納米TiO2處理對(duì)山定子響應(yīng)重茬土壤脅迫的生理效應(yīng)研究

張悅　牛潔　王詩琦　劉興萍　王延秀

關(guān)鍵詞：山定子；TiO₂；重茬土壤；生理特性；主成分分析

中圖分類號(hào)：S661.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：2097-2172（2023）07-0654-08

糧食安全對(duì)農(nóng)業(yè)基礎(chǔ)地位的夯實(shí)具有重要意義，因土地資源有限及國(guó)家政策不允許占用耕地新建果園等因素的影響，為了舊果園迭代更新、提質(zhì)增效，必須重茬建園，即在老產(chǎn)區(qū)同一塊土地連續(xù)多年重茬種植同一種果樹。重茬建園易引發(fā)再植障礙，通常表現(xiàn)為生長(zhǎng)受到抑制、產(chǎn)量低甚至死亡，影響果園“整齊度”及經(jīng)濟(jì)效應(yīng)發(fā)揮。中國(guó)蘋果種植總面積達(dá)200萬hm²左右，總產(chǎn)量4200萬t，具有明顯的規(guī)?；a(chǎn)業(yè)優(yōu)勢(shì)。甘肅屬于西北黃土高原蘋果重點(diǎn)產(chǎn)區(qū)，是我國(guó)重要的蘋果優(yōu)勢(shì)產(chǎn)區(qū)，其氣候、土壤、環(huán)境等多項(xiàng)因素均與優(yōu)質(zhì)蘋果生產(chǎn)所需條件高度吻合，具有得天獨(dú)厚的區(qū)位優(yōu)勢(shì)。甘肅省目前初步形成了以靜寧、西峰、涇川為中心的隴東黃土高原區(qū)和以天水為中心的隴南淺山丘陵區(qū)兩大蘋果優(yōu)勢(shì)產(chǎn)區(qū)，全省蘋果種植面積為24.11萬hm²，總產(chǎn)量達(dá)340.47萬t，分別居全國(guó)第3位和第5位，蘋果已成為甘肅優(yōu)勢(shì)特色產(chǎn)業(yè)和農(nóng)民脫貧增收的主導(dǎo)產(chǎn)業(yè)。但目前甘肅省有16%以上的果園走向“老齡化”，重茬建園技術(shù)亟須解決。研究發(fā)現(xiàn)，施用適宜的外源納米材料可有效改善作物再植障礙問題，目前已在棉花、番茄、小麥等作物上得到驗(yàn)證。

納米材料是指在三維空間中至少有一維處于納米尺寸（0.1～100.0 nm）或由它們作為基本單元構(gòu)成的材料，且只有通過細(xì)胞壁和細(xì)胞膜才能被細(xì)胞吸收，從而對(duì)植株生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生一定影響。劉婭等在小麥中發(fā)現(xiàn)，納米TiO₂的施用有效緩解了Cd對(duì)小麥帶來的氧化脅迫，顯著提高了小麥生物量、根長(zhǎng)等。梁鵬鵬在紫甘藍(lán)中發(fā)現(xiàn)，納米Ti02對(duì)紫甘藍(lán)光合作用和葉綠素含量具有明顯的濃度效應(yīng)。鄭澤其等研究表明，納米TiO₂有望應(yīng)用于強(qiáng)化植物修復(fù)土壤Cd污染。張萍研究表明，納米TiO₂溶膠不僅對(duì)多種植物病害具有明顯的防治作用，同時(shí)可促進(jìn)植株生長(zhǎng)發(fā)育。此外有研究表明，納米TiO₂能夠增強(qiáng)玉米幼苗的抗氧化酶活性。然而納米TiO₂的研究大部分集中在蔬菜和其他作物上，而在木本植物特別是蘋果砧木上是否具有相似的生理響應(yīng)尚不清楚。

我們以一年生蘋果砧木山定子為試驗(yàn)材料，研究和分析不同濃度納米TiO₂對(duì)連作脅迫蘋果砧木山定子的影響，旨在探討外源TiO₂對(duì)重茬環(huán)境中山定子幼苗生理特性的響應(yīng)，以期為蘋果砧木生產(chǎn)實(shí)踐提供一定的理論指導(dǎo)。

1材料與方法

1.1材料與處理

試驗(yàn)選擇長(zhǎng)勢(shì)一致、生長(zhǎng)健壯的一年生蘋果砧木山定子，2021年5月中下旬將苗木定植于大小相同、裝有1962年國(guó)光蘋果園重茬土塑料花盆內(nèi)（11.2 cm×16.8 cm），每盆1株，并置于甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)避雨棚（360°10′N、103°34′E）進(jìn)行統(tǒng)一管理，定期澆水、除草。

試驗(yàn)共設(shè)5個(gè)處理，分別為重茬土壤不加TiO₂（CK）、重茬土壤+0.5 g/kg TiO₂（T1）、重茬土壤+ 1.0

g/kg TiO₂（T2）、重茬土壤+2.0 g/kg TiO₂（T3）、重茬土壤+4.0 g/kg TiO₂（T4），每處理3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)3盆。其中，納米TiO₂以拌入土壤的方式進(jìn)行施用，每盆土壤質(zhì)量為5.0 kg，按所設(shè)濃度拌人相應(yīng)質(zhì)量的納米TiO₂。2021年7月初，自施用納米TiO₂次日開始計(jì)算時(shí)間，于第0、10、20、30 d時(shí)選取生長(zhǎng)一致的中上部相同節(jié)位葉片保存于超低溫冰箱，進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)測(cè)定與分析。

1.2生理指標(biāo)的測(cè)定

1.2.1光合色素含量[葉綠素a（Chl a）、葉綠素b（Chl b）]的測(cè)定參考綜旭林等的測(cè)定方法。采集葉片，用蒸餾水洗凈其表面，剪碎，倒入80%丙酮，在黑暗條件下浸泡提取24 h，測(cè)定其663、646nm下的吸光度，代入公式計(jì)算Chl a、Chl b含量，兩者之和為Chl a+b，兩者之比為Chla/b，生物學(xué)重復(fù)3次。

1.2.2抗氧化酶[超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）]活性的測(cè)定參考買合木提·卡熱等的方法，生物學(xué)重復(fù)3次。

1.2.3相對(duì)電導(dǎo)率和脯氨酸的測(cè)定 相對(duì)電導(dǎo)率（REC）采用電導(dǎo)率儀型號(hào)（DDS-307）進(jìn)行測(cè)定；脯氨酸（Pro）含量參照Guo R等測(cè)定方法，生物學(xué)重復(fù)3次。

1.2.4丙二醛（MDA）含量測(cè)定 參考趙世杰等的測(cè)定方法，生物學(xué)重復(fù)3次。

1.3數(shù)據(jù)處理與分析

用Microsoft Office Excel 2019及Origin 2018進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及作圖，用IBM SPSS Statistics 26進(jìn)行相關(guān)性、主成分分析，分析采用單因素ANOVA的LSD法比較差異的顯著水平（a=0.05）。

2結(jié)果與分析

2.1納米Ti02對(duì)重茬條件下山定子葉片光合色素含量的影響

從圖1-A可以看出，隨脅迫時(shí)間延長(zhǎng)，除處理T3至20 d外，各處理Chl a含量呈下降趨勢(shì)。處理至10 d時(shí)，各處理的Chl a含量差異均不顯著，但處理組Chl a含量均高于CK。處理至20 d，各TiO₂處理下的Chl a含量均高于CK，分別為28.24 mg/g（Tl）、29.02 mg/g（T2）、29.55 mg/g（T3）、26.44 mg/g （T4），其中處理T2、處理T3均顯著高于CK，分別為CK（25.36 mg/g）的1.14、1.17倍。處理至30 d時(shí)，處理T2、處理T3的Chl a含量均顯著高于CK，而處理T1、處理T4均與CK差異不顯著。

由圖1-B可知，各處理的Chlb含量變化趨勢(shì)與Chla大體相同，脅迫期間Chlb含量隨時(shí)間延長(zhǎng)均呈下降趨勢(shì)。除處理T4在30d外，其余處理在各時(shí)間段的Chlb含量降幅均小于CK，且具有明顯濃度效應(yīng)。處理至30d時(shí)，各處理的Chlb含量均達(dá)到最低值，除處理T4低于CK外，其余TiO₂處理均高于CK，且處理T2、處理T3的Chlb含量均顯著高于CK，但降幅以處理T3最小，為10.17%。

圖1-C表明，各處理的Chl a+b含量變化趨勢(shì)與Chl a、Chl b含量趨勢(shì)變化一致。Chl a+b含量隨脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)不斷下降，處理至10、20、30d時(shí)，均隨TiO₂濃度增加，整體均呈先升后降的趨勢(shì)，且均以處理T3的Chl a+b含量最高，處理T2、處理T3的Chl a+b含量亦顯著高于CK。

從圖1-D可以看出，在重茬脅迫下，山定子葉片的Chl a／b變化幅度小。施加TiO₂后，隨脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，各處理Chl a/b變化規(guī)律不盡相同。Chl a/b在處理至10、20、30 d時(shí)，均以處理T4最高，分別為2.00、1.95、2.19，除在處理20d時(shí)與CK差異顯著，其余處理均與CK差異不顯著。

2.2納米TiO₂對(duì)重茬條件下山定子葉片抗氧化酶活性的影響

從圖2-A可以看出，隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)，處理Tl、T2、T3、T4山定子幼苗葉片SOD活性呈先升后降的趨勢(shì)。處理20 d時(shí)，各處理均達(dá)到峰值后不斷降低，但不同處理各時(shí)間段對(duì)SOD活性的升幅不同。處理至20 d時(shí)，處理T3的SOD活性最高（131.97 U/g），且顯著高于CK（85.70 U/g），是CK的1.54倍，其余處理也均顯著高于CK。

圖2-B表明，重茬條件下，隨脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，各處理下山定子葉片的POD活性和SOD活性的變化大致趨勢(shì)相同。試驗(yàn)處理10 d時(shí)，處理T2、T3、T4的POD活性均顯著高于CK。處理至20 d時(shí)，處理T3的POD酶活性達(dá)到峰值，為77.65 U/g，顯著高于CK（44.06 U/g），為CK的1.76倍。處理至30 d時(shí)，處理T1、T2、T3、T4的POD活性均下降，但各處理POD活性仍高于CK，分別為CK的1.48、1.88、2.17、1.87倍。

由圖2-C可知，重茬條件下，隨TiO₂處理時(shí)間的延長(zhǎng)，各處理的CAT活性整體呈先升后降的趨勢(shì)。試驗(yàn)處理至10d時(shí)，處理T4的CAT活性達(dá)到峰值，為4.872 U/（g.min），試驗(yàn)處理至20 d時(shí)，處理T1、T2、T3的CAT活性均達(dá)到最大，分別為5.265、5.848、6.621

U/（g·min）。處理至30 d時(shí)，處理T1、T2、T3的CAT活性均顯著高于CK，其中處理T3[5.973 U/（g·min）]增加幅度最大，為CK[4.163 U/（g·min）]的1.43倍。

2.3納米TiO₂對(duì)重茬條件下山定子葉片REC和Pro含量的影響

由圖3-A可知，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，各處理的REC均呈升高趨勢(shì)，但升幅不同。0d時(shí)，處理T1、T2、T3、T4與CK的REC無顯著差異；處理至10d時(shí)，處理T1、T2、T3、T4處理葉片REC升幅均低于CK （9.88%），分別為7.81%、6.72%、2.87%、5.90%；處理至30 d時(shí)，處理T1、T2、T3、T4葉片REC均顯著低于CK，與Od相比，處理T1、T2、T3、T4的REC分別提高了28.88%、25.77%、10.36%、20.39%，整體來看，處理T3葉片REC的增幅最小。

圖3-B表明，隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)，各處理葉片Pro含量整體大致呈先升后降的趨勢(shì)。脅迫至10 d時(shí)，各處理的Pro含量出現(xiàn)明顯的增加，隨Ti02濃度的增加，Pro含量整體上呈先升后降的趨勢(shì)；脅迫至20 d時(shí)，處理T1積累量最小，為32.41 mg/g;處理T2積累量最大，為35.27 mg/g。但與CK（24.37 mg/g）相比，處理T1的Pro含量提高了32.99%，處理T2的Pro含量提高了44.71%。

2.4納米TiO₂對(duì)重茬條件下山定子葉片MDA含量的影響

圖4表明，重茬條件下山定子葉片MDA含量隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)呈先上升后下降趨勢(shì)，隨著Ti02施用濃度的變化，MDA含量變幅有所不同。處理至30 d時(shí)，處理Tl、T2、T3、T4的葉片MDA含量與CK相比，以處理Tl變化幅度最小，MDA含量與CK差異不顯著。

2.5重茬條件下不同濃度納米TiO₂對(duì)山定子生理效應(yīng)的綜合評(píng)價(jià)分析

2.5.1相關(guān)性分析 使用SPSS軟件對(duì)重茬脅迫后的10個(gè)指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析，獲得相關(guān)系數(shù)矩陣（表1）。結(jié)果表明，砧木山定子葉片的Chl a與Chl b、POD、Pro呈顯著正相關(guān)（P<0.05），與Chla+b、SOD呈極顯著正相關(guān)（P<0.01），與Chl a/b、CAT、REC、MDA呈負(fù)相關(guān)，表明可以通過上述指標(biāo)等來評(píng)價(jià)納米Ti02對(duì)重茬脅迫下山定子的改善作用。

2.5.2主成分分析 為綜合評(píng)價(jià)重茬條件下不同濃度納米TiO₂對(duì)山定子的生理效應(yīng)特性研究，將納米TiO₂處理后的10個(gè)指標(biāo)（Chl a、Chl b、Chl a+b、Chl a/b、SOD、POD、CAT、REC、Pro、MDA）進(jìn)行主成分分析，提取到2個(gè)特征值大于1的主成分，其特征值分別為9.43，2.01（表2）。第一、二主成分方差貢獻(xiàn)率分別為83.18%、10.05%，累計(jì)方差貢獻(xiàn)率達(dá)到93.23%，符合分析要求。

綜合得分（F）是每個(gè)主成分得分與相對(duì)應(yīng)方差貢獻(xiàn)率的乘積之和，即F=PC1×0.8318+PC2×0.1005。由表3可知，山定子在不同處理下綜合得分分別為-1.31（CK）、0.10（Tl）、0.37 （T2）、0.96（T3）、-0.12（ T4），因此，在重茬條件下山定子葉片在不同濃度納米Ti02處理下的綜合排名由高到低依次為處理T3、處理T2、處理T1、處理T4、CK。

3討論與結(jié)論

光合作用是植物生長(zhǎng)發(fā)育的基礎(chǔ)。葉綠素是進(jìn)行光合作用主要色素，長(zhǎng)時(shí)間的重茬脅迫會(huì)使葉綠素與葉綠體蛋白結(jié)合松弛，進(jìn)而降低葉片的光合能力，使光合產(chǎn)物積累降低，最終導(dǎo)致生長(zhǎng)量顯著下降。本研究在重茬條件下，隨時(shí)間延長(zhǎng)，山定子葉片的葉綠素含量均呈下降趨勢(shì)，施加納米TiO₂后，山定子葉片的葉綠素含量呈不同程度的上升趨勢(shì)；當(dāng)TiO₂濃度增加到4g/kg時(shí)，對(duì)其緩解作用并未繼續(xù)增強(qiáng)，這與于敬波等在水稻中的研究結(jié)論相似。進(jìn)一步證實(shí)TiO₂在一定濃度下可以有效緩解植物遭受脅迫所受傷害。可能是由于納米材料的吸附到植物根系表面，阻塞細(xì)胞壁小孔，影響水分和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收與運(yùn)輸，導(dǎo)致植株無法正常生長(zhǎng)發(fā)育，甚至產(chǎn)生毒害。

研究表明，在正常環(huán)境下植物體內(nèi)活性氧的產(chǎn)生與清除處于動(dòng)態(tài)平衡，當(dāng)植物遭受逆境脅迫時(shí)，這種動(dòng)態(tài)平衡就會(huì)被打破，產(chǎn)生大量活性氧。非生物脅迫下，植物自身會(huì)啟動(dòng)酶促和非酶促兩類保護(hù)系統(tǒng)來減輕或消除活性氧自由基的傷害。本研究中，隨著重茬脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）活性呈下降的趨勢(shì)，這可能是重茬脅迫干擾了植物正常的生理功能，引起體內(nèi)活性氧的積累，導(dǎo)致膜脂過氧化作用，破壞細(xì)胞膜系統(tǒng)，影響細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)物質(zhì)的合成，從而使抗氧化酶活性下降。通過不同濃度納米TiO₂處理后，山定子葉片超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）活性均顯著高于重茬土壤+0.0 g/kgTiO₂，且具有明顯的濃度效應(yīng)，這可能是外源TiO₂增強(qiáng)了植物抗氧化系統(tǒng)的防御能力，維持細(xì)胞膜系統(tǒng)的平衡，從而在一定程度上緩解了重茬脅迫引起的氧化損傷，這與李玲玲等在植物病原微生物中的研究結(jié)果一致。

植物老化或受到傷害時(shí)，易發(fā)生膜脂過氧化作用，丙二醛（MDA）含量和相對(duì)電導(dǎo)率（REC）是反映逆境脅迫對(duì)植物細(xì)胞膜脂過氧化傷害程度的重要參數(shù)。丙二醛（MDA）從膜上產(chǎn)生的位置釋放出來后，可以與蛋白質(zhì)、核酸起反應(yīng)修飾其特征。本研究中，重茬脅迫使得山定子葉片的丙二醛（MDA）含量增加，其生長(zhǎng)受到抑制，施加一定濃度的納米TiO₂可有效降低膜脂過氧化，丙二醛（MDA）上升速率減緩，進(jìn)而在一定程度上緩解了重茬脅迫對(duì)山定子葉片的毒害作用，維持幼苗的正常生長(zhǎng)。相對(duì)電導(dǎo)率（REC）反映植物細(xì)胞膜穩(wěn)定性，重茬脅迫可改變細(xì)胞膜的通透性。該實(shí)驗(yàn)中，在脅迫條件下，山定子幼苗相對(duì)電導(dǎo)率一直呈上升趨勢(shì)，且增幅較大，可能是由于重茬障礙導(dǎo)致細(xì)胞膜受損，進(jìn)而使得細(xì)胞內(nèi)電解質(zhì)外滲，施加TiO₂后山定子幼苗葉片的相對(duì)電導(dǎo)率（REC增幅減小，由此說明納米TiO₂可以緩解重茬脅迫下山定子葉片細(xì)胞膜透性的增大和膜脂過氧化程度的增加，改善脅迫造成的危害。這與Mustafa等在小麥中研究結(jié)果一致。

脯氨酸（Pro）在植物遭受脅迫時(shí)可在體內(nèi)大量積累以保護(hù)細(xì)胞結(jié)構(gòu)，同時(shí)，脯氨酸（Pro）還可以調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透壓，穩(wěn)定分子結(jié)構(gòu)。本研究發(fā)現(xiàn)，重茬脅迫下施入納米TiO₂后山定子葉片的脯氨酸（Pro）含量明顯高于對(duì)照處理（重茬土壤+0.0g/kgTiO₂），這與Emamverdian等在矮竹中的研究結(jié)果分析一致?？赡苁怯捎谑┤隩iO₂后，導(dǎo)致滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)積累，進(jìn)而改善重茬脅迫。

植株重茬脅迫改善受多種因素影響，單個(gè)指標(biāo)無法準(zhǔn)確反映其改善機(jī)制，本研究中對(duì)重茬脅迫后的山定子葉片的各指標(biāo)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。由相關(guān)性分析可得，山定子葉片的葉綠素a（Chl a）與葉綠素b（Chl b）、過氧化物酶（POD）、脯氨酸（Pro）呈顯著正相關(guān)（P<0.05），與葉綠素a+b（Chl a+b）、超氧化物歧化酶（SOD）呈極顯著正相關(guān)（P<0.01），說明葉綠素b（Chl b）含量、過氧化物酶（POD）活性、脯氨酸（Pro）含量降低是影響葉綠素a（Chl a）含量降低的原因。由此可見，TiO₂可以通過調(diào)節(jié)抗氧化酶活性和滲透物質(zhì)含量，從而清除活性氧，以維持抗氧化酶系統(tǒng)的穩(wěn)定性，降低脅迫下膜透性損害，維護(hù)細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能，且具有一定的濃度效應(yīng)，其中，以重茬土壤添加2.0 g/kg的TiO₂的緩解作用效果最佳。

將重茬脅迫處理后相關(guān)的10個(gè)指標(biāo)[葉綠素a（Chl a）、葉綠素b（Chl b）、葉綠素a+b（Chla+b）、Chl a/b、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）、相對(duì)電導(dǎo)率（REC）、脯氨酸（Pro）、丙二醛（MDA）]進(jìn)行主成分分析，提取特征值大于1的2個(gè)主成分，其特征值分別為9.43、2.01；第一、二主成分方差貢獻(xiàn)率依次為83.18%，10.05%，累積方差貢獻(xiàn)率達(dá)到93.23%，符合分析要求。主成分分析結(jié)果表明，TiO₂對(duì)山定子重茬脅迫緩解能力高到低依次為重茬土壤中添加2.0 g/kg TiO₂、重茬土壤中添加1.0 g/kg TiO₂、重茬土壤中添加0.5g/kg TiO₂、重茬土壤中添加4.0g/kg TiO₂、重茬土壤+0.0 g/kg TiO₂。由此可知，在重茬土壤中添加2.0 g/kg TiO₂，可通過改善重茬脅迫下山定子的光合能力、ROS清除機(jī)制、穩(wěn)定細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)來減緩重茬障礙對(duì)蘋果幼苗的危害。