兔糖尿病周圍神經(jīng)病變模型的建立及超聲表現(xiàn)

黃建波,何 英,王 紅,向 茜,楊汐靜,張靜漪△

(四川大學(xué)華西醫(yī)院:1.超聲醫(yī)學(xué)科;2.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心,成都 610041)

糖尿病周圍神經(jīng)病變(diabetic peripheral neuropathy,DPN)是糖尿病病程相關(guān)的最常見并發(fā)癥[1]。DPN可能會(huì)影響運(yùn)動(dòng)神經(jīng)、感覺神經(jīng)、自主神經(jīng),導(dǎo)致觸覺、痛覺、溫度覺的減退、消失,或產(chǎn)生其他異常感覺如自發(fā)疼痛、燒灼感、針刺感等[2]。DPN感覺異常及血管功能障礙常造成下肢皮膚潰爛、糖尿病足的發(fā)生,甚至出現(xiàn)截肢的風(fēng)險(xiǎn),嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。DPN的早期診斷治療是降低患者病殘程度、提高生活質(zhì)量的關(guān)鍵。

目前DPN主要依靠臨床病史、病變癥狀的體征表現(xiàn)和神經(jīng)電生理檢測(cè)來(lái)確診,但其中病變癥狀的體征表現(xiàn)主要是基于主觀估計(jì),確診的重復(fù)性較差,而神經(jīng)電生理檢測(cè)僅能評(píng)估25%的神經(jīng)功能[3]。神經(jīng)穿刺活檢作為DPN診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”,雖然可以準(zhǔn)確量化無(wú)髓纖維損傷,但也是一種侵入性和高度專業(yè)化的手術(shù),且早期 DPN 患者的有髓神經(jīng)纖維形態(tài)仍然正常,導(dǎo)致其在臨床應(yīng)用中有一定局限性。因此需要有一種能夠直接評(píng)估DPN中神經(jīng)纖維損傷的非侵入性技術(shù)。超聲作為一種非侵入性技術(shù),已廣泛應(yīng)用于周圍神經(jīng)病變,如遺傳性疾病、卡壓綜合征、創(chuàng)傷和腫瘤的診斷[4]。據(jù)報(bào)道,超聲也可用于糖尿病患者周圍神經(jīng)的研究,超聲診斷相比于神經(jīng)電生理檢測(cè),不僅在診斷DPN方面具有更高的價(jià)值和效率,而且有助于醫(yī)生根據(jù)形態(tài)和結(jié)構(gòu)變化區(qū)分神經(jīng)病變的類型,在DPN的治療和監(jiān)測(cè)中發(fā)揮了重要作用[5]。

為了更好地研究DPN的發(fā)病機(jī)制,探索DPN早期診斷更快捷的影像學(xué)檢查方法,建立理想的DPN動(dòng)物模型非常必要。DPN動(dòng)物模型包括誘導(dǎo)型、自發(fā)型、轉(zhuǎn)基因型等,以藥物誘導(dǎo)型多見。國(guó)內(nèi)外建立DPN動(dòng)物模型以鼠類多見[6],而兔DPN模型較少見。鼠類的周圍神經(jīng)纖細(xì),對(duì)于影像學(xué)檢查儀器的分辨率要求較高,而兔體型稍大,其周圍神經(jīng)較鼠類粗,更利于影像學(xué)顯影,且神經(jīng)電生理學(xué)對(duì)細(xì)小纖維的敏感性較低,漏診率較高,在神經(jīng)電生理信號(hào)改變之前可用超聲監(jiān)測(cè)形態(tài)學(xué)改變。超聲影像技術(shù)應(yīng)用于兔DPN模型中坐骨神經(jīng)病變的研究少見于報(bào)道。本研究旨在探討用較低劑量四氧嘧啶(Alloxan,ALX)破壞兔胰島細(xì)胞誘導(dǎo)兔坐骨神經(jīng)DPN模型的建立方法,并利用超聲影像檢測(cè)神經(jīng)橫截面面積(cross-sectional area,CSA)和回聲等圖像變化,模擬顯示DPN患者周圍神經(jīng)形態(tài)學(xué)變化的特征,以分析坐骨神經(jīng)病變情況,從而為糖尿病神經(jīng)病變的臨床診療提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

取健康新西蘭大白兔30只,雄性,體重約2.5～2.8 kg,8周齡,購(gòu)于四川省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物專委會(huì)養(yǎng)殖場(chǎng),檢疫合格后由四川大學(xué)華西醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心適應(yīng)性飼養(yǎng)至少1周,檢疫合格后造模。動(dòng)物單籠飼養(yǎng),籠舍每日定時(shí)清洗,飼養(yǎng)間的溫度維持在20～26 ℃,相對(duì)濕度為40%～70%。每日2次定時(shí)飼喂標(biāo)準(zhǔn)普通兔飼料,更換清潔飲水。本研究所有操作程序都經(jīng)過(guò)四川大學(xué)華西臨床醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理與使用委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

30只兔隨機(jī)分為正常對(duì)照組(N組,n=6)和造模組(n=24)。造模組采取一次性注射給藥的方式,注射給藥前動(dòng)物禁食12 h,自由飲水,按65 mg/kg體重耳緣靜脈注射新鮮配制的5% ALX,正常對(duì)照組注射等量的生理鹽水。分別于注射后第2、4、6天取少量耳緣靜脈血,用羅氏血糖測(cè)量?jī)x進(jìn)行血糖測(cè)量,血糖濃度>16.0 mmol/L并維持1周以上,認(rèn)為兔糖尿病模型建模成功。再將ALX誘導(dǎo)糖尿病模型建模成功的兔隨機(jī)分為糖尿病病程1月組(A組)、2月組(B組)、3月組(C組)。

A、B、C組分別于1、2、3個(gè)月后進(jìn)行坐骨神經(jīng)超聲檢查和神經(jīng)電生理檢測(cè)。超聲檢查采用Philips IU22彩色超聲診斷儀,線陣探頭(L12-5),頻率5～12 Mhz,選用淺表肌骨模式。研究對(duì)象取側(cè)臥位的相對(duì)固定位置,儀器參數(shù)條件保持一致,比如增益、深度等。二維超聲觀察各組雙側(cè)坐骨神經(jīng)的內(nèi)部回聲情況,并測(cè)定坐骨神經(jīng)CSA。全部研究對(duì)象均由具有多年經(jīng)驗(yàn)的同一位超聲醫(yī)師完成超聲診斷。超聲檢查完成后,對(duì)雙側(cè)坐骨神經(jīng)行電生理檢測(cè),測(cè)量神經(jīng)傳導(dǎo)的動(dòng)作電位傳導(dǎo)速度。N組也于1、2、3個(gè)月后各取2只進(jìn)行上述檢查。所有測(cè)量數(shù)據(jù)重復(fù)3次,取平均值。雙側(cè)坐骨神經(jīng)電生理檢查完成后,分批取材,對(duì)坐骨神經(jīng)做HE染色及快藍(lán)染色觀察其病理改變。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 體重、血糖情況

造模組兔在靜脈注射ALX 24 h后陸續(xù)進(jìn)入低血糖期。當(dāng)兔血糖濃度小于2.0 mmol/L時(shí),出現(xiàn)嗜睡、不進(jìn)水進(jìn)食,甚至出現(xiàn)驚厥、尖叫等現(xiàn)象,此時(shí)給予靜脈注射少量10%葡萄糖。24 h內(nèi)造模組中2只兔死于低血糖;至給藥72 h,有1只血糖低于16 mmol/L,從造模組中剔除。最終共21只兔血糖大于16.0 mmol/L且在飼養(yǎng)過(guò)程中無(wú)死亡及血糖下降,造模成功(87.5%)。

糖尿病模型建立后兔的飲水量、攝食量及尿量均明顯增加,尿膻味重,體毛逐漸失去光澤,出現(xiàn)脫毛現(xiàn)象、活動(dòng)減少等一系列糖尿病及DPN的相關(guān)癥狀。N組兔體重為(2.52±0.15)kg,A組為(2.64±0.32)kg,B組為(2.73±0.21)kg,C組為(2.85±0.20)kg。A組、B組與N組體重比較,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);而C組與N組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);C組與A、B組進(jìn)行比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);A組與B組比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

N組兔血糖為(5.30±0.26)mmol/L。A、B、C組兔血糖值控制在16.0～30.0 mmol/L。A組血糖為(26.94±0.35)mmol/L,B組血糖為(28.83±0.18)mmol/L,C組血糖為(27.26±0.21)mmol/L。A、B、C組血糖與N組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。A、B、C組組間比較,血糖值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2 兔糖尿病坐骨神經(jīng)病變的超聲表現(xiàn)

正常兔坐骨神經(jīng)的超聲縱截面表現(xiàn)為中間為低回聲、上下高回聲的神經(jīng)外膜結(jié)構(gòu),而橫截面超聲表現(xiàn)為內(nèi)部呈低回聲、周圍有高回聲的神經(jīng)外膜(圖1)。用超聲測(cè)量各組CSA數(shù)值統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果中可見,隨糖尿病病程時(shí)間延長(zhǎng),CSA逐漸增加,其中A、B、C組組間CSA兩兩比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);A組CSA與N組比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);B、C組與N組之間CSA比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表1。

表1 各組間兔坐骨CSA比較

A:坐骨神經(jīng)縱截面的超聲成像;B:坐骨神經(jīng)橫截面的超聲成像。

虛線區(qū)域?yàn)橥米巧窠?jīng)橫截面,A、B、C、N分別為A、B、C及N組;圖D為各組的CSA統(tǒng)計(jì)圖;***:P<0.05。

2.3 兔坐骨神經(jīng)動(dòng)作電位傳導(dǎo)速度改變

兔坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度結(jié)果如表2所示。A、B組與N組比較,以及A組與B組比較,坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);而C組與N組比較,兩組坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);C組與A、B組比較,坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表2。

表2 各組間兔神經(jīng)動(dòng)作電位傳導(dǎo)速度比較

2.4 兔坐骨神經(jīng)病理結(jié)果

HE染色結(jié)果顯示,N組、A組和B組的神經(jīng)纖維排列均較規(guī)則、緊密,染色均勻;C組神經(jīng)纖維發(fā)生水腫,神經(jīng)纖維髓鞘發(fā)生脫髓鞘,部分區(qū)域出現(xiàn)淡染區(qū)(圖3)。與N組比較, A、B組兔坐骨神經(jīng)神經(jīng)纖維之間排列比較規(guī)則,快藍(lán)染色神經(jīng)纖維髓排列緊密、規(guī)則,C組兔坐骨神經(jīng)纖維之間的排列變的較疏松,快藍(lán)染色顯示部分神經(jīng)纖維髓鞘出現(xiàn)輕度“空泡化”(圖4)。

A:N組兔坐骨神經(jīng),神經(jīng)纖維排列緊密,染色均勻;B: C組兔坐骨神經(jīng)神經(jīng)纖維出現(xiàn)水腫,部分區(qū)域出現(xiàn)淡染區(qū)(白色箭頭)。

A: N組兔坐骨神經(jīng),神經(jīng)纖維髓排列規(guī)則,染色均勻;B: C組兔坐骨神經(jīng)髓鞘出現(xiàn)脫髓鞘病變,部分區(qū)域出現(xiàn)“空泡化”(白色箭頭)。

3 討 論

DPN模型可分為誘發(fā)型、自發(fā)型及轉(zhuǎn)基因或基因敲除型等[7]。其中誘發(fā)型常用化學(xué)藥物、高脂高糖飲食或者手術(shù)等誘導(dǎo),由于具有操作簡(jiǎn)便、穩(wěn)定性好、短期內(nèi)可誘導(dǎo)出大量模型等優(yōu)點(diǎn),所以較為常用?；瘜W(xué)藥物ALX在誘導(dǎo)DPN模型時(shí),通過(guò)自由基破壞胰島B細(xì)胞,導(dǎo)致胰島素缺乏,進(jìn)而誘發(fā)糖尿病。但ALX給藥劑量在各文獻(xiàn)中存在較大差異,大鼠模型單一注射的劑量為40～70 mg/kg,兔的給藥劑量為100～200 mg/kg[8]。本研究采用一次性耳緣靜脈注射65 mg/kg 5% ALX溶液的方式,避免了大劑量給藥出現(xiàn)藥物集中釋放對(duì)胰腺造成較大破壞,同時(shí)降低肝臟及腎臟毒性,減少造模過(guò)程中動(dòng)物死亡率。一次性給藥操作簡(jiǎn)單方便,相比于多次給藥,縮短了造模時(shí)間。另外,ALX溶于水易分解,新鮮配置好后立即使用,在注射時(shí)推注速度越快越容易誘發(fā)動(dòng)物糖尿病的發(fā)生,通常情況下應(yīng)在30 s內(nèi)將ALX溶液注入動(dòng)物體內(nèi)。嚴(yán)格的禁食對(duì)于ALX誘發(fā)糖尿病也十分關(guān)鍵。

目前,化學(xué)藥物誘導(dǎo)的糖尿病及其并發(fā)癥模型大部分采用鼠類[9],研究報(bào)道的糖尿病并發(fā)癥兔動(dòng)物模型大部分關(guān)注點(diǎn)在糖尿病腎臟病變等方面,而糖尿病兔周圍神經(jīng)病變的模型較少見。本研究考慮到鼠類神經(jīng)纖細(xì),對(duì)影像儀器的分辨率要求較高,顯影較困難;兔的體型較鼠類大,神經(jīng)也較鼠類粗,更利于觀察影像表現(xiàn),因此選擇雄性新西蘭大白兔作為造模對(duì)象。造模組動(dòng)物相比于健康對(duì)照組,毛色逐漸失去光澤,甚至發(fā)生脫毛現(xiàn)象,并出現(xiàn)精神較萎靡,飲水量、尿量明顯增加,尿膻味加重,活動(dòng)減少等一系列的相關(guān)癥狀,在高血糖的持續(xù)狀態(tài)下,逐漸出現(xiàn)糖尿病周圍神經(jīng)病變等并發(fā)癥。糖尿病周圍神經(jīng)病變模型建立成功的判斷依據(jù)為坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度減慢、機(jī)械性痛閾減低、痛覺傳導(dǎo)時(shí)間延長(zhǎng)、平均步行周期延長(zhǎng)和甩尾潛伏期和熱縮足潛伏期縮短等,通常在藥物誘導(dǎo)的4～12周出現(xiàn)糖尿病周圍神經(jīng)病變。本實(shí)驗(yàn)采用65 mg/kg ALX于耳緣靜脈注射建立糖尿病新西蘭兔模型,給藥劑量明顯低于文獻(xiàn)中的劑量[10],3天后血糖升高,分別于1、2、3個(gè)月后進(jìn)行坐骨神經(jīng)的神經(jīng)電生理檢測(cè),實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),造模組在1個(gè)月和2個(gè)月后,與正常對(duì)照組比較,神經(jīng)傳導(dǎo)速度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,3個(gè)月后行神經(jīng)電生理檢測(cè)出現(xiàn)動(dòng)作電位傳導(dǎo)速度減低,為(51.14±0.45)m/s,較N組(54.79±0.52)m/s減慢,且其他行為學(xué)方面也符合造模成功特征,因此本研究認(rèn)為在ALX誘導(dǎo)3個(gè)月后DPN模型建立成功。與部分鼠模型中最早4周出現(xiàn)神經(jīng)傳導(dǎo)速度減慢比較,本研究模型建立時(shí)間較長(zhǎng),可能與動(dòng)物的種類不同,以及誘導(dǎo)糖尿病的藥物、給藥方法、給藥劑量等因素有關(guān)。

近年來(lái),超聲由于具有無(wú)創(chuàng)、實(shí)時(shí)、簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn),廣泛應(yīng)用于各種疾病的診斷治療。超聲可以顯示周圍神經(jīng)的形態(tài),在周圍神經(jīng)病變中具有較高的診斷和評(píng)估價(jià)值[11],也作為DPN的評(píng)價(jià)工具受到關(guān)注[12]。CSA可反映周圍神經(jīng)病變的嚴(yán)重程度,將CSA作為超聲在周圍神經(jīng)病變研究中的測(cè)量指標(biāo)[13]。有研究發(fā)現(xiàn),超聲顯示DPN患者腓深神經(jīng)中間支內(nèi)神經(jīng)束回聲模糊,神經(jīng)外膜不平整、回聲欠清晰,且神經(jīng)內(nèi)回聲不均勻,神經(jīng)內(nèi)徑較正常組增大[14]。本研究中A組相比N組,CSA有所增加,但差異并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,可能是因?yàn)樯窠?jīng)纖維變性的同時(shí)也存在再生[15]。C組兔CSA大于A、B組,且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,與病理結(jié)果較為一致,髓鞘的空泡化比較明顯。實(shí)驗(yàn)中造模組神經(jīng)內(nèi)神經(jīng)束的回聲欠均勻,可能與DPN神經(jīng)纖維退變、神經(jīng)纖維間基質(zhì)增生有關(guān)[16],也有研究報(bào)道軸索變性的神經(jīng)痛患者的腓腸及腓淺神經(jīng)CSA增大[17]。但是無(wú)法通過(guò)超聲直接區(qū)分周圍神經(jīng)內(nèi)的軸索變性及髓鞘退變。目前對(duì)于CSA變化和軸索及髓鞘的關(guān)系在臨床上還沒有統(tǒng)一結(jié)論,而且DPN的病理機(jī)制尚未完全明確,其超聲改變與病理學(xué)改變之間的關(guān)系尚不清楚,因此沒有建立DPN的完整超聲評(píng)價(jià)體系。

本研究以ALX誘導(dǎo)成功建立與人類DPN相似的兔糖尿病模型,通過(guò)超聲分析坐骨神經(jīng)在病變前后的圖像變化,將CSA作為超聲在周圍神經(jīng)病變研究中的測(cè)量指標(biāo)來(lái)反映周圍神經(jīng)病變的嚴(yán)重程度,再結(jié)合神經(jīng)電生理檢測(cè)及組織病理學(xué)檢查評(píng)價(jià)超聲在定量評(píng)估DPN中的價(jià)值,為臨床開展超聲定量評(píng)估DPN可行性提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本研究也存在一定的局限性,比如超聲檢查對(duì)操作者的依賴性較大;未將神經(jīng)病變的其他影像學(xué)檢查方法進(jìn)行對(duì)比分析,如彈性成像、超聲造影成像等。

綜上所述,本研究采用ALX誘導(dǎo)新西蘭大白兔糖尿病模型,3月后出現(xiàn)坐骨神經(jīng)神經(jīng)傳導(dǎo)速度減低,采用較低的給藥劑量一次耳緣靜脈注射,造模成功率較高,不失為一種經(jīng)濟(jì)、便捷的兔坐骨神經(jīng)DPN模型建模方法。超聲對(duì)兔坐骨神經(jīng)的顯示率為100%,且操作簡(jiǎn)單、圖像清晰,能夠分析CSA的變化,可用于兔DPN模型中神經(jīng)病變的評(píng)估。