劉超,呂雪梅,景贊
樂山市食品藥品檢驗檢測中心(樂山 614000)
三聚氰胺是一種三嗪類含氮雜環(huán)有機化合物,俗稱蛋白精、密胺,常被用作化工原料,不可用作食品添加劑[1-3]。其主要用途是作為原料生產(chǎn)三聚氰胺甲醛樹脂。人和動物長期食用含有三聚氰胺的食物可能會導(dǎo)致腎衰竭或死亡[4]。然而常有不法分子為降低食品生產(chǎn)成本,利用蛋白質(zhì)檢測技術(shù)缺陷在部分食品中添加三聚氰胺。
液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)是一種分離檢測技術(shù),具有選擇性高、定性能力強、分析速度快,高分離效能以及高靈敏度的特點[5-9]。近年來,液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)在食品中三聚氰胺的檢測得到廣泛應(yīng)用。
然而由于基質(zhì)效應(yīng)的存在,影響待測物在檢測儀器中的響應(yīng),導(dǎo)致待測物的響應(yīng)減弱或增強,進一步影響待測物的定量限、檢出限、精確度及準確度等[10-13]。因此,探究并消除在利用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對奶糖、巧克力檢測三聚氰胺時基質(zhì)效應(yīng)的影響。
ME104E電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司);DGU20A-API4500液質(zhì)聯(lián)用儀(美國AB SCIEX公司);HSC-12A氮吹儀(北京佳航博創(chuàng)科技有限公司);VM24固相萃取儀(天津艾杰爾科技有限公司);HT190R高速臺式冷凍離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司);SHA-B水浴恒溫振蕩器(長州冠軍儀器制造頭有限公司);KQ3200E超聲波清洗機(昆山市超聲儀器有限公司);60 mg/3 mL固相萃取柱(天津艾杰爾科技有限公司)。
乙腈、甲醇(均為色譜純);三氯乙酸、氨水、乙酸銨、海沙(含量25%~28%),均為分析純;三聚氰胺標準品(99.4%,批號G976694,Dr.Ehrenstorfer GmbH);水(GB/T 6682—2016《分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法》規(guī)定一級水);三聚氰胺-13C3(100 μg/mL 壇墨質(zhì)檢科技股份有限公司);WCX前處理小柱[60 mg/3 mL沃特世科技(上海)有限公司];Cleanert PCX前處理小柱(60 mg/3 mL,天津艾杰爾科技有限公司);Bond Elut Plexa PCX前處理小柱(60 mg/3 mL安捷倫科技有限公司)。
奶糖樣品:旺仔牛奶糖、錦大手工牛軋?zhí)?、不二家香酥牛奶糖、葡記蔓越莓味咸牛軋?zhí)恰⒋蟀淄媚烫?、阿爾卑斯牛奶硬糖、徐福記散裝奶糖、金絲猴奶糖。
巧克力樣品:德芙、士力架、雀巢、徐福記、金絲猴、金莎、金帝、申豐。
具塞塑料離心管(50 mL);研缽;定性濾紙;SPE小柱(WCX、Cleanert PCX、Bond Elut Plexa PCX)。
提取、凈化方法分別參照GB/T 22388—2008《原料乳與乳制品中三聚氰胺檢測方法》[14]。
準確稱取10.00 mg(精確到0.01 mg)三聚氰胺標準品于10 mL容量瓶中,用50%甲醇水溶液溶解并定容至刻度,配制成質(zhì)量濃度1 mg/mL的標準儲備液,在4 ℃避光的條件下保存。
三聚氰胺標準中間液:準確移取25 μL三聚氰胺標準儲備液至25 mL容量瓶中,用50%甲醇水溶解并定容至刻度,混勻后貼標簽備用。
三聚氰胺內(nèi)標中間液:準確移取250 μL三聚氰胺標準儲備液至25 mL容量瓶中,用50%甲醇水溶解并定容至刻度,混勻后貼標簽備用。
液相色譜條件、質(zhì)譜條件參照GB/T 22388—2008《原料乳與乳制品中三聚氰胺檢測方法》。
運用定量測定空白基質(zhì)提取液與純?nèi)軇┲型瑵舛确治鑫锏碾x子響應(yīng)程度,通過式(1),計算二者比值評價基質(zhì)效應(yīng)。
式中:A和B為基質(zhì)溶液和純?nèi)軇┓治鑫锏姆迕娣e。A/B<80%時,對分析物的響應(yīng)產(chǎn)生抑制作用;A/B>120%,對分析物的響應(yīng)產(chǎn)生增強作用;80%<A/B<120%,不存在基質(zhì)效應(yīng)。
所有數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0軟件進行單因素方差分析。
分別稱取0.50 g奶糖和1.00 g巧克力樣品,按照1.3的樣品處理方法進行提取和凈化,按照1.6的方法進行測量并記錄數(shù)據(jù),并按照1.8進行統(tǒng)計分析。結(jié)果見表1,圖1和圖2。
圖1 取樣量對奶糖中三聚氰胺基質(zhì)效應(yīng)的影響
圖2 取樣量對巧克力中三聚氰胺基質(zhì)效應(yīng)的影響
表1 取樣量對奶糖、巧克力中三聚氰胺基質(zhì)效應(yīng)的影響
由表1可知,取樣量對奶糖、巧克力中三聚氰胺的ME存在顯著性差異。由圖1可知,改變?nèi)恿浚烫侵腥矍璋返幕|(zhì)效應(yīng)分別在27.4%~36.0%和17.1%~25.3%。由圖2可知,改變?nèi)恿?,巧克力中三聚氰胺的基質(zhì)效應(yīng)分別在26.3%~38.5%和18.0%~29.6%。
分別稱取等量的4份奶糖和巧克力樣品,第1份用10 mL水作為溶劑,第2份用6 mL乙腈和4 mL水(即V乙腈∶V水=3∶2)作為溶劑,第3份用10 mL純?nèi)纫宜嶙鳛槿軇?,?份用8 mL三氯乙酸和2 mL乙腈(即V三氯乙酸∶V乙腈=4∶1)作為溶劑,按照1.3樣品處理方法進行提取和凈化,按照1.6的方法進行測量并記錄數(shù)據(jù),并按照1.8進行統(tǒng)計分析。結(jié)果見表2,圖3和圖4。
圖3 溶劑種類對奶糖中三聚氰胺基質(zhì)效應(yīng)的影響
圖4 溶劑種類對巧克力中三聚氰胺基質(zhì)效應(yīng)的影響
表2 溶劑種類對奶糖、巧克力中三聚氰胺基質(zhì)效應(yīng)的影響
由表2可知,溶劑水和乙腈-水(3∶2,V/V)對奶糖、巧克力中三聚氰胺的ME存在顯著性差異。溶劑三氯乙酸和三氯乙酸-乙腈(4∶1,V/V)檢測奶糖、巧克力中三聚氰胺的ME不存在顯著性差異。由圖3可知,通過改變?nèi)軇┓N類測得奶糖中三聚氰胺的基質(zhì)效應(yīng)分別在32.8%~44.7%,25.9%~37.8%,19.2%~30.7%和17.3%~29.2%之間。由圖4可知,通過改變?nèi)軇┓N類,測得巧克力中三聚氰胺的基質(zhì)效應(yīng)分別在32.3%~42.1%,25.9%~34.6%,19.2%~27.0%和16.8%~24.4%之間。
分別稱取3份等量的奶糖和巧克力樣品,統(tǒng)一選用三氯乙酸-乙腈(4∶1,V/V)作為溶劑,第一份加入4 mL三氯乙酸和1 mL乙腈(即溶劑用量5 mL),第2份加入8 mL三氯乙酸和2 mL乙腈(即溶劑用量為10 mL),第3份加入12 mL三氯乙酸和3 mL乙腈(即溶劑用量15 mL),按照1.3的樣品處理方法進行提取和凈化,按照1.6的方法進行測量并記錄數(shù)據(jù),并按照1.8進行統(tǒng)計分析。結(jié)果見表3,圖5和圖6。
圖5 溶劑用量對奶糖中三聚氰胺基質(zhì)效應(yīng)的影響
圖6 溶劑用量對巧克力中三聚氰胺基質(zhì)效應(yīng)的影響
表3 溶劑用量對奶糖、巧克力中三聚氰胺基質(zhì)效應(yīng)的影響
由表3可知,溶劑用量對檢測奶糖、巧克力中三聚氰胺的ME存在顯著性差異。由圖5可知,通過改變?nèi)軇┯昧浚瑴y得奶糖中三聚氰胺的基質(zhì)效應(yīng)分別在24.7%~32.0%,17.8%~25.8%和14.6%~25.8%之間。由圖6可知,改變?nèi)軇┯昧浚瑴y得巧克力中三聚氰胺的基質(zhì)效應(yīng)分別為24.0%~35.4%,18.5%~30%和15.0%~26.4%之間。
分別稱取3份等量的奶糖和巧克力樣品,參照1.3的方法進行提取和凈化。處理后的3份樣品中分別加入10 ng/mL三聚氰胺儲備液、50 ng/mL三聚氰胺儲備液和100 ng/mL三聚氰胺儲備液,按照1.6的方法進行測量并記錄數(shù)據(jù),并按照1.8進行統(tǒng)計分析。結(jié)果見表4,圖7和圖8。
圖7 三聚氰胺濃度對奶糖中三聚氰胺基質(zhì)效應(yīng)的影響
圖8 三聚氰胺濃度對巧克力中三聚氰胺基質(zhì)效應(yīng)的影響
表4 三聚氰胺濃度對奶糖、巧克力中三聚氰胺基質(zhì)效應(yīng)的影響
由表4可知,三聚氰胺濃度對檢測奶糖、巧克力中三聚氰胺的ME不存在顯著性差異。由圖7可知,改變?nèi)矍璋窛舛饶烫侵腥矍璋返幕|(zhì)效應(yīng)分別在17.0%~24.2%,18.5%~30.0%和15.0%~26.4%之間。由圖8得知,改變?nèi)矍璋窛舛惹煽肆?,三聚氰胺的基質(zhì)效應(yīng)分別在18.7%~31.8%,19.7%~31.8%和20.0%~30.9%之間。
分別稱取4份等量的奶糖和巧克力樣品,參照1.3的方法進行樣品處理,第1份樣品不過柱,第2份樣品過WCX SPE小柱,第3份樣品過Cleanert PCX SPE小柱,第4份樣品過Bond Elut Plexa PCX SPEX小柱,按照1.6的方法進行測量并記錄數(shù)據(jù),并按照1.8進行統(tǒng)計分析。結(jié)果見表5,圖9和圖10。
圖9 凈化方式對奶糖中三聚氰胺基質(zhì)效應(yīng)的影響
圖10 凈化方式對巧克力中三聚氰胺基質(zhì)效應(yīng)的影響
表5 SPE小柱對奶糖、巧克力中三聚氰胺基質(zhì)效應(yīng)的影響
由表5可知,不過SPE小柱和過不同小柱之間對奶糖、巧克力中三聚氰胺的ME存在顯著性差異。而過不同SPE小柱之間沒有顯著性差異。由圖9可知,通過改變不過SPE小柱和過WCX、Cleanert PCX、Bond Elut Plexa PCXSPE小柱奶糖,三聚氰胺的基質(zhì)效應(yīng)分別在11.7%~26.0%,17.5%~25.9%,19.7%~31.8%和18.8%~24.8%之間。由圖10可知,通過改變不過SPE小柱和過WCX、Cleanert PCX、Bond Elut Plexa PCX小柱而測得巧克力中三聚氰胺的基質(zhì)效應(yīng)分別在12.1%~24.0%,17.3%~29.2%,18.1%~27.9%和19.2%~28.3%之間。
取空白樣品按照1.3的方法處理。用空白溶液將三聚氰胺標準儲備液逐級稀釋,得到質(zhì)量濃度為10.00,20.00,40.00,80.00,160.00和200.00 ng/mL的標準工作液,每毫升三聚氰胺標準工作液中含有三聚氰胺的內(nèi)標質(zhì)量濃度20 ng/mL。將濃度由低到高進樣檢測,橫坐標為三聚氰胺濃度、縱坐標為三聚氰胺峰面積/內(nèi)表峰面積,得到標準曲線回歸方程,見表6。
表6 三聚氰胺標準曲線
稱量9個空白樣品至9個50 mL的具塞塑料離心管中,加入相同體積的20.00 μL內(nèi)標中間溶液,然后分別加入25.00,50.00和100.00 μL三聚氰胺標準中間溶液,做三水平三平行回收試驗,按照1.3的方法提取和凈化處理,記錄各樣品三聚氰胺峰面積和內(nèi)標峰面積,計算加標回收率。
由表7和表8可得,隨著加標濃度的變化,回收率都在97.18%~110.5%之間,內(nèi)標法對三聚氰胺基質(zhì)效應(yīng)的消除具有非常顯著的效果,徹底消除基質(zhì)效應(yīng),達到理想的效果。
表7 奶糖樣品加標回收率(n=3)
表8 巧克力樣品加標回收率(n=3)
從樂山市場任意選取8種奶糖和8種巧克力,通過液質(zhì)聯(lián)用對其進行三聚氰胺基質(zhì)效應(yīng)的探究,并通過單因素方差分析探究了取樣量、溶劑種類、溶劑用量、三聚氰胺濃度及SPE小柱對檢測三聚氰胺基質(zhì)效應(yīng)的影響是否顯著。試驗結(jié)果表明取樣量、溶劑種類[除三氯乙酸和三氯乙酸-乙腈(4∶1,V/V)]、溶劑用量及不過SPE小柱對三聚氰胺基質(zhì)效應(yīng)的檢測都具有顯著性差異,而三聚氰胺濃度和SPE小柱的類型以及溶劑三氯乙酸和三氯乙酸-乙腈(4∶1,V/V)對三聚氰胺基質(zhì)效應(yīng)的檢測沒有顯著性差異。通過內(nèi)標法有效消除三聚氰胺基質(zhì)效應(yīng)的影響。