閉鎖連接蛋白-1 核酸適配體的篩選與初步應(yīng)用

李玉娟，張瀚文，劉珊，王佳平，李勇枝

（1.北京理工大學(xué) 生命學(xué)院，北京 100081；2.中國(guó)航天員科研訓(xùn)練中心航天員健康中心重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100094）

腸上皮屏障對(duì)維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)、防護(hù)人體健康具有重要作用.腸上皮細(xì)胞間的連接是腸上皮屏障的重要構(gòu)成[1]，主要包括緊密連接、黏附連接、橋粒、縫隙連接等[2].其中，緊密連接主要是由閉鎖連接蛋白-1（Zonula Occludens-1，ZO-1）、閉合蛋白（Claudins）、咬合蛋白（Occludin，OCN）等一系列跨膜蛋白構(gòu)成的蛋白復(fù)合體.ZO-1 作為緊密連接蛋白復(fù)合體中的一種重要蛋白，可以與OCN、Claudins、α-連環(huán)蛋白等進(jìn)行相互作用，調(diào)節(jié)腸上皮細(xì)胞旁路的滲透性直接保護(hù)腸屏障[3?4].ZO-1 可將緊密連接與構(gòu)成腸上皮細(xì)胞骨架的肌動(dòng)蛋白相連，參與調(diào)節(jié)腸上皮細(xì)胞內(nèi)肌動(dòng)蛋白絲的收縮，進(jìn)而維持腸上皮屏障的低滲透性[5?6].ZO-1 蛋白還可以招募并高度富集緊密連接相關(guān)蛋白（如，帶蛋白Cingulin）到其相應(yīng)位點(diǎn)，從而維持緊密連接有助于保護(hù)腸屏障的完整性[7?8].ZO-1 能夠直接與細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子（如ZO-1 相關(guān)核酸結(jié)合蛋白、轉(zhuǎn)錄共激活因子相關(guān)蛋白等）進(jìn)行相互作用[9]，調(diào)控腸上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖[10]，以及胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)（如：Wnt/β-catenin 信號(hào)通路）而有助于腸黏膜修復(fù)[10?11]，以保護(hù)腸黏膜屏障的正常功能.綜上所述，ZO-1 蛋白在維持腸上皮屏障的完整性中具有關(guān)鍵作用.

目前，檢測(cè)ZO-1 的常用方法為免疫熒光法（immunofluorescence，IF）、蛋白質(zhì)印跡法（western blot，WB），這兩種方法均使用了ZO-1 抗體.但抗體的成本相對(duì)較高、穩(wěn)定性較差、且不易運(yùn)輸與保存，因此也需要開發(fā)一種成本較低、穩(wěn)定性較高、特異性強(qiáng)的新型工具分子，實(shí)現(xiàn)生物樣本中ZO-1 的檢測(cè).核酸適配體（aptamer，APT）是近年來(lái)新興熱點(diǎn)識(shí)別分子，是一種序列較短的、與配體具有高特異性與高親和力的單鏈核苷酸（DNA 或RNA），其易于化學(xué)合成且成本較低、化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定[12]，已被廣泛運(yùn)用于生物成像、目標(biāo)物分析檢測(cè)[13]、藥物遞送[14?15]等領(lǐng)域.目前，尚未見ZO-1 核酸適配體（APTZO-1）的篩選及其應(yīng)用.文中以ZO-1 為篩選靶標(biāo)，采用配體指數(shù)富集系統(tǒng)進(jìn)化（systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX）技術(shù)，篩選APTZO-1并獲得其序列，進(jìn)一步考察APTZO-1對(duì)ZO-1 的親和力與特異性.將與ZO-1 的親和力最強(qiáng)的APTZO-1進(jìn)行熒光標(biāo)記，在人結(jié)直腸腺癌細(xì)胞（Caco-2）、人腦微管內(nèi)皮細(xì)胞（hCMEC/D3）兩種細(xì)胞系上的ZO-1 進(jìn)行初步定位與半定量分析應(yīng)用研究，并與傳統(tǒng)抗體法進(jìn)行了比較.本研究有望為生物樣本中ZO-1 的定性、定量檢測(cè)提供一種新型的、親和力高及特異性強(qiáng)的工具分子.

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器與材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料

甲苯磺?；胖椋═MB）、鏈霉親和素磁珠（SMB）（Dynal，Norway）；寡核苷酸（ssDNA）隨機(jī)文庫(kù)、上游與下游引物及生物素修飾的上下游引物（上海生工生物工程有限公司）；pEASY-T1 細(xì)胞克隆試劑盒（北京全式金生物技術(shù)有限公司）；柱式純化試劑盒（TaKaRa 公司）；ZO-1（Cloud-Clone Corp 公司）；氯化鉀、氯化鈉、氫氧化鈉（北京化學(xué)試劑公司）；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記鏈霉親和素（streptavidin-HRP）、TMB顯色液與終止液（碧云天生物技術(shù)研究所）等.

用于SELEX 篩選的ssDNA 文庫(kù)大小為81 nt，兩端各有18 nt 的固定序列，中間為45 nt 的隨機(jī)序列（5′-3′序列為ATCCAGAGTGACGCAGCA-N45-TGGACACGGTGGCTTAGT），由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成.PCR 引物使用Primer Design 軟件設(shè)計(jì)，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，具體設(shè)計(jì)見表1.

表1 PCR 引物設(shè)計(jì)Tab.1 The design of PCR primers

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

磁力器（Dynal，Norway）；Maltiskon Mk3 酶標(biāo)儀（美國(guó) Thermo 公司）；紫外凝膠成像系統(tǒng)（北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司）；紫外可見分光光度計(jì)（Shimadzu，Japan）；PCR 儀（R232，MJ Research 公司）；超分辨顯微成像系統(tǒng)（N-SIM E，NiKon）等.

1.2 核酸適配體的篩選

1.2.1 初級(jí)文庫(kù)的制備與篩選

為進(jìn)一步篩選初級(jí)文庫(kù)，需制備TMB-ZO-1 復(fù)合體.取TMB 并用Buffer B（2.96 g NaH2PO4·H2O、29.01 g Na2HPO4·12H2O、1 L ddH2O，pH=7.4）清洗兩次，用磁力器收集后加入Buffer B 重懸.加入目標(biāo)蛋白溶液與Buffer C（39.64 g 硫酸銨、1 L Buffer B），于室溫旋轉(zhuǎn)過(guò)夜孵育.收集磁珠，加入 Buffer D（100 mL 0.01 M PBS、0.88 g NaCl），于室溫旋轉(zhuǎn)孵育2 h.收集磁珠并用Buffer E（10 mL 0.01 M PBS、0.88 g NaCl、0.05%Tween 20）清洗兩次，最終用Buffer E 重懸.各實(shí)驗(yàn)材料用量如表2.

表2 TMB-蛋白復(fù)合體的制備Tab.2 Preparation of TMB-protein complex

將1 OD ssDNA 文庫(kù)溶于240 μL Buffer E，與75 μL重懸后的磁珠-蛋白復(fù)合體混合，于常溫孵育2 h，進(jìn)行第1 輪篩選.孵育后，使用Buffer D 清洗磁珠3 次，用50 μL TE 緩 沖 液（10 mmol/L Tris-HCl、1 mmol/L EDTA，pH=8.0）重懸磁珠，于95 °C 加熱15 min，磁分離2 min，收集上清.

1.2.2 初級(jí)文庫(kù)的擴(kuò)增與鑒定

對(duì)篩選得到的ssDNA 進(jìn)行擴(kuò)增，需使用P1 與P4引物.同時(shí)，設(shè)置陰性對(duì)照擴(kuò)增.PCR 反應(yīng)體系為：1.5 μL 模板、2 μL P1、2 μL P4、19.5 μL ddH2O、25 μL GoTaq? Master Mix.擴(kuò)增后進(jìn)行鑒定，Marker 與PCR產(chǎn)物的上樣量均為4 μL，110 V 恒壓電泳45 min.

1.2.3 次級(jí)文庫(kù)的制備與篩選

上一輪篩選到的ssDNA 經(jīng)擴(kuò)增、純化后，需制備成單鏈以用于下一輪篩選.根據(jù)SMB 推薦固載量，取適量體積的SMB 磁珠，用1×B&W buffer（10 mmol/L Tris-HCl、1 mmol/L EDTA、2 mol/L NaCl）清洗3 遍后，加 入200 μL PBS 重 懸，與 純 化 后 的dsDNA 混 合，于室溫旋轉(zhuǎn)孵育30 min.孵育后，磁分離以棄去上清，用Buffer E 清洗3 遍，加入200 μL 100 mmol/L NaOH溶液進(jìn)行堿變性15 min.加入40 μL 1 mol/L NaH2PO4（pH=3.9）終止反應(yīng)，于磁力器上靜置，上清液即為次級(jí)庫(kù).次級(jí)庫(kù)與TMB-蛋白復(fù)合體孵育進(jìn)行下一輪篩選，第1～10 輪的篩選操作同2.2.1.其中，第1～6 輪的孵育時(shí)間為2 h，第7～10 輪孵育1 h.

1.2.4 文庫(kù)的反篩

每經(jīng)過(guò)3 輪正篩選，需進(jìn)行一次反篩選.反篩的目的是去除文庫(kù)中與磁珠本身結(jié)合的ssDNA.在第4輪與第7 輪篩選結(jié)束后，將ssDNA 文庫(kù)與75 μL 重懸后的空磁珠混合，于室溫旋轉(zhuǎn)孵育2 h，經(jīng)磁分離后收集上清液，再分別進(jìn)入第5、第8 輪篩選.

1.2.5 相對(duì)親和力測(cè)定

通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）方法直接測(cè)定每輪文庫(kù)與ZO-1 的相對(duì)親和力，以監(jiān)測(cè)篩選進(jìn)程.使用P2、P3 引物對(duì)篩選中得到的DNA 文庫(kù)進(jìn)行擴(kuò)增，經(jīng)純化后用微量酶標(biāo)板定量與濃度均一化（>25 nmol/L），并于95 °C 加熱20 min，立即置于冰上20 min，以打開雙鏈.

進(jìn)行ELISA 時(shí)設(shè)置空白組、靶蛋白（ZO-1）組以及對(duì)照蛋白（卵清蛋白）組，蛋白濃度均為5 μg/mL.每孔加入100 μL 蛋白溶液包被，于4 °C 過(guò) 夜孵 育.倒空液體，每孔用300 μL PBST 清洗2 次后，每孔加入300 μL 的BSA 封閉液，于4 °C 封閉1 h.清洗2 次后，每孔依次加入各輪生物素標(biāo)記的ssDNA 文庫(kù)溶液進(jìn)行孵育，于37 °C 孵育1 h.清洗3次后，每孔加入100 μL 的Streptavidin-HRP，于37 °C 孵 育1 h.清洗3 次，第3 次清洗時(shí)浸泡5 min，再清洗2 次后，每孔加入100 μL TMB 顯色液，避光反應(yīng)15-30 min，待顏色穩(wěn)定后，加入50 μL 終止液，于酶標(biāo)儀450 nm 測(cè)定吸光值.對(duì)“篩選輪數(shù)-吸光度”進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，通過(guò)觀察每輪篩選的吸光值變化趨勢(shì)，決定是否終止篩選.

1.2.6 克隆與測(cè)序

將第10 輪篩選到的ssDNA，使用P1、P2 引物進(jìn)行擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)電泳表征并純化，將1.6 ng 產(chǎn)物與1 μL pEASY-T1 Simple Cloning Vector（片段與載體的最佳摩爾比為1∶7），總體積補(bǔ)至5 μL，于室溫反應(yīng)10 min.取5 μL 連接產(chǎn)物加入50 μL DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，混勻后冰浴30 min，42 °C 水浴熱激30 s 后立即置于冰上2 min，加入500 μL 液體LB 培養(yǎng)基，于37 °C、200 r/min 孵育1 h.涂布平板后，于37 °C 過(guò)夜培養(yǎng).使用菌落PCR 法鑒定陽(yáng)性克隆，隨機(jī)挑取白色克隆至10 μL 無(wú)菌水中，混勻后取1 μL 至PCR 體系中，M13上游與下游引物均為 1 μL、22 μL ddH2O、25 μL GoTaq?定量PCR 預(yù)混液.

過(guò)夜培養(yǎng)后觀察菌落情況，隨機(jī)挑取單菌落置于5 mL LB 培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，送至生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序.取第10 輪次級(jí)文庫(kù)擴(kuò)增后樣品，經(jīng)PCR 柱式純化試劑盒純化回收，由生工生物工程有限公司進(jìn)行高通量測(cè)序，并使用UNAFold 網(wǎng)站（http://www.unafold.org/）在線預(yù)測(cè)APTZO-1的二級(jí)結(jié)構(gòu).

1.3 APTZO-1 與ZO-1 的親和力測(cè)定

篩選到的APTZO-1由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，采用生物素修飾.ELISA 測(cè)定步驟同2.2.5，設(shè)置空白組與ZO-1 組，均設(shè)置3 組平行.其中，將APTZO-1配制成2.500、1.250、0.625、0.400、0.200、0.100、0.050、0.025 μmol/L 的溶液進(jìn)行孵育.測(cè)定吸光值后，使用SigmaPlot 14.0（SYSTAT 公司）處理數(shù)據(jù)，按Y＝BmaxX/(Kd+X)公式，以APTZO-1濃度為X、吸光值為Y，進(jìn)行非線性擬合，可得到APTZO-1結(jié)合ZO-1 的解離常數(shù)Kd.此外，選擇Kd值最小的APTZO-1（625 nmol/L）再次進(jìn)行ELISA 測(cè)定，以檢驗(yàn)APTZO-1對(duì)ZO-1 的特異性，設(shè)置牛血清白蛋白（BSA）、卵清蛋白作為非靶標(biāo)蛋白（5 μg/mL），其他步驟同2.2.5.

1.4 基于熒光標(biāo)記APTZO-1 對(duì)細(xì)胞上ZO-1 進(jìn)行定位觀察

使用Cy5 熒光基團(tuán)標(biāo)記與ZO-1 親和力最強(qiáng)的APTZO-1（Cy5-APTZO-1），對(duì)Caco-2 細(xì) 胞 與hCMEC/D3細(xì)胞中的ZO-1 進(jìn)行熒光定位分析.同時(shí)，采用81 np的隨機(jī)序列核酸作為非特異性APT 進(jìn)行染色，設(shè)置為陰性對(duì)照組.將兩種細(xì)胞系分別接種在激光共聚焦培養(yǎng)皿上培養(yǎng)，使用4% 多聚甲醛溶液固定，用PBS 清洗5 min，重復(fù)3 次.使用0.5% Triton X-100 通透后，清洗3 次，用3% BSA 溶液封閉1 h.按1:400 稀釋Cy5-APTZO-1與非特異性APT 原液，孵育2 h 后清洗，各孔加入適量DAPI 染液，染色15 min 后清洗3 次，加入適量防淬滅劑.同時(shí)使用傳統(tǒng)IF 法進(jìn)行細(xì)胞ZO-1 的定位觀察，使用ZO-1 抗體于4 °C 過(guò)夜孵育，清洗3 次后加入二抗孵育2 h，其余步驟同前.于超分辨顯微成像系統(tǒng)下觀察，選取視野并保存，最終對(duì)比兩種方法的結(jié)果.

1.5 基于Cy5-APTZO-1 對(duì)細(xì)胞上ZO-1 進(jìn)行半定量分析

為考察Cy5-APTZO-1對(duì)Caco-2 與hCMEC/D3 兩種細(xì)胞上ZO-1 的半定量能力，設(shè)置對(duì)照（CON）組、模擬微重力48 h（SMG）組[16]，并與傳統(tǒng)IF 法的結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，測(cè)定步驟同2.4.使用Image J（NIH 公司）對(duì)ZO-1 的平均熒光強(qiáng)度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析.此外，采用WB 法對(duì)兩種細(xì)胞系的ZO-1 進(jìn)行半定量分析，同設(shè)置CON 組與SMG 組.步驟如下：制備兩種細(xì)胞樣本后進(jìn)行SDS-PAGE 凝膠電泳，冰浴轉(zhuǎn)膜90 min，封閉2 h 后使用ZO-1 抗體過(guò)夜孵育，洗膜15 min、4 次后加入二抗稀釋液于常溫孵育2 h，清洗4次后顯影，以全蛋白作為內(nèi)參進(jìn)行ZO-1 半定量分析.使用Image J 處理數(shù)據(jù)，分析3 種方法的半定量結(jié)果.

2 結(jié)果與討論

2.1 APTZO-1 的篩選結(jié)果

通過(guò)ELISA 法測(cè)定每輪文庫(kù)與ZO-1 的相對(duì)親和力，以監(jiān)測(cè)篩選進(jìn)程.測(cè)定吸光度，并對(duì)“篩選輪數(shù)-吸光度”進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，結(jié)果見圖1.圖1 表明，ssDNA與ZO-1 的親和力隨篩選輪數(shù)的增加呈上升趨勢(shì)，篩選至第10 輪時(shí)，吸光度基本進(jìn)入平臺(tái)期，故結(jié)束篩選.

圖1 十輪文庫(kù)與ZO-1 的相對(duì)親和力Fig.1 Relative affinity of ten rounds library to ZO-1

取第10 輪文庫(kù)的樣品進(jìn)行高通量測(cè)序，共篩選到15 條APTZO-1.通過(guò)UNAFold 網(wǎng)站預(yù)測(cè)APTZO-1的二級(jí)結(jié)構(gòu)圖，結(jié)合分析其序列與二級(jí)結(jié)構(gòu)，排除了線性結(jié)構(gòu)與相似結(jié)構(gòu)，最終合成9 條APTZO-1，其序列見表3.

2.2 APTZO-1 與ZO-1 的親和力測(cè)定結(jié)果

使用ELISA 法測(cè)定APTZO-1與ZO-1 結(jié)合的解離常數(shù)，以表征APTZO-1與ZO-1 的親和力強(qiáng)弱.以APTZO-1濃度為X、吸光值為Y，按Y=BmaxX/(Kd+X)進(jìn)行非線性擬合，測(cè)定結(jié)果見表3.表3 中的9 條APTZO-1的Kd值均為nmol/L 量級(jí)，說(shuō)明經(jīng)過(guò)10 輪SELEX 篩選成功獲得了與ZO-1 高度親和的APTZO-1.Kd值的大小能夠反映APTZO-1對(duì)ZO-1 親和力的強(qiáng)弱，Kd值越小，表明APTZO-1與ZO-1 的親和力越強(qiáng).因此，9 條APTZO-1與ZO-1 親和力的排序?yàn)?/p>

APTZO-18與ZO-1的親和力最高，Kd值為2.23 nmol/L，故選擇APTZO-18 進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn).此外，利用ELISA測(cè)定了APTZO-18 與2 種非靶標(biāo)蛋白（BSA、卵清蛋白）結(jié)合的吸光值，每組吸光值均與空白組吸光值為同一數(shù)量級(jí)且數(shù)值相近，遠(yuǎn)低于同濃度下APTZO-18 結(jié)合ZO-1 的 吸 光 值.因 此, APTZO-18 與ZO-1 的 結(jié) 合 力 遠(yuǎn)高于非靶標(biāo)蛋白, 表明APTZO-18 與ZO-1 的結(jié)合具有特異性.

表3 顯示，APTZO-18 的GC 堿基含量（58.02%）最高，Kd值最小，與ZO-1 的親和力最強(qiáng)；APTZO-14 的GC 含量（55.56%）最低，與ZO-1 的親和力最低.因此，GC 含量可能是影響核酸適配體親和ZO-1 能力的因素之一[17].9 條APTZO-1的Kd值均置于10?9～10?8mol/L，但其序列及GC 堿基含量的差別并不大，因此，可能是核酸適配體在二級(jí)結(jié)構(gòu)上的差別影響了與ZO-1的親和力大小，應(yīng)結(jié)合核酸適配體的序列及二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行進(jìn)一步的分析.

核酸適配體形成莖、莖環(huán)、口袋等結(jié)構(gòu)，可以在空間結(jié)構(gòu)上與靶標(biāo)互補(bǔ)契合.其中，小莖環(huán)結(jié)構(gòu)可增強(qiáng)核酸適配體的熱穩(wěn)定性，莖段結(jié)構(gòu)部分的GC 堿基配對(duì)可以提高莖段的穩(wěn)定性，從而增強(qiáng)與靶標(biāo)的親和力[18].通過(guò)分析與比較所有APTZO-1的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，均含有單一的口袋結(jié)構(gòu)，均易于在第10～20 位、第45～55 位、第50～65 位堿基處形成3～4 個(gè)莖環(huán)結(jié)構(gòu)，且多數(shù)為小莖環(huán)，可能核酸適配體的小莖環(huán)結(jié)構(gòu)更有利于結(jié)合靶標(biāo).圖2 顯示APTZO-18 作為與ZO-1 親和力最高的核酸適配體，第13～19 位與第57～63 位堿基均為小莖環(huán)結(jié)構(gòu)，第45-54 位堿基含一個(gè)中莖環(huán)，并且多個(gè)莖環(huán)結(jié)構(gòu)并不位于同一直線, 可能有利于APTZO-18 在空間上與ZO-1 的結(jié)構(gòu)互補(bǔ).通過(guò)對(duì)比9 條APTZO-1的序列與二級(jí)結(jié)構(gòu)圖發(fā)現(xiàn)，雖然其GC 堿基含量接近，但莖段部分的GC 堿基配對(duì)數(shù)差距較大.如APTZO-14 的莖段結(jié)構(gòu)部分僅有11 對(duì)GC堿基配對(duì), APTZO-18 的莖段部分共有15 個(gè)GC 堿基對(duì)，為9 條APTZO-1中配對(duì)數(shù)最高，說(shuō)明APTZO-1莖段的GC 堿基配對(duì)會(huì)影響其莖段區(qū)域的穩(wěn)定性，從而導(dǎo)致其結(jié)合ZO-1 的能力不同.

圖2 APTZO-1 8 的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)圖Fig.2 Predicted secondary structure of APTZO-1 8

2.3 基于Cy5-APTZO-1 8 對(duì)細(xì)胞上ZO-1 的定位觀察

使 用Cy5 熒 光 標(biāo) 記 的APTZO-18（Cy5-APTZO-18）對(duì)Caco-2 與hCMEC/D3 細(xì)胞的ZO-1 進(jìn)行熒光定位觀察，同時(shí)采用傳統(tǒng)IF 法作為對(duì)比，于超分辨顯微成像系統(tǒng)下使用60 倍鏡觀察，結(jié)果見圖3 和圖4.

圖3 基于傳統(tǒng)IF 與Cy5-APTZO-1 8 對(duì)Caco-2 細(xì)胞上ZO-1 的染色Fig.3 Staining of ZO-1 based on traditional IF and Cy5-APTZO-1 8 on Caco-2 cell

圖4 基于傳統(tǒng)IF 與Cy5-APTZO-1 8 對(duì)hCMEC/D3 細(xì)胞上ZO-1 的染色Fig.4 Staining of ZO-1 based on traditional IF and Cy5-APTZO-1 8 on hCMEC/D3 cell

圖3 與圖4 中的傳統(tǒng)IF 組顯示，兩種細(xì)胞的ZO-1主要分布于細(xì)胞質(zhì)中與細(xì)胞膜上，表現(xiàn)為連續(xù)性熒光，可呈現(xiàn)出清晰的細(xì)胞形態(tài).Cy5-APTZO-18 組的結(jié)果顯示，Cy5-APTZO-18 能夠準(zhǔn)確定位胞質(zhì)中與細(xì)胞膜上的ZO-1，可以呈現(xiàn)出Caco-2 細(xì)胞的蜂窩狀及hCMEC/D3 細(xì)胞的梭狀.與傳統(tǒng)IF 組相比，Cy5-APTZO-18 組圖片中的雜點(diǎn)更少，成像圖片更加清晰、明亮.并且使用Cy5-APTZO-18 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)不需進(jìn)行二抗孵育及洗膜的操作，有效地簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)步驟、縮短了實(shí)驗(yàn)時(shí)長(zhǎng).同時(shí)，在相同熒光強(qiáng)度下，陰性對(duì)照組中無(wú)胞質(zhì)與胞膜的ZO-1 標(biāo)記，無(wú)法呈現(xiàn)出正常細(xì)胞形態(tài)，可證明APTZO-18 具有特異性.

2.4 基于Cy5-APTZO-1 8 對(duì)細(xì)胞上ZO-1 的半定量分析

為考察Cy5-APTZO-18 的相對(duì)定量能力，采用細(xì)胞旋轉(zhuǎn)模型模擬微重力，分析模擬微重力下兩種細(xì)胞上ZO-1 的含量變化.使用Cy5-APTZO-18 進(jìn)行Caco-2 與hCMEC/D3 細(xì)胞上ZO-1 的半定量分析，并與傳統(tǒng)IF 法、WB 法的結(jié)果進(jìn)行對(duì)比.于超分辨顯微成像系統(tǒng)的20 倍鏡下觀察，使用Image J 分析ZO-1 的平均熒光強(qiáng)度，測(cè)定結(jié)果見圖5 和圖6.

圖5 基于3 種方法對(duì) Caco-2 細(xì)胞ZO-1 的半定量結(jié)果Fig.5 Semi-quantitative results of ZO-1 on Caco-2 cell based on 3 methods

圖6 基于3 種方法對(duì)hCMEC/D3 細(xì)胞ZO-1 的半定量結(jié)果Fig.6 Semi-quantitative results of ZO-1 on hCMEC/D3 cell based on 3 methods

圖5～6 中的傳統(tǒng)IF 結(jié)果顯示：與CON 組相比，SMG 組的ZO-1 含量下降，Caco-2 與hCMEC/D3 細(xì)胞的ZO-1 分別降低了9.57%、8.53%.WB 結(jié)果也顯示了模擬微重力可導(dǎo)致兩種細(xì)胞上ZO-1 的表達(dá)降低，Caco-2 與hCMEC/D3 分別降低15.4%、24.32%（**P<0.01）.以上兩種方法的結(jié)論與文獻(xiàn)[18 ? 19]報(bào)道一致.基于Cy5-APTZO-18 的半定量結(jié)果表明：模擬微重力下，Caco-2 細(xì)胞與hCMEC/D3 細(xì)胞的ZO-1 表達(dá)分別下降了15.1%、24.75%，這與傳統(tǒng)IF 與WB 的測(cè)定結(jié)果相似，Cy5-APTZO-18 能夠?qū)崿F(xiàn)細(xì)胞樣本上ZO-1的半定量分析.

3 結(jié) 論

文中以ZO-1 為研究對(duì)象，基于SELEX 技術(shù)首次篩選ZO-1 的APT，最終篩選到9 條APTZO-1，并采用ELISA 法分析并確定了APTZO-18 與ZO-1 的親和力最強(qiáng).通過(guò)分析9 條APTZO-1的解離常數(shù)、序列及二級(jí)結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)GC 含量、小莖環(huán)結(jié)構(gòu)的數(shù)量及位置、莖段部分的GC 堿基配對(duì)數(shù)可能影響APTZO-1與ZO-1的親和力.證實(shí)了熒光標(biāo)記的APTZO-18 可對(duì)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)與細(xì)胞膜上的ZO-1 進(jìn)行定位與半定量分析，具有潛在的良好應(yīng)用能力.但本研究后續(xù)亦可采用其他方法（如表面等離子體共振法等[20]）以表征APT 與ZO-1 的親和力，從而提高親和力測(cè)定的科學(xué)性.后期可進(jìn)行深入分析APTZO-18 與ZO-1 的關(guān)系空間結(jié)構(gòu)，如探究二者的潛在結(jié)合位點(diǎn)等，為擴(kuò)大ZO-1 的適配體的應(yīng)用奠定基礎(chǔ).

核酸適配體作為一種小分子生物工具，在未來(lái)還有許多潛在的其他應(yīng)用價(jià)值.核酸適配體具有無(wú)免疫原性、生物相容性高、穿透力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)[21]，且易于進(jìn)行化學(xué)修飾與標(biāo)記，或可借助成像技術(shù)以實(shí)現(xiàn)機(jī)體內(nèi)活細(xì)胞的ZO-1 檢測(cè).核酸適配體具有特異性高、化學(xué)穩(wěn)定性較強(qiáng)等特點(diǎn)，可作為一種識(shí)別元件應(yīng)用于各種光學(xué)、電化學(xué)等傳感檢測(cè)[22]，以提高檢測(cè)的靈敏度.但核酸適配體存在諸如易受核酸酶的影響、構(gòu)象不穩(wěn)定、體內(nèi)半衰期較短等問(wèn)題，或需要進(jìn)一步優(yōu)化其性能，才能提高核酸適配體在實(shí)際應(yīng)用中的效率.