膀胱癌患者血清中腫瘤異常蛋白和細(xì)胞角蛋白19的表達(dá)及其臨床意義

邱忠凱，劉俊龍，丁全明，梁偉

（本溪市中心醫(yī)院泌尿外科，遼寧 本溪 117000）

膀胱癌是全球范圍內(nèi)常見的癌癥類型之一［1］。 根據(jù)美國癌癥協(xié)會(huì)預(yù)測(cè)，2022年美國將有約81 180例膀胱癌新發(fā)病例和17 100例膀胱癌相關(guān)死亡病例［2］。男性膀胱癌發(fā)病率較高，發(fā)病年齡多為60歲以上，吸煙、老齡化和接觸化學(xué)工業(yè)產(chǎn)品等是膀胱癌的風(fēng)險(xiǎn)因素［3］。近年來，膀胱癌的臨床診斷和治療方式取得了一定進(jìn)展，但膀胱癌的高轉(zhuǎn)移率一直是困擾臨床治療的難題［4］。因此，全面了解膀胱癌的發(fā)病機(jī)制、尋找有意義的臨床輔助診斷指標(biāo)有助于改善患者的預(yù)后。近年研究［5］發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞在代謝過程中，釋放出復(fù)雜的異常糖蛋白和鈣阻蛋白，組成腫瘤異常蛋白 （tumor abnormal protein，TAP）。當(dāng)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的 TAP達(dá)到一定量時(shí)可在患者外周血或末梢血中檢出。研究［6］表明TAP在乳腺癌、結(jié)腸癌、胃癌等惡性腫瘤患者血清中表達(dá)上調(diào)。細(xì)胞角蛋白 （cytokeratin，CK） 是一類由CK基因編碼的水溶性聚合多肽。CK19是一種CK蛋白小分子，主要分布于上皮組織，是構(gòu)成細(xì)胞骨架的中間微絲，廣泛表達(dá)于肺癌、結(jié)腸癌和乳腺癌等惡性腫瘤中［7］。TAP和CK19在膀胱癌患者血清中的表達(dá)水平研究鮮有報(bào)道。血清腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)具有便捷、快速的優(yōu)點(diǎn)，近年來已獲得臨床認(rèn)可［8］。因此，對(duì)早期惡性腫瘤進(jìn)行血清學(xué)腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)具有重要參考價(jià)值。本研究探討膀胱癌患者血清中TAP及CK19的表達(dá)情況，分析兩者之間及與膀胱癌的臨床病理特征間的相關(guān)性，旨在為膀胱癌的診斷提供新的參考及依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 臨床資料及分組

選取2020年1月至2021年1月我院收治的70例膀胱癌患者作為膀胱癌組。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1） 病理學(xué)確診為膀胱癌且為初發(fā)；（2） 無其他惡性腫瘤；（3） 未接受放、化療等其他治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1） 合并泌尿系統(tǒng)其他基礎(chǔ)疾病；（2） 數(shù)據(jù)不完整。其中男42例，女28例；年齡46～79歲，平均年齡 （64.60±9.05） 歲；肌層浸潤25例，非肌層浸潤45例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性16例，腫瘤直徑＜3 cm 44例。選取同期我院體檢的63例健康人群作為對(duì)照組，其中男34例，女29例；年齡48～78歲，平均年齡 （62.65±7.49） 歲。選取同期我院診治的泌尿系統(tǒng)良性疾病患者54例為良性組，其中男29例，女25 例；年齡45～77歲，平均年齡（61.57±8.14） 歲。本研究已獲得我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者及家屬均知情同意并簽署知情同意書。3組年齡、性別比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （均P＞0.05）。

1.2 主要試劑及儀器

TAP檢測(cè)試劑盒 （20173401893） 及TAP分析系統(tǒng)儀 （產(chǎn)品型號(hào)RS2011-A） 購自浙江瑞生公司，CK19酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) （enzyme limked immunosorbent assay，ELISA） 試劑盒購自武漢博士康生物工程有限公司，酶標(biāo)儀購自美國Bio-Rad公司，熒光顯微鏡購自日本Olympus公司。

1.3 檢測(cè)方法

抽取患者清晨空腹靜脈血 （約3 mL），EDTA抗凝，按照試劑盒說明書進(jìn)行血清TAP及CK19指標(biāo)檢測(cè)。每個(gè)標(biāo)本重復(fù)3次并計(jì)算平均值。

1.3.1 凝集法檢測(cè)血清TAP水平：取約1 mL新鮮全血制備載玻片，均勻涂片后室溫下干燥15 min，載玻片中加入凝固劑，2 h后觀察測(cè)量形成的凝集粒子面積。凝聚物顆粒面積 ≥121 μm2時(shí)判定TAP高表達(dá)，否則為TAP低表達(dá)。

1.3.2 ELISA檢測(cè)血清CK19水平：全血離心后分離上層血清，設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔及樣本孔加入CK19抗體后按照說明書步驟加入終止液，隨后用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔的吸光度 （optical density，OD） 值。根據(jù)樣本OD值計(jì)算對(duì)應(yīng)的濃度值。CK19正常范圍為0～7 ng/mL，＞7 ng/mL為高表達(dá)，否則為低表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

利用SPSS 23.0和GraphPad Prism 7.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，正態(tài)分布的計(jì)量資料采用±s表示，多組間比較采用單因素方差分析；不符合正態(tài)分布的計(jì)量資料采用M（P25～P75） 表示，組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)。采用Spearman線性相關(guān)分析TAP及CK19相關(guān)性。受試者操作特征 （receiver operating characteristic，ROC） 曲線分析及圖形繪制采用MedCalc 20.106 統(tǒng)計(jì)軟件。P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組血清中TAP及CK19表達(dá)水平比較

結(jié)果顯示，與對(duì)照組和良性組比較，膀胱癌組TAP及CK19表達(dá)水平顯著增高 （均P＜ 0.001），而對(duì)照組和良性組TAP及CK19表達(dá)水平比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 （均P＞ 0.05）。見圖1。

圖1 3組TAP和CK19表達(dá)水平比較Fig.1 Expression levels of TAP and CK19 in different groups

2.2 膀胱癌患者血清中TAP及CK19表達(dá)水平與各項(xiàng)臨床指標(biāo)的相關(guān)性

結(jié)果顯示，TAP和CK19表達(dá)水平與腫瘤直徑明顯相關(guān) （均P＜ 0.05）；TAP表達(dá)與腫瘤浸潤深度明顯相關(guān) （P＜ 0.01）。腫瘤越大，TAP及CK19表達(dá)水平越高。而TAP表達(dá)水平與年齡、性別、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均不相關(guān) （均P＞ 0.05）；CK19表達(dá)與年齡、性別、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤腫瘤浸潤深度均不相關(guān) （均P＞ 0.05）。見表1。

表1 膀胱癌患者血清中TAP和CK19的表達(dá)水平與各項(xiàng)臨床指標(biāo)的相關(guān)性Tab.1 Correlation between TAP and CK19 expression and clinical data in patients with bladder cancer

2.3 膀胱癌患者血清中TAP及CK19水平的相關(guān)性

Spearman線性相關(guān)分析膀胱癌患者血清TAP及CK19水平的相關(guān)性。結(jié)果顯示，血清TAP和 CK19水平呈正相關(guān) （r= 0.362 3，P= 0.002 1），見圖2。

圖2 膀胱癌患者血清中TAP和 CK19表達(dá)的相關(guān)分析Fig.2 Correlation between TAP and CK19 expression in the serum of bladder cancer patients

2.4 血清TAP和CK19單獨(dú)及聯(lián)合檢驗(yàn)對(duì)膀胱癌的診斷價(jià)值

以TAP ≥ 121 μm2，CK19＞7 ng/mL為陽性診斷標(biāo)準(zhǔn)繪制ROC曲線，TAP、CK19和二者聯(lián)合檢測(cè)的曲線下面積 （area under curve，AUC） 分別為0.904、0.895、0.932，約登指數(shù)分別為0.606、0.627、0.692，靈敏度分別為0.971、0.786、0.914，特異度分別為0.635、0.841、0.778。聯(lián)合檢測(cè)的診斷價(jià)值明顯優(yōu)于TAP及CK19單獨(dú)檢測(cè)見圖3、表2。

表2 TAP、CK19及聯(lián)合檢測(cè)對(duì)膀胱癌的診斷價(jià)值參數(shù)Tab.2 Diagnostic parameters of TAP，CK19 and the combination of TAP and CK19 for bladder cancer

圖3 TAP、CK19單獨(dú)及聯(lián)合檢測(cè)的ROC曲線Fig.3 ROC curve of TAP，CK19 and the combination of TAP and CK19

3 討論

目前，膀胱鏡下膀胱黏膜病理活檢以及輔助的尿脫落細(xì)胞學(xué)檢測(cè)被認(rèn)為是膀胱癌診斷的金標(biāo)準(zhǔn)［9］。膀胱癌治療方式主要包括手術(shù)治療 （膀胱鏡下電切、膀胱全切、淋巴結(jié)清掃等） 和術(shù)后生物免疫治療 （膀胱內(nèi)灌注化療藥物、卡介苗等）。已有研究［10］顯示約75%患者初步診斷時(shí)為非肌層浸潤性膀胱癌。非肌層浸潤性膀胱癌有復(fù)發(fā)或發(fā)展為肌層浸潤性的趨勢(shì)，因此定期膀胱鏡下評(píng)估是必需的［11］。然而膀胱鏡檢查是侵入性檢查，而且費(fèi)用昂貴，因此尋找無創(chuàng)且經(jīng)濟(jì)的早期診斷方法尤為重要。

近年來，越來越多的血清腫瘤標(biāo)志物 （AFP、CEA、CA19-9等［12］） 被應(yīng)用于臨床前診斷及篩查。研究［13］表明TAP的產(chǎn)生與腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及預(yù)后存在密切關(guān)系。TAP水平間接表明細(xì)胞癌變的數(shù)量和程度［5］。結(jié)直腸癌患者中TAP的檢測(cè)具有較高的靈敏度和特異度，此外，TAP也被作為一種新的預(yù)后獨(dú)立指標(biāo)應(yīng)用于結(jié)直腸癌患者化療和臨床監(jiān)測(cè)中［14］。CK19作為上皮細(xì)胞分化的特異標(biāo)志物，在肺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌等惡性腫瘤中表達(dá)上調(diào)，與相關(guān)惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展均有較明確的臨床意義［7］。研究［15］表明CK19上調(diào)與肝癌患者的預(yù)后不良有關(guān)。

本研究結(jié)果顯示，與膀胱良性疾病患者和健康人群相比，膀胱癌患者血清中TAP和CK19表達(dá)明顯上調(diào)，與以往研究［16-17］結(jié)果一致。本研究結(jié)果顯示良性組與對(duì)照組血清TAP和CK19表達(dá)水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 （均P＞ 0.05），說明TAP和CK19的表達(dá)主要來源于腫瘤細(xì)胞，提示二者可作為膀胱癌標(biāo)志物用于早期診斷。診斷價(jià)值分析結(jié)果顯示，TAP與CK19聯(lián)合檢測(cè)的診斷價(jià)值高于單獨(dú)檢測(cè)，因此TAP與CK19聯(lián)合檢測(cè)有助于膀胱癌的早期診斷。

綜上所述，膀胱癌患者血清中TAP及CK19高表達(dá)，二者表達(dá)水平與腫瘤大小相關(guān)，TAP及CK19有望成為膀胱癌診斷的腫瘤標(biāo)志物；TAP和CK19聯(lián)合檢測(cè)有助于提高膀胱癌的診斷價(jià)值。本研究的不足之處：（1） 樣本量較小，尚需大樣本、多中心研究完善檢測(cè)體系；（2） 入組膀胱癌患者術(shù)后未進(jìn)行TAP和CK19表達(dá)水平的復(fù)檢和系統(tǒng)的病程隨訪，無法通過TAP及CK19的檢測(cè)水平評(píng)估患者預(yù)后情況，因此須進(jìn)一步研究論證。