基于UPLC-Q-TOF/MS技術(shù)的大建中湯血清藥物化學(xué)研究

蔣 淼，彭 偉，吳純潔，王家葵

基于UPLC-Q-TOF/MS技術(shù)的大建中湯血清藥物化學(xué)研究

蔣 淼，彭 偉，吳純潔*，王家葵*

成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，中藥標(biāo)準(zhǔn)化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西南特色中藥資源國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 611137

應(yīng)用血清藥物化學(xué)方法分析大建中湯入血成分及體外化學(xué)成分。采用UPLC-Q-TOF/MS技術(shù)快速鑒定大建中湯經(jīng)大鼠ig給藥后吸收入血的原型成分、代謝成分以及體外化學(xué)成分，結(jié)合UNIFI軟件系統(tǒng)分析，根據(jù)質(zhì)譜相對(duì)分子質(zhì)量、裂解規(guī)律、文獻(xiàn)報(bào)道等方法對(duì)質(zhì)譜碎片信息進(jìn)行分析，表征大建中湯入血成分及體外化學(xué)成分。在給藥血清中檢測(cè)出22個(gè)入血成分，包括5個(gè)原型成分和17個(gè)代謝產(chǎn)物，體外分析鑒定得到41個(gè)化學(xué)成分。UPLC-Q-TOF/MS技術(shù)可實(shí)現(xiàn)大建中湯體內(nèi)外化學(xué)成分的快速鑒定，且血清中鑒定出的原型成分和代謝產(chǎn)物可能是大建中湯潛在的活性成分，可為其質(zhì)量控制研究提供依據(jù)。

大建中湯；血清藥物化學(xué)；UPLC-Q-TOF/MS；原型成分；代謝產(chǎn)物；人參皂苷Rg1；羥基-α-山椒素

大建中湯源自張仲景所著《金匱要略》，是中醫(yī)臨床治療脾胃虛寒證的有效溫里劑。大建中湯由蜀椒Maxim．、干姜Rosc.、人參C. A. Meyer、飴糖4味藥物組成，具有溫中補(bǔ)虛、降逆止痛之功效，主治中陽衰弱、陰寒內(nèi)盛之脘腹劇痛證?，F(xiàn)代研究表明，大建中湯具有改善人體微循環(huán)、調(diào)節(jié)消化系統(tǒng)與脾胃系統(tǒng)等作用，多用于治療胃腸梗阻性疾病[1-2]。大建中湯是2018年國(guó)家中醫(yī)藥管理局公布的《古代經(jīng)典名方目錄（第一批）》100方劑之一，自FDA公布植物藥指導(dǎo)后日本開始大量研究，國(guó)內(nèi)醫(yī)療機(jī)構(gòu)及研究所也共同進(jìn)行臨床和基礎(chǔ)研究，由此可見大建中湯具有較高研究?jī)r(jià)值[3]。我國(guó)目前對(duì)大建中湯研究主要集中于臨床應(yīng)用及藥理實(shí)驗(yàn)研究，對(duì)其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究相對(duì)薄弱[4]。因此，亟待闡明大建中湯的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，為揭示大建中湯臨床有效的科學(xué)性奠定物質(zhì)基礎(chǔ)。

中藥血清藥物化學(xué)是以鑒別口服中藥后血清中原型成分為基礎(chǔ)的一種新興研究方法，在中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究中得到了廣泛的認(rèn)可與應(yīng)用。超高效液相色譜聯(lián)用高分辨飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（ultra-high performance liquid chromatography with quadrupole time-of-flight mass spectrometry，UPLC-Q-TOF/MS）具有分離度好、高分辨率、高靈敏度和精確測(cè)定相對(duì)分子質(zhì)量等特點(diǎn)，能快速有效的分離及鑒定復(fù)雜中藥體系中的有效成分，并廣泛應(yīng)用于中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究領(lǐng)域中。因此，本研究擬應(yīng)用血清藥物化學(xué)方法結(jié)合UPLC-Q-TOF/MS技術(shù)對(duì)大建中湯的入血成分進(jìn)行快速定性分析，為揭示大建中湯藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Acquity UPLC I-class超高效液相色譜儀（美國(guó)Waters公司），Xevo G2-XS Q-TOF飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（美國(guó)Waters公司），Sartorius BSA124S型電子天平（北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司），SB5200D型超聲清洗儀（寧波新藝超聲設(shè)備有限公司），TGL-16M型離心機(jī)（湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司）。

1.2 材料

乙腈（色譜純，美國(guó)Thermo Fisher公司）；甲酸（分析純，美國(guó)Thermo Fisher公司）；水為屈臣氏蒸餾水；對(duì)照品蔗糖（批號(hào)MUST-20191001）、鳥苷（批號(hào)MUST-20180512）、苯丙氨酸（批號(hào)MUST-20191513）、6-姜素（批號(hào)MUST-20181311）、綠原酸（批號(hào)MUST-20190308）、蘆?。ㄅ?hào)MUST-20181219）、水仙苷（批號(hào)MUST-20181311）、原花青素B1（批號(hào)MUST-20180201）、人參皂苷Rg1（批號(hào)MUST-20110810），購(gòu)于成都曼思特生物科技股份有限公司；羥基-α-山椒素（批號(hào)HR1292W2）、槲皮苷（批號(hào)HR1106B3）購(gòu)于寶雞辰光生物有限公司；所有對(duì)照品質(zhì)量分?jǐn)?shù)均≥95.0%（HPLC-UV檢測(cè)）。

蜀椒（批號(hào)2112121）、干姜（批號(hào)2109082）購(gòu)于四川新荷花中藥飲片股份有限公司；人參（批號(hào)2012001）購(gòu)于河北百合健康有限公司；飴糖（批號(hào)200401），購(gòu)于安徽三義堂藥業(yè)有限公司。經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)吳純潔教授鑒定，均符合《中國(guó)藥典》相關(guān)要求。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)雄性SD大鼠，體質(zhì)量180～220 g，購(gòu)于成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，合格證號(hào)SCXK（川）2015-030，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)2014 DL-023）。

2 方法

2.1 對(duì)照品溶液的制備

各取對(duì)照品蔗糖、鳥苷、苯丙氨酸、6-姜素、綠原酸、蘆丁、水仙苷、原花青素B1、人參皂苷Rg1、羥基-α-山椒素、槲皮苷以甲醇溶解定容，配制質(zhì)量濃度約為200 μg/mL的儲(chǔ)備液；UPLC-MS檢測(cè)前以甲醇稀釋10倍后，過0.22 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，待測(cè)。

2.2 大建中湯ig溶液的制備

準(zhǔn)確稱量蜀椒6 g、干姜12 g、人參6 g置于500 mL純凈水中浸泡30 min，然后煎煮30 min，除去藥渣，加入飴糖30 g，濃縮成0.6 g/mL藥液，置于4 ℃靜置過夜，收集上清層，過0.22 μm濾膜，放置于?80 ℃，以供大鼠ig使用。

2.3 大建中湯體外分析溶液的制備

將“2.3”項(xiàng)下制備的大建中湯湯液，加入400 mL乙醇，置于4 ℃靜置過夜，收集上清層，過0.22 μm濾膜，儲(chǔ)存至4 ℃冰箱中，以供大建中湯液化學(xué)成分分析使用。

2.4 血清樣品的制備

雄性SD大鼠，隨機(jī)分為2組（空白組、大建中湯給藥組），并稱定體質(zhì)量，大建中湯給藥組按70 mg/kg（按照成人每日劑量換算），5 mL/kg，ig大建中湯溶液，對(duì)照組給予相應(yīng)劑量純凈水。連續(xù)給藥3 d，在第3天給藥4 h后，用1%戊巴比妥鈉麻醉，腹主動(dòng)脈取血置采血管管中，于4 ℃條件下3500 r/min離心10 min分離血清，置?80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

取大鼠給藥血清樣品500 μL，以O(shè)ASIS HLB 3cc固相萃取小柱進(jìn)行富集凈化后，上清液4 ℃下N2吹干，殘?jiān)?00 μL甲醇渦旋1 min復(fù)溶，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過，續(xù)濾液供UPLC-Q-TOF-MS檢測(cè)分析，空白血清進(jìn)行同樣操作。

2.5 色譜條件

Waters HHS T3色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），以乙腈（A）-0.1%甲酸水溶液（B）為流動(dòng)相，梯度洗脫：0～4 min，0～4% A；4～7 min，4%～10% A；7～11 min，10%～25% A；11～16 min，25%～30% A；16～22 min，30%～65% A；22～25 min，65%～90% A；25～27 min，90% A；27～28 min，90% A～100% B；28～32 min，100% B。體積流量0.3 mL/min，柱溫35 ℃，進(jìn)樣量1 μL。

2.6 質(zhì)譜條件

高分辨離子敞度質(zhì)譜儀采用電噴霧離子化源（ESI），用正離子模式（ESI+）/負(fù)離子模式（ESI?）分別進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)，Lockmass以亮氨酸-腦啡肽標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行質(zhì)量鎖定；使用高純N2作為輔助噴霧電離與脫溶劑氣體；霧化氣體積流量為600 L/h, 脫溶劑氣溫度為 400 ℃, 錐孔氣流量為50 L/h，離子源溫度120 ℃，脫溶劑溫度400 ℃，脫溶劑氣流體積流量1000 L/h，毛細(xì)管電壓2.5 kV，錐孔電壓25 V，掃描范圍/100～1200；MSE掃描模式檢測(cè)，低能通道碰撞電壓6 V，高能通道碰撞電壓20～40 V，掃描范圍/100～1200。

2.7 數(shù)據(jù)分析

在UNIFI軟件中正離子模式設(shè)置為加合離子＋H、＋Na，負(fù)離子模式設(shè)置為加合離子?H、＋HCOO，最后提取色譜峰和碎片信息，確定大建中湯中入血成分及代謝產(chǎn)物。再采用UNIFI軟件聯(lián)機(jī)檢索外部數(shù)據(jù)庫（Pubchem/Chemspider/Cambridge Structural Database）對(duì)大建中湯體外化學(xué)成分進(jìn)行比對(duì)，通過文獻(xiàn)查閱、人工解析等方法構(gòu)建大建中湯化合物結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫，再將數(shù)據(jù)導(dǎo)入U(xiǎn)NIFI軟件系統(tǒng)進(jìn)行匹配，結(jié)合裂解規(guī)律、生物合成途徑、文獻(xiàn)報(bào)道的同分異構(gòu)體、保留時(shí)間差異等確定化合物結(jié)構(gòu)。

3 結(jié)果

采用“2.5”項(xiàng)下色譜條件及“2.6”項(xiàng)下質(zhì)譜條件所述優(yōu)化的UPLC-Q-TOF/MS條件，對(duì)大建中湯、大鼠空白血清及給藥血清樣品進(jìn)行檢測(cè)分析（圖1），通過比對(duì)分析大建中湯和給藥血清樣品的色譜圖，同時(shí)存在于大建中湯與給藥血清樣品中的離子被認(rèn)為是潛在的以原型形式吸收的藥物成分。通過查閱數(shù)據(jù)庫并結(jié)合分析質(zhì)譜裂解規(guī)律，在大鼠血清中共檢測(cè)出22個(gè)化學(xué)成分，包括5個(gè)吸收原型成分（表1）和17個(gè)代謝產(chǎn)物（表2），在大建中湯體外醇溶液中鑒定41個(gè)化學(xué)成分（表3）。

A-大建中湯負(fù)離子模式 B-空白血清負(fù)離子模式 C-給藥血清負(fù)離子模式 D-大建中湯正離子模式 E-空白血清正離子模式 F-給藥血清正離子模式

表1 大建中湯吸收入血原型成分UPLC-Q-TOF/MS數(shù)據(jù)

Table 1 UPLC-Q-TOF/MS T data of plasma prototype components of Dajianzhong Decoction

編號(hào)化合物分子式tR/min實(shí)測(cè)值 (m/z)誤差(×10?6)碎片離子加合物形式 P1人參皂苷Rg1C42H72O1410.65845.486 63.9637.429 7, 475.381 1[M＋COOH]? P2人參皂苷ReC48H82O1810.68991.544 9?0.8799.481 1, 637.429 7[M＋COOH]? P3人參皂苷Rb1C54H92O2318.561 107.592 7?2.4945.543 7, 915.528 6[M－H]? P4羥基-α-山椒素C16H25NO219.80264.197 74.5246.186[M＋H]+ P5羥基-β-山椒素C16H25NO220.00264.197 74.5246.186[M＋H]+

表2 大建中湯中血清代謝成分UPLC-Q-TOF/MS數(shù)據(jù)

Table 2 UPLC-Q-TOF/MS data of plasma metabolic components of Dajianzhong Decoction

編號(hào)化合物分子式tR/min實(shí)測(cè)值(m/z)誤差(×10?6)碎片離子加合物形式 M1羥基-α-山椒素單氧化水合物C16H27NO47.97298.199 8?6.7280.190 1[M＋H]+ M2羥基-α-山椒素單氧化水合物異構(gòu)體C16H27NO48.16298.199 8?6.7280.190 1[M＋H]+ M3羥基-α-山椒素單氧化水合物異構(gòu)體C16H27NO48.43298.199 8?6.7280.190 1[M＋H]+ M4羥基-α-山椒素單氧化水合物異構(gòu)體C16H27NO48.71298.199 8?6.7280.190 1[M＋H]+ M5羥基-α-山椒素單氧化水合物C16H27NO49.11298.199 8?6.7280.190 1[M＋H]+ M6羥基-α-山椒素單氧化物C16H25NO39.32298.199 8?6.7280.190 1[M＋H]+ M7羥基-α-山椒素單氧化物異構(gòu)體C16H25NO310.27280.190 8?1.8262.178 9[M＋H]+ M8羥基-α-山椒素單氧化物異構(gòu)體C16H25NO310.52280.190 8?1.8262.178 9[M＋H]+ M9羥基-α-山椒素單氧化物異構(gòu)體C16H25NO310.73280.190 8?1.8262.178 9[M＋H]+ M10羥基-α-山椒素單氧化物異構(gòu)體C16H25NO311.01280.190 8?1.8262.178 9[M＋H]+ M11羥基-α-山椒素單氧化物異構(gòu)體C16H25NO311.28280.190 8?1.8262.178 9[M＋H]+ M12羥基-α-山椒素單氧化物異構(gòu)體C16H25NO311.53280.190 8?1.8262.178 9[M＋H]+ M13羥基-α-山椒素單氧化物異構(gòu)體C16H25NO314.38280.190 8?1.8262.178 9[M＋H]+ M146-姜酚葡萄糖醛酸結(jié)合物C23H34O1015.52488.248 2?2.9277.180 8, 179.080 8[M＋NH4]+ M15羥基-α-山椒素單氧化物C16H25NO315.62280.190 8?1.8262.178 9[M＋H]+ M16羥基-α-山椒素單氧化物異構(gòu)體C16H25NO316.12280.190 8?1.8262.178 9[M＋H]+ M178-姜酚葡萄糖醛酸結(jié)合物C25H38O1019.42516.284 2?4.8323.220 6, 179.070 8[M＋NH4]+

表3 大建中湯醇溶液體外化學(xué)成分UPLC-Q-TOF/MS分析

Table 3 In vitro components in alcohol solution of Dajianzhong Decoction with UPLC-Q-TOF/MS

序號(hào)化合物分子式tR/min實(shí)測(cè)值(m/z)誤差(×10?6)加合物形式離子碎片（m/z）來源文獻(xiàn) 1蔗糖*C12H22O110.59341.112 54.1[M－H]?179.058 8C4 2蘋果酸C4H6O50.67133.016 32.6[M－H]?115.007 1B5 3檸檬酸C6H8O70.75191.022 02.8[M－H]?155.955 0B5 4酪氨酸C9H11NO30.99180.068 92.8[M－H]?163.042 8B6 5鳥苷*C10H13N5O51.40282.085 63.7[M－H]?150.042 3B7 6苯丙氨酸*C9H11NO22.24164.075 03.8[M－H]?147.048 4B6 7新綠原酸C16H18O94.09353.088 74.2[M－H]?191.029 9A6 8原花青素B1*C30H26O124.85577.135 71.1[M－H]?407.075 7A8 9兒茶素C15H14O65.11289.078 97.7[M－H]?245.082 3A9 10綠原酸*C16H18O95.19353.088 74.2[M－H]?191.029 9A4 11原花青素B2C30H26O125.30577.135 71.1[M－H]?407.075 7, 289.071 9A10 12隱綠原酸C16H18O95.51353.088 74.2[M－H]?191.029 9A11

續(xù)表3

序號(hào)化合物分子式tR/min實(shí)測(cè)值（m/z）誤差(×10?6)加合物形式離子碎片（m/z）來源文獻(xiàn) 13原花青素B3C30H26O125.88577.135 71.1[M－H]?407.075 7A 14表兒茶素C15H14O66.30289.071 90.7[M－H]?271.062 2A9 15羥基-α-山椒素氧化產(chǎn)物C16H27NO47.55320.181 62.5[M＋Na]+280.190 1A 16蘆丁*C27H30O168.18609.147 62.0[M－H]?463.091 1A4 17異槲皮苷C21H20O128.35463.090 92.0[M－H]?300.029 2A10 18紫云英苷C21H20O118.88447.094 92.0[M－H]?284.034 6A10 19槲皮苷*C21H20O119.30447.094 92.2[M－H]?300.029 2A8 20異鼠李素-7-O-葡萄糖苷C22H22O129.51477.106 43.1[M－H]?315.049 8A 21水仙苷*C28H32O169.82623.160 22.2[M－H]?315.051 4A10 22異鼠李素-3-O-葡萄糖苷C22H22O129.94477.106 43.1[M－H]?315.051 4, 300.029 2A12 23赤式-2-(4-烯丙基-2,6-二甲氧基苯氧基)-1-(4,5-二羥基-3-甲氧基苯基)-丙烷-1-醇C21H26O710.65389.159 5?0.5[M－H]?195.069 4B 24人參皂苷Rg1*C42H72O1410.73845.389 1?0.8[M＋COOH]?637.429 7,475.381 1C13 25人參皂苷ReC48H82O1810.76991.544 9?0.8[M＋COOH]?637.429 7,475.381 1C14 26赤式-2-(4-烯丙基-2,6-二甲氧基苯氧基)-1-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-丙烷- 1-醇C21H26O612.54373.168 93.8[M－H]?179.070 8B 27人參皂苷RfC42H72O1415.66845.389 1?0.8[M＋COOH]?637.429 7C14 283,5-diacetoxy-1,7-bis(3,4- dihydroxyphenyl)heptaneC23H28O815.79431.171 50.9[M－H]?371.153 7B 29人參皂苷F3C41H70O1316.37815.475 3?0.7[M＋COOH]?637.429 7475.381 1C13 30人參皂苷F2C42H72O1317.40815.475 3?0.7[M＋COOH]? C15 31人參皂苷Rb1C54H92O2318.651 107.592 7?2.4[M－H]?945.543 7C13 32人參皂苷Rb2C53H90O2219.711 123.580 6?2.4[M＋COOH]?945.537 4C14 33人參皂苷Rb3C53H90O2219.731 123.580 6?2.4[M＋COOH]?945.537 4C15 34人參皂苷RdC48H82O1819.77991.544 9?2.9[M＋COOH]?783.490 7C13 356-姜素*C17H26O419.79317.172 42.3[M＋Na]+277.181 3B16 36羥基-α-山椒素*C16H25NO219.84264.196 80.4[M＋H]+246.186 0A17 37人參皂苷Rg2C42H72O1320.15829.491 0?0.7[M＋COOH]?765.478 3C13 38人參皂苷Rg3C42H72O1320.19829.491 0?0.7[M＋COOH]?621.438 3C15 39羥基-γ-山椒素C18H27NO220.24290.212 30.4[M＋H]+272.200 5C17 40人參皂苷Rg5C42H70O1220.95811.479 4?0.7[M＋COOH]?603.429 2C18 41人參皂苷RK1C42H70O1221.07811.479 4?0.7[M＋COOH]?603.429 2C19

*表示與對(duì)照品比對(duì)后確認(rèn)；A-蜀椒 B-干姜 C-人參

*means confirmed after comparison with the reference substance; A-MaximB-Rosc. C-C. A. Meyer

3.1 原型成分的鑒定

在給予大建中湯的大鼠血清中鑒定出5個(gè)原型成分，以化合物P1與P4為例說明推測(cè)過程。

在大鼠血清中檢測(cè)到3個(gè)人參皂苷類成分，該類化合物容易連續(xù)脫糖，過程中存在丟失1個(gè)或多個(gè)H2O，最終形成達(dá)瑪烷型等類型苷元離子?；衔颬1給出分子離子[M＋COOH]?/845.489 1，對(duì)分子離子峰進(jìn)行裂解分析，給出碎片離子/799.481 1 [M－H]?、/637.429 7、/475.379 9。碎片離子/637.429 7為母離子/845.489 1脫去1分子葡萄糖基[M－H－Glc]?產(chǎn)生的，碎片離子/475.379 9為/637.429 7繼續(xù)脫去1分子葡萄糖基[M－H－Glc－Glc]?產(chǎn)生的，最后通過與文獻(xiàn)報(bào)道[20]及對(duì)照品比對(duì)，確定P1號(hào)峰為人參皂苷Rg1，具體裂解途徑如圖2所示。

在大鼠血清中檢測(cè)到2個(gè)山椒素類成分，該類成分主要來源于蜀椒，如化合物P4一級(jí)質(zhì)譜中給出/264.196 8，對(duì)應(yīng)的元素組成C16H26NO2，為加氫形成的[M＋H]+準(zhǔn)分子離子，同時(shí)可以觀察到[M＋Na]+的準(zhǔn)分子離子286.176 8。二級(jí)質(zhì)譜給出/246.180 6為脫水后的碎片[M＋H－H2O]+，同時(shí)觀測(cè)到酰胺鍵斷裂脫去C4H9N片段后形成的碎片/175.113 0，以及進(jìn)一步脫去CO片段的碎片離子/147.118 1。同時(shí)結(jié)合參考文獻(xiàn)數(shù)據(jù)[21]，確定化合物P4為羥基-α-山椒素，具體裂解途徑如圖3所示。

圖2 人參皂苷Rg1裂解途徑

3.2 代謝產(chǎn)物的鑒定

在給予大建中湯的大鼠血清中檢測(cè)出17個(gè)代謝成分，以化合物M14、M17及羥基-α-山椒素氧化還原產(chǎn)物說明推測(cè)過程。

在正離子模式下，可以觀測(cè)到準(zhǔn)分子離子/488.248 2，對(duì)應(yīng)的元素組成為C23H38NO10[M＋NH4]+，同時(shí)可以觀察到準(zhǔn)分子離子/471.223 6，對(duì)應(yīng)的元素組成為C23H35O10[M＋H]+，由此可知M14的分子為C23H34O10。同時(shí)看到/295.189 3、/277.180 8、/195.573 6、/177.090 5、/137.060 5等碎片離子，其中/295.189 3為M14脫去葡萄糖醛酸（-C6H8O6，176）后所形成，與6-姜酚的準(zhǔn)分子離子一致；/277.180 8、/195.573 6、/177.090 5、/137.060 5也與6-姜酚的碎片離子完全吻合，由此推斷M14為6-姜酚葡萄糖醛酸結(jié)合物（圖4）。

圖3 羥基-α-山椒素的質(zhì)譜裂解途徑

在正離子模式下，可以觀測(cè)到準(zhǔn)分子離子/516.284 2，對(duì)應(yīng)的元素組成為C25H42NO10[M＋NH4]+，同時(shí)可以觀察到準(zhǔn)分子離子/521.234 7，對(duì)應(yīng)的元素組成為C25H38O10Na [M＋Na]+，由此可知M17的分子式為C25H38O10。同時(shí)可以看到/323.220 6、/305.210 0、/177.090 5、/137.060 5等碎片離子，其中/323.220 6為M17脫去葡萄糖醛酸（-C6H8O6，176）后所形成，與8-姜酚的加氫準(zhǔn)分子離子一致；/305.210 0、/177.090 5、/137.060 5也與8-姜酚的碎片離子完全吻合，由此推斷M17為8-姜酚葡萄糖醛酸結(jié)合物（圖5）。

羥基-α-山椒素主要可能代謝途徑為雙鍵環(huán)氧化及進(jìn)一步氧化還原形成鄰二醇結(jié)構(gòu)，由于羥基-α-山椒素含有多個(gè)雙鍵，所以可以形成多個(gè)環(huán)氧化位點(diǎn)，也與檢測(cè)到多個(gè)相對(duì)分子質(zhì)量相同的代謝物同分異構(gòu)體相吻合，具體可能代謝途徑見圖6。

圖4 6-姜酚葡萄糖醛酸結(jié)合物可能的質(zhì)譜裂解途徑

圖5 8-姜酚葡萄糖醛酸結(jié)合物可能的質(zhì)譜裂解途徑

3.3 大建中湯體外化學(xué)成分分析

3.3.1 糖類 在大建中湯中鑒定到的葡萄糖大多為二糖，該類成分主要來源于人參。如化合物1含有/341.112 5 [M－H]?、179.058 8 [M－H]?、 161.047 7 [M－H]?等片段，推測(cè)其通過糖苷鍵斷裂失去1分子糖，再通過脫去1分子水形成/161.047 7 [M－H]?片段，結(jié)合對(duì)照品及文獻(xiàn)報(bào)道[22]，確定化合物1為蔗糖，具體裂解途徑如圖7所示。

3.3.2 核苷類 該類成分主要來源于干姜，如化合物5具有/282.085 6 [M－H]?、/150.042 3 [M－H]?離子片段，初步判斷該化合物為脫去1分子核糖，形成/150.042 3 [M－H]?離子片段，最后結(jié)合對(duì)照品及參考文獻(xiàn)推斷該化合物為鳥苷[23]，其質(zhì)譜裂解途徑見圖8。

3.3.3 原花青素類 該類化合物主要的裂解途徑發(fā)生逆狄爾斯-阿爾德裂解（RAD），化合物8分子離子為/577.135 7 [M－H]?，裂解后得到碎片離子425.089 4 [M－H－C8H8O3]?，該離子片段進(jìn)一步脫水后得到碎片離子/407.077 5 [M－H－C8H8O3－H2O]?，同時(shí)也有直接脫去1分子兒茶素的碎片/289.072 2 [M－H－Cat]?，將該化合物與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)[24]比對(duì)，確定該化合物為原花青素B1，具體裂解途徑見圖9。

圖6 羥基-α-山椒素的可能代謝途徑

圖7 蔗糖的質(zhì)譜裂解途徑

圖8 鳥苷的質(zhì)譜裂解途徑

3.3.4 綠原酸類 該類化合物都是咖啡酸與奎寧酸的羥基以酯鍵連接，因此其質(zhì)譜裂解主要是以酯鍵斷裂為主，伴隨有脫水等次級(jí)裂解途徑?；衔?、10、12都產(chǎn)生相同的/191.055 6碎片（奎寧酸負(fù)離子），通過與對(duì)照品比對(duì)，結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道[25]確定該類化合物分別為新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸，具體裂解途徑見圖10。

3.3.5 黃酮苷類 該類成分主要來源于蜀椒。如化合物16給出離子碎片/609.147 6 [M－H]?，對(duì)分子離子進(jìn)行解析得到/463.091 1 [M－H]?、/300.029 2，初步判斷該化合物分別失去2分子糖基，形成明顯的黃酮苷元負(fù)離子，通過與參考文獻(xiàn)數(shù)據(jù)[26]及對(duì)照品比對(duì)，確定該類化合物為蘆丁，具體裂解途徑如圖11所示。化合物21給出/623.160 2 [M－H]?、/477.106 4 [M－H]?、/315.051 4 [M－H]?、/300.029 2 [M－H]?，可判斷該化合物分別失去2分子糖基，再脫去甲基自由基形成明顯的黃酮苷元負(fù)離子，通過文獻(xiàn)報(bào)道[27]及對(duì)照品比對(duì)，確定該類化合物為水仙苷，具體裂解途徑如圖12所示。

圖9 原花青素B1的質(zhì)譜裂解途徑

圖10 綠原酸類的質(zhì)譜裂解途徑

3.3.6 其他類成分 在其他類化學(xué)成分中包括氨基酸類等。氨基酸類成分的裂解規(guī)律較為簡(jiǎn)單，主要以丟失NH3為主要裂解途徑，化合物6的一級(jí)質(zhì)譜給出/164.075 0片段，二級(jí)質(zhì)譜中檢測(cè)到/147.048 4離子片段，由此推測(cè)該化合物失去1個(gè)NH3，結(jié)合文獻(xiàn)數(shù)據(jù)及對(duì)照品比對(duì)[6]，確定該化合物為苯丙氨酸，具體裂解途徑如圖13所示。

4 討論

本研究在優(yōu)化色譜條件時(shí)比較了不同流動(dòng)相，包括甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水，考察結(jié)果表明乙腈-0.1%甲酸水溶液色譜分離效果較好，因此本研究采用該條件作為流動(dòng)相。在血清樣品處理時(shí)考察了甲醇和乙腈沉淀蛋白法，甲醇沉淀法可降低基質(zhì)的干擾，提高儀器靈敏度，故使用甲醇沉淀法。質(zhì)譜條件考察時(shí)，在正、負(fù)離子模式下的質(zhì)譜響應(yīng)進(jìn)行考察，主要以正、負(fù)離子模式檢測(cè)下采集到的數(shù)據(jù)分別作為解析對(duì)象。

圖11 蘆丁的質(zhì)譜裂解途徑

圖12 水仙苷的質(zhì)譜裂解途徑

圖13 苯丙氨酸的質(zhì)譜裂解途徑

大建中湯由飴糖、蜀椒、干姜和人參組成，具有溫中補(bǔ)虛，降逆止痛之功效，具有抗胃腸腫瘤等藥理作用[28-29]。本研究采用UPLC-Q-TOF/MS技術(shù)對(duì)大建中湯入血成分及體外化學(xué)成分進(jìn)行分析，在給藥血清中檢測(cè)到22個(gè)入血成分，包括5個(gè)原型成分，17個(gè)代謝成分，體外醇溶液中鑒定得到41個(gè)化學(xué)成分。來自人參的人參皂苷Rg1具有抗氧化、抗腫瘤、抗心肌缺血、抗衰老等藥理作用[30]，人參皂苷Rb1在對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)以及抗腫瘤、抗肝臟熱缺血再灌注損傷、降血糖等方面均具有作用[31]，人參皂苷Re在保護(hù)心血管系統(tǒng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)、降血糖以及抗休克、抗血小板聚集、抗氧化、抗心律失常等方面具有明顯作用[32]，因此，人參皂苷類成分的生理活性可能是大建中湯發(fā)揮補(bǔ)虛功效原因之一。來自于蜀椒的入血成分主要為羥基-α-山椒素及羥基-β-山椒素，具有麻醉鎮(zhèn)痛、腸道保護(hù)、降血糖等藥理作用[33]，該類成分的生理活性可能是大建中湯發(fā)揮鎮(zhèn)痛功效的原因。在代謝產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)的羥基-α-山椒素氧化還原產(chǎn)物和6-姜酚葡萄糖醛酸結(jié)合物表明，羥基-α-山椒素和6-姜酚吸收入血后可能在體內(nèi)發(fā)生生物轉(zhuǎn)換，進(jìn)一步推測(cè)羥基-α-山椒素和6-姜酚代謝產(chǎn)物也可能是大建中湯的活性成分。因此，大建中湯中入血活性成分及代謝物可能是其發(fā)揮藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)。

本研究采用血清藥物化學(xué)結(jié)合UPLC-Q- TOF/MS技術(shù)鑒定大建中湯中入血成分及體外化學(xué)成分，該方法具有簡(jiǎn)單、快捷、高靈敏度、高分辨率分析特點(diǎn)，可用于復(fù)雜體系中化學(xué)成分快速識(shí)別與定性分析[34-35]，本研究初步分析得到原型成分和代謝產(chǎn)物可能是大建中湯潛在活性成分，可為大建中湯質(zhì)量控制研究提供依據(jù)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] 檉坤. 大建中湯提取劑應(yīng)用狀況與劑型的關(guān)系 [J]. 國(guó)外醫(yī)學(xué): 中醫(yī)中藥分冊(cè), 2004, 26(1): 32-33.

[2] 李天慶. 大建中湯對(duì)消化系統(tǒng)疾病的基礎(chǔ)與臨床研究進(jìn)展 [J]. 國(guó)外醫(yī)學(xué): 中醫(yī)中藥分冊(cè), 2000, 22(4): 222-223.

[3] 國(guó)家中醫(yī)藥管理局. 關(guān)于發(fā)布《古代經(jīng)典名方目錄(第一批)》的通知. [EB/OL]. http://kjs. satcm. gov. cn/ zhengcewenjian/ 2018-04-16/7017. html, 2018-04-16/ 2019-05-20.

[4] 李紅軍, 王增繪, 李文濤, 等. UPLC-Q-TOF/MS法分析款冬花蜜炙前后的化學(xué)成分變化 [J]. 中國(guó)藥房, 2015, 26(6): 792-794.

[5] 賈曉華, 王維, 高夢(mèng)園, 等. 基于UPLC-Q-TOF- MS/MS分析藜蘆中化學(xué)成分 [J]. 天津中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào), 2021, 40(1): 104-111.

[6] 張?chǎng)┫? 馮敏, 苗雨露, 等. 基于UPLC-Q-TOF- MS/MS技術(shù)的還貝止咳方化學(xué)成分分析 [J]. 中國(guó)中藥雜志, 2019, 44(14): 3022-3034.

[7] 屠亞茹, 歐陽慧子, 孫夢(mèng)杰, 等. UPLC-Q-TOF-MS/MS方法鑒定血必凈注射液中20種化學(xué)成分 [J]. 天津中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào), 2017, 36(3): 209-213.

[8] 孫崇魯, 吳浩, 樓天靈, 等. UPLC-Q-TOF-MS法分析三葉青地上部分化學(xué)成分 [J]. 中成藥, 2018, 40(6): 1424-1429.

[9] 羅媛, 王昌權(quán), 鞏仔鵬, 等. UPLC-Q-TOF-MS/MS分析苗藥云實(shí)皮的化學(xué)成分 [J]. 中國(guó)藥房, 2020, 31(20): 2481-2486.

[10] 肖觀林, 江潔怡, 李素梅, 等. 基于UPLC-Q-TOF- MS/MS技術(shù)的布渣葉化學(xué)成分分析 [J]. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志, 2021, 27(3): 138-148.

[11] 羅丹丹, 彭華勝, 張?jiān)? 等. 基于UPLC-Q-TOF-MS分析比較寬葉山蒿與艾的化學(xué)成分 [J]. 中國(guó)中藥雜志, 2020, 45(17): 4057-4064.

[12] 秦振嫻, 張瑜, 齊夢(mèng)蝶, 等. 中國(guó)沙棘和西藏沙棘葉中化學(xué)成分的UPLC/Q-TOF-MS快速分析 [J]. 中國(guó)中藥雜志, 2016, 41(8): 1461-1468.

[13] 王邱, 馮毅凡, 芮雯, 等. UPLC/Q-TOFMS對(duì)三七中皂苷類成分的快速化學(xué)表征 [J]. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā), 2014, 26(8): 1233-1239.

[14] 何家樂, 周思思, 馬增春, 等. 基于UPLC-Q-TOF/MS研究參附注射液的物質(zhì)基礎(chǔ) [J]. 中國(guó)藥理學(xué)通報(bào), 2014, 30(3): 429-433.

[15] 周思思, 馬增春, 梁乾德, 等. 基于UPLC-TOF-MS分析人參麥冬配伍后皂苷類成分的變化 [J]. 質(zhì)譜學(xué)報(bào), 2013, 34(2): 88-95.

[16] 許如玲, 范君婷, 董惠敏, 等. 經(jīng)典名方黃芪桂枝五物湯標(biāo)準(zhǔn)煎液化學(xué)成分的UPLC-Q-TOF-MS分析 [J]. 中國(guó)中藥雜志, 2020, 45(23): 5614-5630.

[17] 司昕蕾, 邊甜甜, 牛江濤, 等. 花椒不同提取方法傳導(dǎo)麻醉作用及成分鑒定 [J]. 中華中醫(yī)藥雜志, 2020, 35(5): 2311-2315.

[18] 劉靜, 陳鵬, 陳林偉, 等. 參芪歸芍湯化學(xué)成分的UPLC-Q-TOF/MS分析 [J]. 藥物分析雜志, 2016, 36(9): 1578-1584.

[19] 趙靜, 秦振嫻, 彭冰, 等. 基于UPLC-Q-TOF MS技術(shù)的三七中皂苷類成分質(zhì)譜裂解規(guī)律研究 [J]. 質(zhì)譜學(xué)報(bào), 2017, 38(1): 97-108.

[20] 史大臻, 賴思含, 劉俊彤, 等. UPLC-Q/TOF-MS結(jié)合UNIFI庫快速分析西洋參莖葉三醇皂苷 [J]. 特產(chǎn)研究, 2021, 43(4): 72-81.

[21] 張萌萌, 王丹, 魏大能, 等. 基于血清藥物化學(xué)的花椒溫中止痛的質(zhì)量標(biāo)志物研究 [J]. 中草藥, 2022, 53(9): 2731-2739.

[22] 樊曉荃, 付娟, 胡軍華, 等. UPLC-Q-TOF- MS/MS快速分析六味地黃苷糖片化學(xué)成分[J]. 中草藥, 2021, 52(21): 6473-6484.

[23] 何穎, 涂正偉, 鄒愛英, 等. HPLC-QTOF/MS法鑒定甘草瀉心湯中化學(xué)成分 [J]. 現(xiàn)代藥物與臨床, 2021, 36(11): 2246-2254.

[24] 劉超, 郝慶秀, 金艷, 等. 基于UPLC-Q-TOF-MS比較雷公藤與昆明山海棠葉片的代謝產(chǎn)物差異 [J]. 中國(guó)中藥雜志, 2015, 40(9): 1710-1717.

[25] 高天元, 雷雨恬, 唐國(guó)琳, 等. 藥用雞矢藤藥材化學(xué)成分的UPLC-Q-TOF-MS分析 [J]. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志, 2020, 26(17): 134-141.

[26] 王元成, 韓彬, 李振堅(jiān), 等. 基于UPLC-Q-TOF-MS的腫節(jié)石斛化學(xué)成分研究 [J]. 中國(guó)藥學(xué)雜志, 2021, 56(9): 708-714.

[27] 朱建平, 陳俁禎, 高萌萌, 等. 基于UPLC-Q-TOF/MS法對(duì)鮮、干百合地黃湯化學(xué)成分的比較研究 [J]. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào), 2021, 41(11): 1698-1704.

[28] Lo S S, Chen J H, Wu C W,. Functional polymorphism of NFKB1promoter may correlate to the susceptibility of gastric cancer in aged patients [J]., 2009, 145(3): 280-285.

[29] Ahn K S, Aggarwal B B. Transcription factor NF-kappaB: A sensor for smoke and stress signals [J]., 2005, 1056: 218-233.

[30] 王浩, 鄒茜. 人參皂苷Rg1調(diào)節(jié)沉默信息調(diào)節(jié)因子1對(duì)抗晶狀體上皮細(xì)胞衰老的影響[J]. 世界中醫(yī)藥, 2021, 16(7): 1095-1098.

[31] 楊秋婭, 李曉宇, 劉皋林. 人參皂苷Rb1的藥理作用研究進(jìn)展 [J]. 中國(guó)藥學(xué)雜志, 2013, 48(15): 1233-1237.

[32] 韋豪華, 張紅玲, 李興太. 人參皂苷Re的藥理作用研究進(jìn)展 [J]. 大連民族大學(xué)學(xué)報(bào), 2018, 20(1): 21-26.

[33] 李焰梅, 郝丹, 蔣獻(xiàn). 山椒素藥理學(xué)研究進(jìn)展 [J]. 中國(guó)藥理學(xué)通報(bào), 2019, 35(2): 172-175.

[34] 時(shí)正媛, 李京峰, 寶麗, 等. 金芪降糖片治療2型糖尿病大鼠的血清代謝組學(xué)研究[J]. 世界中醫(yī)藥, 2022, 2022, 17(8): 1081-1085.

[35] 劉偉, 葛廣波, 王永麗, 等. 基于UHPLC-Q-Orbitrap HRMS技術(shù)研究清肺排毒湯化學(xué)成分及小鼠組織分布 [J]. 中草藥, 2020, 51(8): 2035-2045.

Serum pharmacochemistry study of Dajianzhong Decoction based on UPLC-Q-TOF/MS

JIANG Miao, PENG Wei, WU Chun-jie, WANG Jia-kui

Key Laboratory of Standardization of Chinese Herbal Medicine, Ministry of Education, State Key Laboratory of Southwestern Characteristic Chinese Medicine Resources, School of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 611137, China

To analyze the blood components andchemical components of Dajianzhong Decoction (大建中湯) by serum pharmacochemistry method.UPLC-Q-TOF/MS technology was used to rapidly identify the prototype components, metabolic components andchemical components absorbed into the blood of Dajianzhong Decoction after oral administration to rats. Combined with UNIFI software, the molecular weight of mass spectrometry, mass spectrometry fragmentation rules, literature reports and other methods were used to analyze the mass spectrometry fragmentation information to characterize the blood components andchemical components of Dajianzhong Decoction.A total of 22 blood components were identified in the administered plasma, including five prototype components and 17 metabolites, and 41 chemical components were identified byanalysis.UPLC-Q-TOF/MS technology can realize the rapid identification of chemical components in Dajianzhong Decoctionand, and the prototype components and metabolites identified in serums may be the potential active components of Dajianzhong Decoction, which can be used for quality control studies.

Dajianzhong Decoction; serum pharmacochemistry; UPLC-Q-TOF/MS; prototype components; metabolites; ginsenoside Rg1; hydroxy-α-sanshool

R284.1

A

0253 - 2670(2023)16 - 5154 - 11

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.16.004

2023-02-18

四川省中醫(yī)藥管理局2020年度花椒藥用價(jià)值研發(fā)專項(xiàng)（2020HJZX001）；成都市知識(shí)產(chǎn)權(quán)局專項(xiàng)（202000092）

蔣 淼（1982—），博士，講師，主要從事中藥基礎(chǔ)理論及應(yīng)用研究。E-mail: jiangmiaocc@163.com

吳純潔（1965—），教授，博士生導(dǎo)師，主要從事中藥炮制與制劑方面的研究。E-mail: wucjcdtcm@163.com

王家葵（1966—），博士，教授，主要從事本草文獻(xiàn)考證及藥理學(xué)方面的研究。E-mail: wjkms@163.com

[責(zé)任編輯 王文倩]