchini等［28］證明了在人和大鼠肝細(xì)胞中,PXR表達對于Bcl-2和Bcl-xL上調(diào)是必需的。PXR可能通過同時調(diào)節(jié)解毒和細(xì)胞凋亡途徑來保護肝臟免受有害化學(xué)物質(zhì)的侵害。Yasuda等［29］研究表明,酮康唑和異硫氰酸苯乙酯通過抑制PXR調(diào)控的不同途徑增強了鉑類化合物的抗腫瘤活性。本研究中GNA與侖伐替尼聯(lián)用后,促凋亡蛋白Bax、cleaved-caspase-3表達水平升高,抑凋亡蛋白Bcl-2表達水平降低,從而誘導(dǎo)了腫瘤組織細(xì)胞的凋亡,并且這與已報道的GNA對癌細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白的作用基本相符［30］。

本研究中動物給藥劑量選定GNA為20 mg/kg與侖伐替尼聯(lián)用［31-32］,是因為研究結(jié)果表明20 mg/kg GNA有抑瘤趨勢,且毒性較小,排除了GNA毒性對實驗結(jié)果的影響;侖伐替尼劑量按照臨床上用量及人與小鼠體表面積換算常數(shù)得到,然而2.5 mg/kg侖伐替尼臨床用量幾乎無抑瘤作用,因此在本研究中增加給藥劑量,以10 mg/kg侖伐替尼進行后續(xù)實驗［33-35］。本研究結(jié)果表明,GNA聯(lián)合侖伐替尼對異位移植腫瘤小鼠HCC增殖具有抑制作用,作用強于侖伐替尼單用。GNA和侖伐替尼聯(lián)用的小鼠腫瘤組織中,細(xì)胞凋亡率高于侖伐替尼組。進一步的機制研究發(fā)現(xiàn),GNA與侖伐替尼聯(lián)用的小鼠腫瘤組織內(nèi)核受體PXR及下游代謝酶和轉(zhuǎn)運體的表達均被抑制,表明其可能通過減少侖伐替尼在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的代謝,增加侖伐替尼的蓄積,從而提高藥效。GNA聯(lián)合侖伐替尼可以使腫瘤組織中促凋亡蛋白表達水平上調(diào),抑凋亡蛋白表達水平下調(diào),從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡進程。

綜上所述,GNA與侖伐替尼聯(lián)用較侖伐替尼單用更能抑制小鼠腫瘤的生長,兩藥聯(lián)用可達到協(xié)同增效的作用,該作用與GNA調(diào)控PXR,下調(diào)代謝酶和轉(zhuǎn)運體的表達水平以及調(diào)節(jié)相關(guān)凋亡蛋白的表達水平有關(guān)。