裸花紫珠醋酸乙酯部位化學成分及抗炎活性研究

楊國棟，劉昱甫，劉永林，馬 瑜，李詒光, 2，陳 杰

裸花紫珠醋酸乙酯部位化學成分及抗炎活性研究

楊國棟1，劉昱甫1，劉永林1，馬 瑜1，李詒光1, 2*，陳 杰1*

1. 江西中醫(yī)藥大學，江西 南昌 330004 2. 江中藥業(yè)股份有限公司，江西 南昌 330004

研究裸花紫珠葉的化學成分，并對分離的化合物進行初步的抗炎篩選。采用各種色譜方法（硅膠、MCI、羥丙基葡聚糖凝膠、ODS）進行分離純化，并結(jié)合核磁、質(zhì)譜數(shù)據(jù)明確其結(jié)構(gòu)。通過Griess法對分離得到的化合物進行初步的抗炎活性篩選。從裸花紫珠葉中醋酸乙酯部位分離得到17個單體化合物，分別鑒定為(6,7)-3-oxo-megastigma-4,8-dien-7βglucoside（1）、phoebenoside A（2）、(6,9)-3-oxo-α-ionol-9βglucopyranoside（3）、blumenol C glucoside（4）、異毛蕊花糖苷（5）、myricoside（6）、肉蓯蓉苷D（7）、地黃苷（8）、木通苯乙醇苷B（9）、4,4-dimethoxy-3-hydroxy-7,9:7,9-diepoxylignan-3βglucopyranoside（10）、木犀草素-7葡萄糖苷（11）、木犀草素- 7β葡萄糖苷（12）、木犀草素-4′β葡萄糖苷（13）、大波斯菊苷（14）、luteolin-7β--rhamnopyranosyl (1→2)-βglucopyranoside（15）、芹菜素-7β新橙皮苷（16）、2butyl-1(2′-ethylhexyl) benzene-1,8-dicarboxylate（17）。化合物7、14對NO生成抑制率達到45%以上?；衔?～4、9～11、17為首次從該屬植物中分離獲得。其中化合物7和14能顯著抑制NO的產(chǎn)生，具有良好的體外抗炎效果。

裸花紫珠；抗炎活性；苯乙醇苷；黃酮；肉蓯蓉苷D；大波斯菊苷

裸花紫珠Hook. Et Arn.為馬鞭草科（Verbenaceae）紫珠屬L.植物。目前，被收錄的紫珠屬植物共190余種，其中46種存在于中國，并廣泛分布于華南、華中、西南等地，植物資源豐富[1]。裸花紫珠的藥用部位為莖枝及葉，具有化瘀止血、抗菌解毒、消炎消腫、祛風除濕的作用。它還可以用來防御呼吸道和消化系統(tǒng)的出血、膿皰、急性病毒性肝炎、水火燙傷和金瘡出血等病癥[2]。研究表明裸花紫珠主要包括揮發(fā)油類、黃酮類、苯乙醇苷類和萜類成分[3]，具有消炎止血、殺菌、抗癌、抗阿爾茲海默癥、保護肝臟等藥理作用[4]。目前，裸花紫珠水提取物已開發(fā)成新藥，收載于《中國藥典》2020年版，其中供臨床應用的中成藥制劑有裸花紫珠片、裸花紫珠膠囊、裸花紫珠顆粒、裸花紫珠分散片等，主要用于治療細菌感染引起的炎癥、消化道和呼吸道出血、急性傳染性肝炎等癥。所以，為了更深入闡明裸花紫珠葉的化學成分，以豐富該植物的化學多樣性，本實驗對裸花紫珠干燥葉水提物的醋酸乙酯部位進行成分分離，最終獲得17個單體成分，通過氫譜、碳譜和質(zhì)譜等手段分別鑒定為(6,7)-3-oxo-megastigma- 4,8-dien-7βglucoside（1）、phoebenoside A（2）、(6,9)-3-oxo-α-ionol-9βglucopyranoside（3）、blumenol C glucoside（4）、異毛蕊花糖苷（isoacteoside，5）、myricoside（6）、肉蓯蓉苷D （cistanoside D，7）、地黃苷（martynoside，8）、calceolarioside B（9）、4,4-dimethoxy-3-hydroxy- 7,9:7,9-diepoxylignan-3βglucopyranoside（10）、luteolin-7glucuronide（11）、木犀草素-7β葡萄糖苷（luteolin-7βglucoside，12）、木犀草素-4′β葡萄糖苷（luteolin-4′βglucoside，13）、大波斯菊苷（apigenin-7-glucoside，14）、luteolin-7β--rhamnopyranosyl (1→2)-βglucopyranoside（15）、芹菜素-7β新橙皮苷（apigenin-7βneohesperidoside，16）、2butyl-1(2′-ethylhexyl)benzene-1,8-dicarboxylate（17）。其中，化合物1～4、9～11、17為首次從該屬植物中分離得到。初步研究了17個化合物的抗炎活性，可為裸花紫珠及其制劑質(zhì)量標準提升，民族藥用資源合理開發(fā)和利用提供依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 儀器與試劑

Bruker AM 600 MHz型核磁共振儀（德國Bruker公司）；德國IKA RV10 auto旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（德國IKA公司）；依利特P3500半制備液相色譜儀（中國依利特公司）；SCIEX Triple ESI 5600+型高分辨飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國SCIEX公司）；Sephadex LH-20（美國Pharmacia公司）；C18半制備型色譜柱（日本YMC公司）；MCI-凝膠（日本三菱化學公司）；柱色譜硅膠（青島海洋化工廠）；脂多糖、地塞米松（美國Sigma公司）；DMEM高糖培養(yǎng)基（中國Solarbio公司）；胎牛血清（美國Gibco公司）；NO和CCK-8試劑盒（上海碧云天生物科技有限公司）；所有試劑都是色譜純或分析純。

1.2 材料

小鼠小膠質(zhì)細胞BV2，購置于武漢大學中國典型培養(yǎng)物保藏中心；裸花紫珠藥材購自海南省白沙黎族自治縣細水鄉(xiāng)白水港村，經(jīng)江西中醫(yī)藥大學藥學院范崔生教授所鑒定為裸花紫珠Hook. et Arn.，標本（Y202101G）保存于江中藥業(yè)研發(fā)中心。

2 方法

2.1 提取與分離

裸花紫珠干燥葉3.0 kg，加水冷浸12 h，之后加熱煎煮3次（3、3、2 h），濾過合并藥液，將藥液濃縮成浸膏狀，之后加水溶解，通過醋酸乙酯萃取3次，減壓濃縮，獲浸膏314 g。再與硅膠混合后通過硅膠柱色譜開始粗分，首先用二氯甲烷-甲醇（500∶1～5∶1）進行梯度分離，薄層色譜引導合并，最后產(chǎn)生9個流分（Fr 1～9）。

Fr 6（30.14g）在MCI柱上分離，用甲醇-水溶劑體系（50%～90%）梯度分離后，點板歸并得到Fr 6-1～6-5。其中Fr 6-1（8.15 g）通過硅膠柱色譜，以二氯甲烷-甲醇（300∶1～5∶1）梯度獲取Fr 6-1-1～6-1-6共6個組分。Fr 6-1-3（1.04 g）使用ODS 柱色譜（甲醇-水）、半制備液相（甲醇-水，43∶57）獲得化合物8（0.8 mg，R＝29.5 min）和11（1.6 mg，R＝45.3 min）。Fr 6-1-4（0.95 g）再經(jīng)半制備HPLC（甲醇-水45∶55）得到化合物15（1.8 mg，R＝32.6 min）、16（2.3 mg，R＝35.7 min）。Fr 6-4（5.85 g）運用硅膠柱色譜純化，二氯甲烷-甲醇（430∶1～5∶1）梯度獲取Fr 6-4-1～6-4-6共6個組分，F(xiàn)r 6-4-1經(jīng)半制備液相（甲醇-水52∶48）分離得化合物1（3.6 mg，R＝24.9 min）。Fr 6-4-2采用半制備液相色譜（甲醇-水54∶46）獲得化合物4（3.8 mg，R＝20.4 min）和7（4.2 mg，R＝33.6 min）。

Fr 4（86.82 g）采用Sephadex LH-20柱色譜（甲醇）進一步分離，共得4個組分Fr 4-1～4-4。Fr 4-1（12.37 g）經(jīng)硅膠柱色譜，二氯甲烷-甲醇（40∶1～5∶1）梯度洗脫，得到化合物2（8 mg）和6（12 mg）。組分 Fr 4-2（9.12 g）以硅膠柱色譜純化，經(jīng)二氯甲烷-甲醇（30∶1～5∶1）分離后，再經(jīng)半制備液相色譜（甲醇-水53∶47）得到化合物3（2.2 mg，R＝25.4 min）和10（4.4 mg，R＝34.7 min）。組分Fr 4-3（6.16 mg）使用Sephadex LH-20柱色譜（甲醇）進一步分離，薄層色譜引導合并，純化Fr 4-3-1～4-3-5為5個部分。Fr 4-3-1（2.24 g）以硅膠為固定相，二氯甲烷-甲醇（20∶1～5∶1）梯度獲取化合物9（2.2 mg）和12（5.4 mg）。Fr 4-3-3（2.54 g）選取硅膠柱色譜純化，二氯甲烷-甲醇（20∶1～5∶1）分離為5個部分Fr 4-3-3-1～4-3-3-5，F(xiàn)r 4-3-3-1再用半制備液相色譜（甲醇-水42∶58）得到化合物13（1.6 mg，R＝31.9 min）和14（1.7 mg，R＝42.1 min）。Fr 4-3-3-3再經(jīng)半制備液相色譜（甲醇-水44∶56）得到化合物5（1.7 mg，R＝31.6 min）。

Fr 3（61.15 g）用MCI柱純化，選取甲醇-水（70∶30～100∶0）梯度分離后，薄層色譜引導合并，以硅膠為固定相，二氯甲烷-甲醇（30∶1～5∶1）繼續(xù)分離，再經(jīng)半制備液相色譜（甲醇-水48∶52）得到化合物17（1.3 mg，R＝32.6 min）。

2.2 體外抗炎活性評價

2.2.1 細胞的培養(yǎng)及毒性評價 BV2小膠質(zhì)細胞放置于培養(yǎng)箱中（37 ℃、5%CO2），以含有10% FBS的DMEM高糖培養(yǎng)液為生長液，當其生長密度至90%時進行傳代。采用CCK-8法測驗化合物對BV2細胞毒性的作用。然后于96孔板中接種處于對數(shù)生長期的BV2細胞，每孔細胞為9×103個，每孔100 μL，細胞貼壁后，分為空白組、地塞米松組、給藥組（25 μmol/L），每組3個平行，于上述條件下培養(yǎng)24 h。加入10% CCK-8培養(yǎng)基，在37 ℃下培養(yǎng)3.5 h。之后，在450 nm處測定吸光度（）值。

2.2.2 NO含量的測定 于96孔板接種BV2細胞，每孔細胞為9×103個。待細胞貼壁后，設定空白組、模型組、陽性藥物組和不同濃度給藥組，每組設置3個平行?？瞻捉M只更換培養(yǎng)液，陽性藥物組和目標藥物組在加入脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）前預處理3.5 h，然后和模型組同時加入脂多糖（終質(zhì)量濃度為1 μg/mL），培養(yǎng)24 h后，收集細胞培養(yǎng)液，嚴格按照NO評測試劑盒說明書進行測試。

3 結(jié)果與分析

3.1 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：無色油狀物，分子式C19H30O7；ESI-MS/: 393.2 [M＋Na]+。1H-NMR (600 MHz, CD3OD): 5.89 (1H, s, H-4), 5.79 (1H, dd,= 15.4, 6.5 Hz, H-8), 5.65 (1H, m, H-9), 4.41 (1H, t,= 7.8 Hz, H-1), 4.36 (1H, m, H-7), 3.67 (1H, dd,= 11.9, 5.4 Hz, H-6), 3.36 (1H, m, H-5), 3.29 (1H, m, H-4), 3.22 (1H, m, H-3), 3.18 (1H, m, H-2), 2.69 (1H, d,= 8.9 Hz, H-6), 2.44 (1H, d,= 16.8 Hz, H-2a), 2.06 (1H, d,= 16.8 Hz, H-2b), 1.95 (3H, s, H-11), 1.30 (3H, d,= 4.8 Hz, H-10), 1.04 (3H, s, H-13), 1.01 (3H, s, H-12)；13C-NMR (150 MHz, CD3OD): 37.1 (C-1), 48.3 (C-2), 202.1 (C-3), 126.1 (C-4), 165.9 (C-5), 56.8 (C-6), 77.0 (C-7), 138.2 (C-8), 128.8 (C-9), 21.0 (C-10), 23.8 (C-11), 28.0 (C-12), 27.6 (C-13), 102.5 (C-1), 75.3 (C-2), 78.0 (C-3), 71.5 (C-4), 78.1 (C-5), 62.7 (C-6)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道一致[5]，故鑒定化合物1為 (6,7)-3-oxo- megastigma-4,8-dien-7βglucoside。

化合物2：無定形粉末，分子式C19H32O7；ESI-MS/: 373.2 [M＋H]+。1H-NMR (600 MHz, CD3OD): 4.37 (1H, d,= 7.8 Hz, H-1), 3.92 (1H, m, H-9), 3.87 (1H, dd,= 5.0, 12.4 Hz, H-6a), 3.67 (1H, dd,= 12.4, 2.0 Hz, H-6b), 3.36 (1H, t,= 8.7 Hz, H-3), 3.34 (1H, m, H-4), 3.28 (1H, m, H-5), 3.19 (1H, dd,= 7.5, 8.9 Hz, H-2), 2.55 (1H, m, H-7), 2.45 (1H, m, H-3), 1.83 (1H, t,= 7.0 Hz, H-2), 1.77 (3H, s, H-13), 1.68 (1H, m, H-8), 1.31 (1H, d,= 6.3 Hz, H-10), 1.21 (3H, s, H-11), 1.21 (3H, s, H-12)；13C-NMR (150 MHz, CD3OD): 37.7 (C-1), 38.4 (C-2), 35.1 (C-3), 201.6 (C-4), 131.7 (C-5), 168.5 (C-6), 27.1 (C-7), 36.4 (C-8), 77.7 (C-9), 21.8 (C-10), 27.2 (C-11), 27.6 (C-12), 11.8 (C-13), 104.1 (C-1), 75.4 (C-2), 77.9 (C-3), 71.7 (C-4), 78.3 (C-5), 62.8 (C-6)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道一致[6]，故鑒定化合物2為phoebenoside A。

化合物3：白色粉末，分子式C19H30O7；ESI-MS/: 393.2 [M＋Na]+。1H-NMR (600 MHz, CD3OD): 5.89 (1H, brs, H-4), 5.79 (1H, dd,= 15.4, 6.5 Hz, H-8), 5.66 (1H, dd,= 15.4, 9.3 Hz, H-7), 4.41 (1H, m, H-9), 4.36 (1H, d,= 7.8 Hz, H-1), 3.83 (1H, dd,= 11.8, 2.4 Hz, H-6), 3.67 (1H, dd,= 11.8, 5.4 Hz, H-6), 3.37 (1H, m, H-3), 3.34 (1H, m, H-4), 3.30 (1H, d,= 9.2 Hz, H-2), 3.18 (1H, m, H-5), 2.69 (1H, d,= 9.3 Hz, H-6), 2.44 (1H, d,= 16.8 Hz, H-2a), 2.06 (1H, d,= 16.8 Hz, H-2b), 1.95 (3H, s, H-13), 1.30 (3H, d,= 6.4 Hz, H-10), 1.04 (3H, s , H-12), 1.02 (3H, s, H-11)；13C-NMR (150 MHz, CD3OD): 37.1 (C-1), 48.3 (C-2), 202.1 (C-3), 126.1 (C-4), 165.9 (C-5), 56.8 (C-6), 128.8 (C-7), 138.2 (C-8), 77.0 (C-9), 21.0 (C-10), 27.6 (C-11), 28.0 (C-12), 23.8 (C-13), 102.5 (C-1′), 75.3 (C-2′), 78.1 (C-3′), 71.5 (C-4′), 78.0 (C-5′), 62.7 (C-6′)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道一致[7]，故鑒定化合物3為(6,9)-3- oxo-α-ionol-9βglucopyranoside。

化合物4：紅棕色油狀液體，分子式C19H32O7；ESI-MS/: 395.2 [M＋Na]+。1H-NMR (600 MHz, CD3OD): 5.81 (1H, s, H-4), 4.33 (1H, d,= 7.8 Hz, H-1), 3.85 (1H, dd,= 11.8, 1.6 Hz, H-6a), 3.83 (1H, m, H-9), 3.66 (1H, dd,= 11.8, 5.1 Hz, H-6b), 2.50 (1H, d,= 17.4 Hz, H-2), 2.06 (3H, d,= 1.4 Hz, H-13), 2.00 (1H, m, H-6), 1.81 (1H, m, H-7), 1.70 (1H, m, H-8), 1.68 (1H, m, H-7), 1.62 (1H, m, H-8), 1.26 (3H, d,= 6.3 Hz, H-10), 1.11 (3H, s, H-12), 1.03 (3H, s, H-11)；13C-NMR (150 MHz, CD3OD):37.4 (C-1), 48.1 (C-2), 202.4 (C-3), 125.4 (C-4), 169.9 (C-5), 52.6 (C-6), 26.7 (C-7), 37.4 (C-8), 77.9 (C-9), 21.9 (C-10), 29.0 (C-11), 27.5 (C-12), 25.0 (C-13), 104.0 (C-1′), 75.3 (C-2′), 78.2 (C-3′), 71.7 (C-4′), 77.6 (C-5′), 62.8 (C-6′)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道一致[8]，故鑒定化合物4為blumenol C glucoside。

化合物5：白色粉末，分子式為C29H36O15；ESI-MS/: 647.2 [M＋Na]+。1H-NMR (600 MHz, CD3OD): 7.61 (1H, d,= 15.6 Hz, H-7′′′), 6.29 (1H, d,= 15.9 Hz, H-8′′′), 6.72 (1H, d,= 2.0 Hz, H-2), 6.69 (1H, d,= 8.0 Hz, H-5), 6.58 (1H, dd,= 2.1, 8.0 Hz, H-6), 2.81 (2H, m, H-7), 3.31～4.07 (2H, m, H-8), 4.40 (1H, d,= 7.9 Hz, H-1′), 5.21 (1H, s, H-1′′), 1.11 (3H, d,= 6.2 Hz, H-6′′), 7.07 (1H, d,= 2.1 Hz, H-2′′′), 6.80 (1H, d,= 8.2 Hz, H-5′′′), 6.97 (1H, dd,= 2.1, 8.2 Hz, H-6′′′)；13C-NMR (150 MHz, CD3OD): 131.5 (C-1), 117.1 (C-2), 146.8 (C-3), 146.1 (C-4), 116.5 (C-5), 121.3 (C-6), 72.3 (C-7), 36.6 (C-8), 104.2 (C-1′), 76.0 (C-2′), 81.6 (C-3′), 70.4 (C-4′), 76.2 (C-5′), 62.3 (C-6′), 103.0 (C-1′′), 72.3 (C-2′′), 72.0 (C-3′′), 74.0 (C-4′′), 70.6 (C-5′′), 18.5 (C-6′′), 127.7 (C-1′′′), 114.7 (C-2′′′), 146.8 (C-3′′′), 149.8 (C-4′′′), 116.5 (C-5′′′), 123.2 (C-6′′′), 115.2 (C-α), 144.7 (C-β), 168.3 (C=O)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道一致[9]，故鑒定化合物5為異毛蕊花糖苷。

化合物6：無定形粉末，分子式C34H44O19；ESI-MS/: 779.3 [M＋Na]+。1H-NMR (600 MHz, CD3OD): 6.71 (1H, d,= 2.1 Hz, H-2), 6.69 (1H, d,= 8.0 Hz, H-5), 6.57 (1H, dd,= 8.1, 2.1 Hz, H-6), 2.80 (2H, m, H-7), 4.07 (1H, m, H-8a), 3.74 (1H, m, H-8b)，4.39 (1H, d,= 7.9 Hz, H-1), 3.88 (1H, m, H-3), 4.94 (1H, t,= 9.6 Hz, H-4), 3.56 (1H, m, H-5), 3.63 (1H, s, H-6a), 3.42 (1H, m, H-6b)，5.29 (1H, d,= 1.8 Hz, H-1), 3.85 (1H, d,= 9.2 Hz, H-2), 3.68 (1H, dd,= 9.4, 3.3 Hz, H-3), 1.13 (3H, d,= 6.2 Hz, H-6)，5.22 (1H, d,= 2.7 Hz, H-1), 7.08 (1H, d,= 2.1 Hz, H-2), 6.82 (1H, d,= 8.2 Hz, H-5), 6.99 (1H, dd,= 8.2, 2.1 Hz, H-6), 7.60 (1H, d,= 15.9 Hz, H-7), 6.26 (1H, d,= 15.9 Hz, H-8)；13C-NMR (150 MHz, CD3OD): 131.5 (C-1), 116.2 (C-2), 146.1 (C-3), 144.6 (C-4), 117.0 (C-5), 121.2(C-6), 72.2 (C-α), 36.5 (C-β), 104.1 (C-1′), 75.9 (C-2′), 80.4 (C-3′), 70.3 (C-4′), 76.4 (C-5′), 62.2 (C-6′), 102.1 (C-1′′), 72.4 (C-2′′), 80.1 (C-3′′), 72.5 (C-4′′), 68.8 (C-5′′), 18.7 (C-6′′), 111.4 (C-1′′′), 78.5 (C-2′′′), 80.0 (C-3′′′), 74.8 (C-4′′′), 65.7 (C-5′′′), 127.6 (C-1′′′′), 115.2 (C-2′′′′), 146.9 (C-3′′′′), 149.9 (C-4′′′′), 116.6 (C-5′′′′), 123.3 (C-6′′′′), 114.6 (C-α), 148.0 (C-β), 168.2 (C=O)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道一致[10]，故鑒定化合物6為myricoside。

化合物7：白色粉末；分子式C31H40O15；ESI-MS/: 675.2 [M＋Na]+。1H-NMR (600 MHz, CD3OD): 6.82 (1H, d,= 2.4 Hz, H-2), 6.74 (1H, d,= 8.1 Hz, H-5), 6.69 (1H, dd,= 8.2, 2.1 Hz, H-6), 2.83 (2H, m, H-7), 4.07 (1H, t,= 9.7 Hz, H-8a), 3.85 (1H, m, H-8b), 3.82 (3H, s, OCH3)，4.39 (1H, d,= 7.9 Hz, H-1), 4.93 (1H, t,= 9.3 Hz, H-4), 5.21 (1H, s, H-1), 1.11 (3H, d,= 6.2 Hz, H-6), 7.20 (1H, d,= 1.9 Hz, H-2), 6.83 (1H, d,= 7.8 Hz, H-5), 7.09 (1H, dd,= 8.2, 2.0 Hz, H-6), 7.67 (1H, d,= 15.9 Hz, H-7), 6.38 (1H, d,= 15.9 Hz, H-8), 3.89 (3H, s, OCH3)；13C-NMR (150 MHz, CD3OD): 132.9 (C-1), 112.8 (C-2), 147.9 (C-3), 147.5 (C-4), 117.1 (C-5), 121.1 (C-6), 36.5 (C-7), 72.3 (C-8), 56.4 (3-OCH3), 104.2 (C-1′), 76.0 (C-2′), 81.5 (C-3′), 70.4 (C-4′), 76.0 (C-5′), 62.4 (C-6′), 103.0 (C-1′′), 72.1 (C-2′′), 72.3 (C-3′′), 73.8 (C-4′′), 70.6 (C-5′′), 18.4 (C-6′′), 127.6 (C-1′′′), 111.8 (C-2′′′), 147.4 (C-3′′′), 149.4 (C-4′′′), 116.5 (C-5′′′), 124.4 (C-6′′′), 149.4 (C-7′′′), 115.1 (C-8′′′), 168.3 (C-9′′′), 56.5 (3′-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道一致[11]，故鑒定化合物7為肉蓯蓉苷 D。

化合物8：棕黃色油狀物；分子式C31H40O15；ESI-MS/: 675.2 [M＋Na]+。1H-NMR (600 MHz, CD3OD): 7.67 (1H, d,= 15.9 Hz, H-7), 6.38 (1H, d,= 15.9 Hz, H-8), 7.21 (1H, d,= 2.0 Hz, H-2), 7.09 (1H, dd,= 8.2, 2.0 Hz, H-6), 6.82 (2H, dd,= 8.2, 10.0 Hz, H-5, 5), 6.75 (1H, d,= 2.1 Hz, H-2), 6.70 (1H, dd,= 8.2, 2.2 Hz, H-6), 3.90 (3H, s, OCH3), 2.83 (2H, m, H-7), 4.39 (1H, d,= 7.9 Hz, H-1), 4.93 (1H, t,= 9.4 Hz, H-4), 5.21 (1H, s, H-1), 1.11 (3H, d,= 6.2 Hz, H-6), 3.82 (3H, s, OCH3)；13C-NMR (150 MHz, CD3OD): 132.9 (C-1), 112.8 (C-2), 147.6 (C-3), 147.4 (C-4), 117.1 (C-5), 121.1 (C-6), 72.1 (C-7), 36.6 (C-8), 56.5 (4-OCH3), 104.2 (C-1), 76.2 (C-2), 81.5 (C-3), 70.6 (C-4), 76.1 (C-5), 62.4 (C-6), 103.0 (C-1), 72.4 (C-2), 72.1 (C-3), 73.8 (C-4), 70.4 (C-5), 18.4 (C-6), 127.5 (C-1), 111.7 (C-2), 149.5 (C-3), 151.1 (C-4), 116.5 (C-5), 124.4 (C-6), 147.9 (C-7), 115.0 (C-8), 168.3 (C-9), 56.4 (4-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道一致[12]，故鑒定化合物8為地黃苷。

化合物9：棕色油狀物；分子式C23H26O11；ESI-MS/: 501.1 [M＋Na]+。1H-NMR (600 MHz , CD3OD): 6.68 (1H, d,= 2.3 Hz, H-2), 6.64 (1H, d,= 8.0 Hz, H-5), 6.55 (1H, dd,= 8.1, 2.3 Hz, H-6), 2.79 (2H, m,= 7.6 Hz, H-7), 3.97 (1H, m, H-8a), 3.72 (1H, m, H-8b), 4.33 (1H, d,= 7.9 Hz, H-1), 3.23 (1H, m, H-2), 3.40 (1H, m, H-3), 3.37(1H, m, H-4), 3.52 (1H, m, H-5), 4.51 (1H, m, H-6a), 4.34 (1H, m, H-6b), 7.04 (1H, d,= 2.3 Hz, H-2), 6.90 (1H, dd,= 8.3, 2.3 Hz, H-6), 6.78 (1H, d,= 8.2 Hz, H-5), 7.57 (1H, d,= 15.8 Hz, H-7), 6.30 (1H, d,= 15.9 Hz, H-8)；13C-NMR (150 MHz, CD3OD): 131.4 (C-1), 116.5 (C-2), 146.8 (C-3), 146.1 (C-4), 116.3 (C-5), 121.2 (C-6), 72.4 (C-α), 36.7 (C-β), 104.6 (C-1), 75.1 (C-2), 77.9 (C-3), 71.7 (C-4), 75.5 (C-5), 64.6 (C-6), 127.7 (C-1″), 114.8 (C-2″), 147.2 (C-3″), 149.6 (C-4″), 117.1 (C-5″), 123.2 (C-6″), 144.7 (C-7″), 115.0 (C-8″), 169.2 (C-9″)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道一致[13]，故鑒定化合物9為calceolarioside B。

化合物10：白色粉末，分子式C26H32O11；ESI-MS/: 543.2 [M＋Na]+。1H-NMR (600 MHz, CD3OD): 7.15 (1H, d,= 8.3 Hz, H-5), 7.04 (1H, d,= 2.0 Hz, H-2), 6.95 (1H, d,= 1.9 Hz, H-2′), 6.93 (1H, dd,= 8.4, 2.0 Hz, H-6), 6.82 (1H, dd,= 8.4, 2.0 Hz, H-6′), 6.77 (1H, d,= 8.1 Hz, H-5′), 4.72 (1H, d,= 6.1 Hz, H-1″), 4.24～4.28 (2H, m, H-9, 9′), 3.88 (3H, s, OCH3), 3.86 (1H, s, OCH3), 3.85 (1H, s), 3.69 (2H, m, H-9′), 3.49 (1H, m, H-6″a), 3.47 (1H, m, H-6″b), 3.39～3.40 (4H, m, H-2″～5″), 3.14 (2H, m, H-8, H-8′)；13C-NMR (150 MHz, CD3OD): 137.5 (C-1), 111.6 (C-2), 147.5(C-3), 151.0 (C-4), 118.0 (C-5), 119.8 (C-6), 87.1 (C-7), 55.5 (C-8), 72.7 (C-9), 133.7 (C-1′), 111.0 (C-2′), 147.4 (C-3′), 149.1 (C-4′), 116.1 (C-5′), 120.1 (C-6′), 87.5 (C-7′), 55.4 (C-8′), 72.7 (C-9′), 56.4 (4-OCH3), 56.7 (4-OCH3), 102.9 (C-1″), 74.9 (C-2″), 77.8 (C-3″), 71.3 (C-4″), 78.2 (C-5″), 62.5 (C-6″)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道一致[14]，故鑒定化合物10為4,4-dimethoxy-3-hydroxy- 7,9:7,9-diepoxylignan-3βglucopyranoside。

化合物11：淡黃色粉末，分子式C21H18O12；ESI-MS/: 462.1 [M－H]?。1H-NMR (600 MHz, CD3OD): 7.45 (1H, dd,= 8.4, 2.1 Hz, H-6′), 7.43 (1H, d,= 2.1 Hz, H-2′), 6.94 (1H, d,= 8.4 Hz, H-5′), 6.79 (1H, d,= 2.2 Hz, H-8), 6.64 (1H, s, H-3), 6.51 (1H, d,= 2.2 Hz, H-6), 5.21 (1H, d,= 7.9 Hz, H-1″), 3.56～4.19 (4H, m, H-2″～5″)；13C-NMR (150 MHz, CD3OD): 166.9 (C-2), 104.2 (C-3), 184.1 (C-4), 163.0 (C-5), 101.4 (C-6), 164.4 (C-7), 96.0 (C-8), 158.9 (C-9), 107.3 (C-10), 123.5 (C-1′), 114.3 (C-2′), 147.1 (C-3′), 151.2 (C-4′), 116.8 (C-5′), 120.5 (C-6′), 101.0 (C-1″), 74.4 (C-2″), 77.0 (C-3″), 72.8 (C-4″), 76.7 (C-5″), 170.8 (C-6″)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道一致[15]，故鑒定化合物11為luteolin-7glucuronide。

化合物12：淡黃色粉末，分子式C21H20O11；ESI-MS/: 449.1 [M＋H]+。1H-NMR (600 MHz, CD3OD): 12.99 (1H, s, 5-OH), 7.47 (1H, dd,= 8.5, 2.3 Hz, H-6), 7.45 (1H, d,= 2.3 Hz, H-2), 7.33 (1H, d,= 8.5 Hz, H-5), 6.62 (1H, s, H-3), 6.46 (1H, d,= 2.1 Hz, H-8), 6.22 (1H, d,= 2.1 Hz, H-6), 4.95 (1H, d,= 7.6 Hz, H-1″), 3.93～3.44 (6H, m, sugar-H)；13C-NMR (150 MHz, CD3OD): 165.5 (C-2), 103.2 (C-3), 183.8 (C-4), 159.5 (C-5), 100.3 (C-6), 166.3 (C-7), 95.1 (C-8), 163.3 (C-9), 105.4 (C-10), 119.8 (C-1), 114.9 (C-2), 148.7 (C-3), 150.0 (C-4), 118.0 (C-5), 127.3 (C-6), 105.1 (C-1″), 71.3 (C-2″), 74.8 (C-3″), 78.5 (C-4″), 77.5 (C-5″), 62.4 (C-6″)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道一致[16]，故鑒定化合物12為木犀草素-7β葡萄糖苷。

化合物13：淡黃色粉末，分子式C21H20O11；ESI-MS/: 449.1 [M＋H]+。1H-NMR (600 MHz, CD3OD): 12.92 (1H, s, 5-OH), 7.47 (1H, d,= 8.5 Hz, H-6), 7.45 (1H, s, H-2), 7.33 (1H, d,= 8.5 Hz, H-5), 6.62 (1H, s, H-3), 6.46 (1H, d,= 2.1 Hz, H-8), 6.22 (1H, d,= 2.1 Hz, H-6), 4.95 (1H, d,= 7.6 Hz, H-1″), 3.93～3.44 (6H, m, H-2″～6″)；13C-NMR (150 MHz, CD3OD): 166.3 (C-2), 105.1 (C-3), 183.8 (C-4), 163.3 (C-5), 100.3 (C-6), 165.5 (C-7), 95.1 (C-8), 159.5 (C-9), 105.4 (C-10), 127.3 (C-1), 114.9 (C-2), 148.7 (C-3), 150.0 (C-4), 118.0 (C-5), 119.8 (C-6), 103.2 (C-1″), 74.8 (C-2″), 78.5 (C-3″), 71.3 (C-4″), 77.5 (C-5″), 62.4 (C-6″)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道一致[17]，故鑒定該化合物13為木犀草素-4β葡萄糖苷。

化合物14：淡黃色粉末，分子式C21H20O10；ESI-MS/: 471.2 [M＋K]+。1H-NMR (600 MHz, CD3OD): 7.90 (2H, d,= 8.4 Hz, H-6, 2), 6.94 (2H, d,= 8.4 Hz, H-5, 3), 6.84 (1H, s, H-3), 6.67 (1H, s, H-8), 6.51 (1H, d,= 2.0 Hz, H-6), 5.08 (1H, d,= 6.3 Hz, H-1″)；13C-NMR (150 MHz, CD3OD): 166.8 (C-2), 104.1 (C-3), 184.1 (C-4), 159.0 (C-5), 101.2 (C-6), 164.8 (C-7), 96.1 (C-8), 162.9 (C-9), 107.1 (C-10 ), 123.0 (C-1), 129.7 (C-2, 6), 117.1 (C-3, 5), 163.2 (C-4), 101.6 (C-1″), 74.7 (C-2″), 77.9 (C-3″), 71.3 (C-4″), 78.4 (C-5″), 62.5 (C-6″)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道一致[18]，故鑒定化合物14為大波斯菊苷。

化合物15：淡黃色粉末，分子式C27H30O15；ESI-MS/: 593.2 [M－H]?。1H-NMR (600 MHz, CD3OD): 7.43 (1H, dd,= 8.3, 2.3 Hz, H-6), 7.41 (1H, d,= 2.3 Hz, H-2), 6.91 (1H, d,= 8.3 Hz, H-5), 6.77 (1H, d,= 2.2 Hz, H-8), 6.61 (1H, s, H-3), 6.47 (1H, d,= 2.2 Hz, H-6), 5.30 (1H d,= 1.8 Hz, H-1′′′), 5.21 (1H, d,= 7.7 Hz, H-1"), 1.34 (3H, d,= 6.2 Hz, H-6′′′)；13C-NMR (150 MHz, CD3OD): 166.9 (C-2), 104.2 (C-3), 184.0 (C-4), 163.0 (C-5), 100.9 (C-6), 164.4 (C-7), 95.9 (C-8), 159.1 (C-9), 107.1 (C-10), 123.5 (C-1′), 114.3 (C-2′), 147.1 (C-3′), 151.3 (C-4′), 116.8 (C-5′), 120.5 (C-6′), 99.8 (C-1″), 78.3 (C-2″), 79.0 (C-3″), 71.4 (C-4″), 79.1 (C-5″), 62.4 (C-6″), 102.6 (C-1′′′), 72.2 (C-2′′′), 72.2 (C-3′′′), 74.0 (C-4′′′), 70.0 (C-5′′′), 18.3 (C-6′′′)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道一致[19]，故鑒定化合物15為luteolin-7β--rhamnopyranosyl(1→2)-βglucopyranoside。

化合物16：黃色粉末，分子式C27H31O14；ESI-MS/: 577.2 [M－H]?。1H-NMR (600 MHz, CD3OD): 7.78 (2H, d,= 9.0 Hz, H-2′, 6′), 6.94 (2H, m, H-3′, 5′), 6.79 (1H, d,= 2.2 Hz, H-8), 6.66 (1H, s, H-3), 6.46 (1H, d,= 2.2 Hz, H-6), 5.30 (1H, d,= 1.8 Hz, H-1?), 5.21 (1H, d,= 7.6 Hz, H-1″), 1.34 (3H, d,= 6.2 Hz, H-6?)；13C-NMR (150 MHz, CD3OD): 164.4 (C-2), 104.1 (C-3), 184.0 (C-4), 163.0 (C-5), 102.5 (C-6), 166.8 (C-7), 95.9 (C-8), 159.0 (C-9), 107.0 (C-10), 123.0 (C-1′), 129.6 (C-2′, 6′), 117.1 (C-3′, 5′), 162.9 (C-4′), 99.8 (C-1″), 79.1 (C-2″), 79.0 (C-3″), 71.4 (C-4″), 78.3 (C-5″), 62.4 (C-6″), 101.0 (C-1?), 72.2 (C-2?), 72.2 (C-3?), 74.0 (C-4?), 70.0 (C-5?), 18.3 (C-6?)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道基本一致[20]，故鑒定化合物16為芹菜素-7β新橙皮苷。

化合物17：黃色粉末，分子式C20H30O4；ESI-MS/: 335.2 [M＋H]+。1H-NMR (600 MHz, CD3OD): 7.73 (2H, dd,= 5.7, 3.3 Hz, H-3, 6), 7.63 (2H, dd,= 5.8, 3.3 Hz, H-4, 5), 4.30 (4H, m, H-1), 4.23 (2H, m, H-1), 1.72 (3H, m, H-2, 2), 1.45 (4H, m, H-3, a), 1.36 (6H, m, H-3～5), 0.95 (9H, m, 3×CH3, H-4, 6, b)；13C-NMR (150 MHz, CD3OD): 130.6 (C-1, 2), 129.9 (C-3, 6), 133.6 (C-4), 132.4 (C-5), 66.7 (C-1), 31.7 (C-2), 20.3 (C-3), 14.4 (C-4, 6), 169.3 (CO), 69.1 (C-1), 40.2 (C-2), 31.6 (C-3), 30.1 (C-4), 24.0 (C-5), 25.0 (C-a), 11.4 (C-b)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道基本一致[21]，故鑒定化合物17為2butyl-1(2-ethylhexyl) benzene-1,8-dicarboxylate。

3.2 抗炎活性測試

近年來，治療炎癥性疾病藥物的需求在不斷上升，抗炎方面的生物活性成為國內(nèi)外研究的熱點。巨噬細胞在炎癥的產(chǎn)生當中具有重要影響，其受到外源體等刺激后會產(chǎn)生一定的促炎因子和抗炎因子，在機體的炎癥反應當中扮演著重要角色，因此為了緩解炎癥可以通過抑制炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生以及相關的信號通路的激活[22]。NO是一種值得注意的炎癥介質(zhì)，具有神經(jīng)毒性，其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中過量表達會激活小膠質(zhì)細胞并引起炎癥反應[23]。NO與多種炎癥疾病的產(chǎn)生緊密相關，普遍認為是炎癥產(chǎn)生的標志。本課題組通過評估所分離的化合物對LPS刺激BV2細胞分泌炎癥介質(zhì)NO的影響，進行抗炎活性初篩。首先，采用CCK-8法測定化合物是否具有細胞毒性，以確保后續(xù)實驗在無毒條件下進行。實驗結(jié)果表明，當化合物濃度為25 μmol/L時，所有化合物對BV2細胞存活率均高于85%。之后采用Griess法對化合物1～17對LPS誘導BV2細胞產(chǎn)生NO的抑制作用進行了進一步的測試，結(jié)果見表1，化合物7和14能顯著抑制NO的產(chǎn)生。

表1 化合物1～17對LPS誘導的BV2細胞產(chǎn)生NO的抑制效果

Table 1 Inhibitory effect of compounds 1—17 on NO production in LPS-induced BV2 microglial cells

化合物NO抑制率/%化合物NO抑制率/% 126.19±0.041036.78±0.06 227.28±0.021128.62±0.03 325.94±0.041219.00±0.06 426.55±0.081322.29±0.03 511.57±0.031445.19±0.03 625.09±0.061514.13±0.06 746.16±0.06168.77±0.02 832.03±0.071712.91±0.03 914.74±0.11地塞米松43.85±0.03

4 討論

近年來，裸花紫珠的研發(fā)工作日益拓展廣泛，涉及了藥材資源、化學物質(zhì)、生產(chǎn)工藝、藥理療效以及臨床使用價值等諸多方面。裸花紫珠相關產(chǎn)品的開發(fā)，其化學成分與藥理學的系統(tǒng)研究是基礎。本研究從裸花紫珠醋酸乙酯部位得到17個成分，當中包含了4個倍半萜類化合物，5個苯乙醇苷類化合物，6個黃酮類化合物，1個木脂素類化合物和1個其他類型化合物。其中，化合物1～4屬于倍半萜類，5～9為苯乙醇苷類，10為木脂素類化合物，11～16為黃酮類化合物，17為其他類型化合物?；衔?～4、9～11、17為首次從該屬中分離得到，抗炎活性結(jié)果證明化合物7和14對LPS誘導的小鼠小膠質(zhì)細胞BV2產(chǎn)生炎癥介質(zhì)NO具有良好抑制活性，優(yōu)于陽性對照地塞米松。

綜上所述，本實驗豐富了裸花紫珠葉化學成分和藥效作用的研究，實驗結(jié)果進一步考證了裸花紫珠葉的傳統(tǒng)功效用途，為進一步生物活性研究及質(zhì)控指標成分提供科學依據(jù)，并為該藥物在未來的開發(fā)使用過程中提供一定的理論支持。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Chemical constituents from ethyl acetate extract ofand its anti-inflammatory activity

YANG Guo-dong1, LIU Yu-fu1, LIU Yong-lin1, MA Yu1, LI Yi-guang1, 2, CHEN jie1

1. Jiangxi University of Chinese Medicine, Nanchang 330004, China 2. Jiangzhong Pharmaceutical Co., Ltd,Nanchang 330004, China

To study of the chemical composition of the ethyl acetate parts of, and preliminary screen out the isolated compounds with anti-inflammatory activities.Various chromatographic methods (silica gel, MCI, hydroxypropyl dextran gel, ODS) were used for the isolation and purification, and the structure was clarified by combination with NMR and MS data. The isolated compoundswere screened for preliminary anti-inflammatory activity by the Griess method.Seventeen monomeric compounds were isolated from, which were identified as (6,7)-3-oxo-megastigma- 4,8-dien-7βglucoside (1), phoebenoside A (2), (6,9)-3-oxo-α-ionol-9βglucopyranoside (3), blumenol C glucoside(4), isoacteoside (5), myricoside (6), cistanoside D (7), martynoside (8), calceolarioside B (9), 4,4-dimethoxy-3-hydroxy-7,9:7,9- diepoxylignan-3βglucopyranoside (10), luteolin-7glucuronide (11), luteolin-7βglucoside (12), luteolin-4′βglucoside (13), apigenin-7-glucoside (14), luteolin-7β--rhamnopyranosyl(1→2)-βglucopyranoside (15), apigenin-7βneohesperidoside (16), 2butyl-1(2′-ethylhexyl) benzene-1,8-dicarboxylate (17). Compounds 7 and 14 inhibited NO production by more than 45%.Compounds 1—4, 9—11 and 17 are the first isolated from this genus. Among them, compounds 7 and 14 significantly inhibited NO production and had goodanti-inflammatory effects.

Hook. Et Arn.; anti-inflammatory activity; phenylethanol glycoside; flavonoid; cistanoside D; apigenin- 7-glucoside

R284.1

A

0253 - 2670(2023)16 - 5146 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.16.003

2023-01-29

江西省重點研發(fā)計劃項目（20212BBG71007）

楊國棟（1996—），男，研究方向為中藥藥效物質(zhì)基礎。E-mail: yang2428844581@163.com

陳 杰，女，副教授，研究方向為中藥藥效物質(zhì)基礎。E-mail: 19960246@jxutcm.edu.cn

李詒光，男，博士，教授，研究方向為中藥質(zhì)量控制及產(chǎn)品開發(fā)。E-mail:lyg@crjz.com

[責任編輯 王文倩]