莪術(shù)醇通過抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路介導(dǎo)的自噬抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖活性

亓新峰，馮緒強(qiáng)，王建鳳

（1.濟(jì)南市第二婦幼保健院藥劑科，山東濟(jì)南 271100；2.高密市中醫(yī)院藥劑科，山東高密 261599）

莪術(shù)是我國傳統(tǒng)中藥，具有行氣破血、消積止痛等功效，在多種疾病發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮抗炎、抗氧化等多種藥理作用[1-2]。莪術(shù)中富含揮發(fā)油，具有良好抗炎、抗病毒及抗腫瘤活性，莪術(shù)醇是莪術(shù)揮發(fā)油的主要成分之一，已被證實(shí)在鼻咽癌、肝癌中具有抗腫瘤效果[3-4]。另外，也有研究表明，莪術(shù)醇對乳腺癌細(xì)胞具有增殖抑制作用，但其具體作用機(jī)制尚不明確[5]。自噬是細(xì)胞維持生存的重要機(jī)制之一，通過吞噬自身異?；蚴軗p的蛋白、細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞器，維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)。自噬在腫瘤中既可發(fā)揮促癌作用，亦可通過多種途徑發(fā)揮抑瘤作用。研究顯示，在電離輻射等應(yīng)激條件下，可誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞自噬，調(diào)控相關(guān)信號通路，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，發(fā)揮抗腫瘤作用[6]。本研究通過莪術(shù)醇作用于乳腺癌細(xì)胞，探討其對乳腺癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響，并從自噬角度探索其作用機(jī)制，旨在為臨床開發(fā)莪術(shù)醇抗乳腺癌相關(guān)藥物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞系

人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7，購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。

1.1.2 藥物、主要試劑和儀器

莪術(shù)醇（≥96.7%）購自海門德思行藥業(yè)科技有限公司，Annexin Ⅴ凋亡試劑盒購自美國BD Bioscience公司，單丹磺酰尸胺（monodansylcadaverine，MDC）自噬檢測試劑盒購自美國Sigma公司，Hoechst 33258染色試劑盒購自北京吉美生物技術(shù)有限公司，740Y-P購自美國medchemexpress公司；兔抗人Beclin1，p62，微管相關(guān)蛋白輕鏈3（microtubule-associated protein1 light chain 3，LC3）B、脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）、蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）、p-Akt、哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）、p-mTOR 一抗和HRP 標(biāo)記的山羊抗兔IgG 均購自美國Abcam 公司。MK3 酶標(biāo)儀購自美國Thermo 公司，Power PAC2000 電泳儀和Gel Doc EZ 凝膠成像分析系統(tǒng)購自美國Bio-Rad 公司，Cytomics FC 500 流式細(xì)胞儀購自美國Beckman Coulter公司，BX51TF熒光顯微鏡購自日本OLYMPUS公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

MCF-7 細(xì)胞置于37 ℃水浴鍋中復(fù)蘇，接種于RPMI 1640 培養(yǎng)基（含有體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/L鏈霉素），置于體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱中，37 ℃條件下培養(yǎng)，選取生長良好對數(shù)增殖期細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 MTT 法檢測不同濃度莪術(shù)醇對MCF-7 細(xì)胞增殖的影響

使用無水乙醇溶解莪術(shù)醇，配制成1×104μmol/L濃度的母液備用。取對數(shù)增殖期MCF-7細(xì)胞，PBS重懸后調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個(gè)/mL，接種于96孔板，細(xì)胞融合達(dá)80%時(shí)，加入12.5、25、50、100、200 μmol/L濃度的莪術(shù)醇（使用RPMI 1640培養(yǎng)基稀釋），另設(shè)不含莪術(shù)醇的空白組，各設(shè)5 個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)24 h 后，每孔避光加入5 g/L 的MTT 溶液20 μL，孵育4 h 后棄去上清，每孔加入150 μL 的DMSO，充分振蕩10 min，使用酶標(biāo)儀于490 nm 處讀取各孔吸光度（A）值，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率，增殖抑制率=（1-藥物組A值/空白組A值）×100%，計(jì)算半數(shù)抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）。

1.2.3 細(xì)胞分組

取對數(shù)增殖期MCF-7 細(xì)胞，分為對照組、莪術(shù)醇組、740Y-P 組和莪術(shù)醇+740Y-P 組，莪術(shù)醇組加入50 μmol/L 的莪術(shù)醇，740Y-P 組加入10 μmol/L 的740Y-P，莪術(shù)醇+740Y-P 組分別加入上述濃度莪術(shù)醇和740Y-P，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.2.4 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞克隆形成能力

調(diào)整各組細(xì)胞密度為4×102個(gè)/mL，接種于培養(yǎng)皿，每2 d 換液1 次，培養(yǎng)14 d 后，棄去培養(yǎng)基，PBS清洗，4%多聚甲醛固定15 min，0.5%結(jié)晶紫染色20 min，吸出染色液，PBS 清洗，晾干，拍照觀察，計(jì)數(shù)每組細(xì)胞克隆形成數(shù)。

1.2.5 Hoechst 33258染色檢測細(xì)胞凋亡情況

取各組細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度1×105個(gè)/mL，接種于6 孔板中，培養(yǎng)24 h 后，棄去培養(yǎng)液，胰酶消化，PBS清 洗2 次，4% 多聚甲醛固定15 min，加入5 μL Hoechst 33258 染液和5 μL PI 染液，4 ℃孵育30 min，熒光顯微鏡觀察細(xì)胞凋亡情況，顯示藍(lán)色熒光表示細(xì)胞凋亡。

1.2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率

各組細(xì)胞調(diào)整密度為1×105個(gè)/mL，接種于6孔板，24 h后，收集各組細(xì)胞，胰酶消化，1 000 r/min離心5 min，PBS 清洗，加入100 μL Binding Buffer重懸細(xì)胞，加入195 μLAnnexin-Ⅴ4 ℃搖床避光孵育15 min，加入5 μL PI染液混勻，4 ℃孵育5 min。上流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況，計(jì)算細(xì)胞凋亡率。凋亡率=早期凋亡率+晚期凋亡率。重復(fù)3次，取平均值。

1.2.7 MDC染色觀察細(xì)胞自噬

各組細(xì)胞調(diào)整密度為1×105個(gè)/mL，接種于6 孔板，24 h 后，棄去培養(yǎng)基，PBS 清洗，加入0.05 mml/L的MDC 染液，37 ℃孵育60 min，棄去染液，PBS 清洗，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞自噬情況，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)點(diǎn)狀熒光染色表示為自噬泡。

1.2.8 Western blot檢測細(xì)胞中相關(guān)蛋白表達(dá)

收集各組細(xì)胞，胰酶消化，PBS 洗滌，加入RIPA細(xì)胞裂解液充分混勻，置于冰上裂解，12 000 r/min離心15 min，取上清，BCA 法測定蛋白濃度。100 ℃水浴5 min 使蛋白變性，加樣、進(jìn)行SDS-PAGE 凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，將條帶放入5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，TBST 洗 膜15 min×2 次，將膜放入稀釋好的PI3K、Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR、Beclin-1、p62、LC3B 一抗中，4 ℃孵育過夜，TBST 洗膜15 min×3次，將膜放入稀釋好的HRP 標(biāo)記的二抗中，室溫?fù)u床孵育2 h，TBST 洗膜15 min×3 次。將ECL 工作液滴入PDVF 膜上，避光孵育3 min，放入凝膠成像系統(tǒng)，曝光顯影，Image J軟件分析各條帶灰度值，以目的蛋白和內(nèi)參GAPDH 蛋白條帶灰度比值表示目的蛋白相對表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS25.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料

2 結(jié)果

2.1 不同濃度莪術(shù)醇對MCF-7細(xì)胞的增殖抑制作用

隨著莪術(shù)醇濃度升高，細(xì)胞增殖抑制率增加，呈劑量依賴性（P＜0.05），見圖1。莪術(shù)醇作用于MCF-7 細(xì)胞的IC50為50.63 μmol/L，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選取莪術(shù)醇濃度為50 μmol/L。

圖1 不同濃度莪術(shù)醇對MCF-7細(xì)胞的增殖抑制作用

2.2 各組細(xì)胞克隆形成數(shù)比較

與對照組（113.69±12.16 個(gè)）比較，740Y-P 組細(xì)胞克隆形成數(shù)（184.13±8.52 個(gè)）增加，莪術(shù)醇組細(xì)胞克隆形成數(shù)（26.19±7.58 個(gè)）減少（P＜0.05）；莪術(shù)醇+740Y-P組細(xì)胞克隆形成數(shù)（52.47±10.82個(gè)）較740Y-P組減少，較莪術(shù)醇組增加（P＜0.05）。見圖2。

圖2 各組細(xì)胞克隆形成結(jié)果

2.3 Hoechs 33258染色結(jié)果

熒光顯微鏡下可見，對照組和740Y-P 組細(xì)胞數(shù)量較多，藍(lán)色熒光較弱，生長良好，染色均勻，凋亡細(xì)胞較少；莪術(shù)醇組細(xì)胞數(shù)量減少，可見大量較強(qiáng)藍(lán)色熒光，細(xì)胞形態(tài)皺縮，發(fā)生解體；莪術(shù)醇+740Y-P 組細(xì)胞數(shù)量較莪術(shù)醇組增加，可見較多藍(lán)色熒光，部分細(xì)胞解體。見圖3。

圖3 各組細(xì)胞Hoechs 33258染色結(jié)果（×100）

2.4 各組細(xì)胞凋亡率比較

與對照組（[3.21±0.74）%]比較，740Y-P 組細(xì)胞凋亡率[（1.65±0.68）%]降低，莪術(shù)醇組細(xì)胞凋亡率（[25.68±1.47）%]升高（P＜0.05）；莪術(shù)醇+740Y-P 組細(xì)胞凋亡率（[12.27±1.36）%]較740Y-P 組升高，較莪術(shù)醇組降低（P＜0.05）。見圖4。

圖4 各組細(xì)胞流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果

2.5 MDC染色結(jié)果

MDC 染色顯示，對照組、740Y-P 組熒光強(qiáng)度較弱；莪術(shù)醇組出現(xiàn)大量綠色熒光增強(qiáng)的自噬泡，莪術(shù)醇+740Y-P組自噬泡較莪術(shù)醇組減少。見圖5。

圖5 各組細(xì)胞MDC染色結(jié)果（×400）

2.6 各組細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較

Beclin1、p62、LC3Ⅱ/LCⅠ在各組之間存在差異。與對照組比較，740Y-P 組細(xì)胞中Beclin1 蛋白表達(dá)水平、LC3Ⅱ/LCⅠ降低，P62 蛋白表達(dá)水平升高，莪術(shù)醇組細(xì)胞中Beclin1 蛋白表達(dá)水平、LC3Ⅱ/LCⅠ升高，P62 蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05）；莪術(shù)醇+740YP 組細(xì)胞中Beclin1 蛋白表達(dá)水平、LC3Ⅱ/LCⅠ較740Y-P 組升高，較莪術(shù)醇組降低，p62 蛋白表達(dá)水平較740Y-P 組降低，較莪術(shù)醇組升高（P＜0.05）。見表1，圖6。

表1 各組細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較

圖6 各組細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白表達(dá)電泳圖

2.7 各組細(xì)胞中PI3K/Akt/mTOR 通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較

除Akt和mTOR 外，其他檢測指標(biāo)在各組之間存在差異。與對照組比較，740Y-P 組細(xì)胞中PI3K、p-Akt、p-mTOR 蛋白表達(dá)水平升高，莪術(shù)醇組細(xì)胞中PI3K、p-Akt、p-mTOR 蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05）；莪術(shù)醇+740Y-P 組細(xì)胞中PI3K、p-Akt、p-mTOR 蛋白表達(dá)水平較740Y-P 組降低，較莪術(shù)醇組升高（P＜0.05）。見表2，圖7。

表2 各組細(xì)胞中PI3K/Akt/mTOR 通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較（，n=5）

表2 各組細(xì)胞中PI3K/Akt/mTOR 通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較（，n=5）

注：（1）與對照組比較，P＜0.05；（2）與740Y-P組比較，P＜0.05；（3）與莪術(shù)醇組比較，P＜0.05。

圖7 各組細(xì)胞中PI3K/Akt/mTOR通路相關(guān)蛋白表達(dá)電泳圖

3 討論

乳腺癌細(xì)胞通過無限增殖，促進(jìn)腫瘤生長，侵襲鄰近組織和器官，向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，并可對傳統(tǒng)化療藥物產(chǎn)生抗藥性，影響治療效果，預(yù)后不佳。自噬參與腫瘤細(xì)胞生存、分化等多個(gè)生理過程，在維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)過程中發(fā)揮重要作用。同時(shí)有研究顯示，自噬可消化水解毒性蛋白，與腫瘤細(xì)胞耐藥密切相關(guān)[7]。自噬與凋亡存在相互關(guān)系，參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞凋亡過程，通過誘導(dǎo)自噬，提高腫瘤細(xì)胞自身降解，進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡，輔助增加腫瘤細(xì)胞對抗腫瘤藥物的敏感性，對于臨床治療腫瘤具有重要意義[8]。

莪術(shù)醇活性廣泛，可通過調(diào)控相關(guān)促癌或抑癌基因表達(dá)、減弱腫瘤組織血管生成能力、影響細(xì)胞分化，抑制腫瘤細(xì)胞增殖，阻止腫瘤發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移，具有明顯抗腫瘤活性[9]。本研究采用不同濃度莪術(shù)醇作用于MCF-7 細(xì)胞，結(jié)果顯示，莪術(shù)醇以劑量依賴方式不同程度抑制細(xì)胞的增殖，證實(shí)了莪術(shù)醇對乳腺癌細(xì)胞的增殖抑制作用。Ning 等[10]報(bào)道，莪術(shù)醇可調(diào)節(jié)微小RNA 表達(dá)，抑制黑色素瘤小鼠腫瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移。Cai 等[11]研究表明，莪術(shù)醇可增加塞來昔布對非小細(xì)胞肺癌的抑制作用，減少肺組織腫瘤轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)。本研究采用克隆形成實(shí)驗(yàn)、Hoechst33258染色及流式細(xì)胞術(shù)分別檢測細(xì)胞克隆形成能力、形態(tài)改變及凋亡情況，結(jié)果顯示莪術(shù)醇組細(xì)胞克隆形成數(shù)較對照組明顯減少，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯改變，凋亡率明顯升高，進(jìn)一步證實(shí)莪術(shù)醇可抑制乳腺癌細(xì)胞增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

自噬通過在溶酶體中降解內(nèi)吞蛋白質(zhì)或受損細(xì)胞器，提供能量來源，有助于細(xì)胞生存，然而過度自噬可導(dǎo)致細(xì)胞自噬性死亡，對細(xì)胞具有促進(jìn)生存及誘導(dǎo)死亡的雙重作用。激活自噬被認(rèn)為是抗腫瘤的新途徑，通過增加細(xì)胞自噬通量，促進(jìn)細(xì)胞死亡，可有針對性地逆轉(zhuǎn)乳腺癌細(xì)胞耐藥性，發(fā)揮抗腫瘤作用[12]。Beclin1 蛋白參與介導(dǎo)吞噬泡的形成，其表達(dá)降低則自噬體形成受限；LC3B 是檢測自噬活性標(biāo)志性蛋白，包括Ⅰ型和Ⅱ型，發(fā)生自噬時(shí)，LC3 Ⅰ經(jīng)泛素樣修飾形成LC3 Ⅱ，LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ與自噬活性密切相關(guān)；p62 蛋白可反映自噬的強(qiáng)弱，與自噬水平呈負(fù)相關(guān)。本研究結(jié)果顯示莪術(shù)醇組細(xì)胞MDC 染色自噬水平，Beclin1 蛋白表達(dá)、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ較對照組明顯升高，p62 蛋白表達(dá)明顯降低，提示莪術(shù)醇可誘導(dǎo)MCF-7 細(xì)胞發(fā)生自噬，可能是其抑制細(xì)胞增殖誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的相關(guān)機(jī)制之一。Zhang 等[13]證實(shí)，在骨肉瘤MG-63 細(xì)胞中，莪術(shù)醇可通過誘導(dǎo)自噬，抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。此外，劉發(fā)英等[14]研究顯示，莪術(shù)醇在宮頸癌-HCC94 細(xì)胞中同樣可發(fā)揮誘導(dǎo)自噬，促進(jìn)凋亡的作用。本研究結(jié)果與以上研究一致，提示莪術(shù)醇通過誘導(dǎo)自噬，增加MCF-7 細(xì)胞自噬通量，促進(jìn)自身降解，發(fā)揮潛在抗腫瘤作用。

PI3K/Akt/mTOR 信號通路廣泛參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡等過程，與腫瘤細(xì)胞自噬密切相關(guān)，抑制該通路是抗腫瘤的重要途徑。PI3K 是上游通路關(guān)鍵信號分子，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期，Akt 是PI3K 下游重要靶蛋白，可被其磷酸化活化為p-Akt，進(jìn)一步激活下游mTOR 為p-mTOR，抑制細(xì)胞自噬和凋亡，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期進(jìn)程加速，在腫瘤形成及侵襲過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[15]。莪術(shù)醇通過何種機(jī)制誘導(dǎo)MCF-7 細(xì)胞自噬，尚需進(jìn)一步研究探討，本研究使用PI3K 激活劑740Y-P 干預(yù)MCF-7 細(xì)胞，結(jié)果顯示PI3K/Akt/mTOR 信號通路激活，細(xì)胞自噬被抑制，而莪術(shù)醇組PI3K、p-Akt、p-mTOR 蛋白表達(dá)較對照組明顯下降，自噬水平升高，提示莪術(shù)醇可能具有抑制該通路激活自噬的作用。進(jìn)一步在莪術(shù)醇干預(yù)的基礎(chǔ)上聯(lián)合使用740Y-P，結(jié)果顯示，740Y-P可減弱莪術(shù)醇對PI3K/Akt/mTOR 信號通路的抑制作用，同時(shí)自噬相關(guān)蛋白表達(dá)也發(fā)生明顯逆轉(zhuǎn)，結(jié)果證實(shí)莪術(shù)醇可抑制PI3K/Akt/mTOR 信號通路，提示莪術(shù)醇抑制MCF-細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，可能與調(diào)控PI3K/Akt/mTOR信號通路介導(dǎo)的自噬有關(guān)。

綜上，莪術(shù)醇可抑制乳腺癌MCF-7 細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，可能與抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路關(guān)鍵蛋白表達(dá)，進(jìn)而激活自噬有關(guān)，這可為臨床乳腺癌相關(guān)藥物開發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。此外，本研究僅局限在細(xì)胞水平，尚需在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證以上結(jié)論。