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    肽類化合物對H37Ra抑制的優(yōu)化篩選

    2014-04-09 08:37:43吳叢梅李玲玲關(guān)曉俠劉新濤陳吉殷玉和
    生物技術(shù)通報 2014年8期
    關(guān)鍵詞:異煙肼噬菌體利福平

    吳叢梅 李玲玲 關(guān)曉俠 劉新濤 陳吉 殷玉和

    (長春工業(yè)大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)院,長春 130012)

    肽類化合物對H37Ra抑制的優(yōu)化篩選

    吳叢梅 李玲玲 關(guān)曉俠 劉新濤 陳吉 殷玉和

    (長春工業(yè)大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)院,長春 130012)

    通過抑菌試驗,確定不同培養(yǎng)基條件下多肽化合物的抑菌效果,并測定其最小抑菌濃度(Minimum inhibitory concentration,MIC)。加入Vc,比較抑菌效果,進一步優(yōu)化篩選H37Ra抑制劑。先根據(jù)ELISA試驗結(jié)果進行噬菌體肽庫篩選,然后利用分子對接軟件模擬多肽與ICL蛋白晶體(1F8I)的分子對接,將成功對接的多肽采用Fmoc固相合成法合成,并對其生物活性進行檢測。用制備型反相高效液相色譜儀對合成的多肽進行純化并進行質(zhì)譜檢測。共篩選得到4條多肽且均有抑菌效果,并與劑量相關(guān)。結(jié)果顯示,濃度為800-1 500 μg/mL時,各組多肽均抑菌。濃度為500 μg/mL時,正常培養(yǎng)基中只有一種肽有抑菌作用,而限制碳源培養(yǎng)基中均不能抑菌。2號肽抑菌效果最好,正常培養(yǎng)基中MIC為200 μg/mL,限制碳源中為500 μg/mL。陽性對照組,兩種培養(yǎng)基抑菌效果一致,利福平MIC為0.8 μg/mL,異煙肼MIC為0.5 μg/mL。根據(jù)MIC結(jié)果,在正常培養(yǎng)基中加入Vc,檢測到多肽、利福平和異煙肼的抑菌效果呈劑量依賴性升高。

    肽類化合物 MIC 噬菌體肽庫 分子對接 Fmoc固相合成

    結(jié)核病是結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium)引起的慢性傳染性疾病,已有研究表明結(jié)核桿菌被巨噬細胞吞噬后,在巨噬細胞內(nèi)轉(zhuǎn)為持留狀態(tài),通過乙醛酸循環(huán)途徑獲取能量[1]?,F(xiàn)有藥物會隨著患者免疫力下降或者停藥,而重新致病。因此迫切需求研制新型抗結(jié)核藥物。異檸檬酸裂解酶(ICL)是結(jié)核桿菌在人體內(nèi)處于持續(xù)感染狀態(tài)時乙醛酸支路代謝中的關(guān)鍵酶[2,3],因此,本研究以ICL作為研發(fā)抗結(jié)核藥物的靶點。

    已知的異檸檬酸裂解酶的抑制劑能有效抑制細胞內(nèi)細菌生長[4],但其因自身結(jié)構(gòu)限制,具有生物毒性,所以并不具有藥用及開發(fā)價值[5]。目前還尚未發(fā)現(xiàn)可作為抗結(jié)核病治療藥物的異檸檬酸裂解酶抑制劑。

    本研究以結(jié)核桿菌ICL作為靶點篩選可以抑制細菌生長的多肽。首先利用噬菌體肽庫篩選技術(shù)[6]和分子對接技術(shù)[7,8],優(yōu)化篩選異檸檬酸裂解酶肽類抑制劑。通過測定多肽在不同培養(yǎng)基內(nèi)的抑菌作用,確定能有效抑制細菌生長的最小抑菌濃度(Minimum inhibitory concentration,MIC)[9]。在培養(yǎng)基中加入Vc[10],檢測多肽的抑菌效果,旨在為以異檸檬酸裂解酶為靶點的抗結(jié)核藥物研究奠定基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 菌種 H37Ra菌種由中國藥品生物制品檢定所饋贈。

    1.1.2 儀器 肽類化合物由長春工業(yè)大學(xué)ICL抑制劑試驗組合成。MB7H9,DMSO均購自美國Sigma公司。利福平購自沈陽雙鼎制藥有限公司。異煙肼購自天津藥業(yè)集團新鄭股份有限公司。質(zhì)譜(API400)購自上海晶能生物技術(shù)有限公司。GL3000制備型高效液相色譜儀購自成都格萊精密儀器有限公司。Peptide Synthesizer PSI 200購自美國多肽科技有限公司。

    1.2 方法

    1.2.1 單克隆噬菌體ELISA檢測 用100 μg/mL的ICL靶蛋白包被96孔酶標(biāo)板,4℃過夜。次日去除包被液,于4℃封閉1 h。用TBS/Tween(體積分數(shù)為0.5%)洗板,每孔分別加入10 μL待鑒定的擴增噬菌體和40 μL TBS的混合溶液,室溫震蕩作用1 h。洗板后每孔加入200 μL HRP標(biāo)記的抗-M13抗體(封閉液中以體積比=1∶5 000稀釋)[11],室溫震蕩作用1 h。洗板后每孔加200 μL TMB底物溶液,室溫作用約20 min,出現(xiàn)顏色變化后,用2 mol/L的H2SO450 μL終止反應(yīng),酶標(biāo)儀記錄450 nm處吸光值[12]。

    1.2.2 DNA序列測定 將所提取的噬菌體單鏈DNA送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司進行測序。測序所得的堿基序列,通過Generunner軟件翻譯成所對應(yīng)的氨基酸序列。

    1.2.3 分子對接 從蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(Protein data bank,PDB)晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)中下載ICL蛋白晶體三維結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)(1F8I.Pdb,http://www.pdb.org)。采用程序中的LigandFit預(yù)測ICL活性位點,自動依據(jù)配體/受體復(fù)合物的能量得到最佳的配體和受體結(jié)合結(jié)構(gòu)。分子對接采用Monte Carlo極小化與模擬退火方法,每次優(yōu)化1 000步,并考慮溶劑化效應(yīng),采用cellmultiple模型計算非鍵相互作用。配體和受體間的能量匹配用半經(jīng)驗的自由能計算方法評價[12]。

    1.2.4 肽的固相合成 采用Fmoc固相合成法,先將RinK樹脂在合成儀反應(yīng)器中經(jīng)DMF溶脹30 min,然后逐個偶聯(lián)上氨基酸殘基。粗品先經(jīng)制備型反相高效液相色譜儀純化,再用質(zhì)譜檢測所合成的七肽。

    1.2.5 H37Ra菌種培養(yǎng) 以含10% ADC的MB7H9(內(nèi)含終濃度為0.2%的甘油)為正常生長狀態(tài)的培養(yǎng)基,不含甘油的為限制碳源培養(yǎng)基。1×105Pa高壓滅菌1 h,置4℃冰箱保存。臨用時,加入10% ADC營養(yǎng)添加劑。37℃間或震蕩培養(yǎng)2-3周。

    1.2.6 菌液制備

    1.2.6.1 比濁管的配制 根據(jù)菌液所需達到的濃度要求,按照表1的兩種試劑量添加混勻配置標(biāo)準(zhǔn)比濁管。

    1.2.6.2 細菌懸液的制備 向1.5 cm×3 cm的小瓶內(nèi)放置10個6 mm的玻璃珠,加入含0.5% Tween80的生理鹽水0.5 mL,121℃高壓滅菌1 h。待冷卻后,分別將兩種培養(yǎng)液中培養(yǎng)2-3周菌齡的H37Ra株小心取出,各自用無菌PBS緩沖液洗滌3遍,去除原培養(yǎng)基,分別接入小瓶中,渦旋混勻,直至菌液成乳酪狀,用0.5%生理鹽水稀釋,并與比濁管比濁配置成1 mg/mL的菌液[9],靜置備用。

    1.2.6.3 最小抑菌濃度(MIC)的測定 取制備好的1 mg/mL菌懸液5 μL,含菌數(shù)量2×103,分別接種于每支含500 μL正常狀態(tài)或限制碳源培養(yǎng)液的24孔板中,然后根據(jù)需要在孔中加入1 mL用DMSO配制的不同濃度的七肽化合物,肽濃度梯度稀釋為:1 500、1 000、800、500和200 μg/mL。以利福平和異煙肼為陽性對照,濃度梯度稀釋為1.5、1.0、0.8、0.5和0.2 μg/mL。以DMSO和不添加任何化合物的培養(yǎng)菌液作為陰性對照。同時分別添加1 mmol/L和4 mmol/L的Vc(每孔添加500 μL)做對照組,置37℃恒溫孵箱內(nèi)培養(yǎng),2-3周觀察結(jié)果。

    2 結(jié)果

    2.1 噬菌體陽性克隆酶聯(lián)免疫吸附劑測定(ELISA)和氨基酸測序結(jié)果

    將噬菌體肽庫篩選所得的噬菌體鋪于含IPTG/X-gal的LB平板上,于37℃過夜培養(yǎng)后長出的噬菌斑全部為藍色重組斑,隨機挑取其中的噬菌體克隆對其進行酶聯(lián)免疫吸附劑試驗(ELISA)。樣品的OD450值高于陰性對照一倍即認為該樣品值為陽性值。篩選出的4個陽性克隆的噬菌體ELISA檢測結(jié)果均大于0.2(圖1),氨基酸測序結(jié)果見表2。

    2.2 分子對接結(jié)果

    根據(jù)表2中七肽的氨基酸序列,進行DNA測序。利用分子對接軟件中的Build and Edit Protein構(gòu)建七肽的三維結(jié)構(gòu),以七肽作為配體,將ICL(1F8I)作為受體進行分子對接,篩選出來的4條七肽(編號1、2、3、4)與ICL對接成功(圖2)。

    2.3 肽的固相合成結(jié)果

    根據(jù)氨基酸序列分析結(jié)果,確定合成以上4條七肽。用制備型反相高效液相色譜儀對合成的多肽進行純化。純化多肽由質(zhì)譜(API400)確定其分子量(圖3)。純化結(jié)果(表2)顯示,與計算分子量結(jié)果一致,說明成功合成了這4條肽鏈。

    2.4 肽類抑制劑對H37Ra株的抑制作用

    試驗結(jié)果(表3)顯示,在正常培養(yǎng)基中,所有多肽均具有抑菌性,并與劑量相關(guān)。濃度為800-1 500 μg/mL時,各組多肽(編號1、2、3和4)均抑菌。濃度為500 μg/mL時,只有2號肽有抑菌作用。在限制碳源液體培養(yǎng)基中培養(yǎng),多肽的抑菌性也與劑量相關(guān)。濃度為800-1 500 μg/mL時,各組多肽(編號1、2、3、4)均抑菌。濃度為500 μg/mL時,均不能抑菌。

    利福平和異煙肼為現(xiàn)有治療結(jié)核病藥物,對H37Ra均有抑制作用,其MIC均小于0.5 μg/mL,利福平濃度為0.5 μg/mL時無抑菌效果(表3)。抑菌試驗中,作陽性對照,與不同濃度肽類化合物比較,觀察長菌情況,并記錄其最小抑菌濃度。

    根據(jù)以上結(jié)果,選用正常生長狀態(tài)培養(yǎng)基,并根據(jù)MIC濃度,4條多肽(編號1、2、3、4)做進一步檢測。

    2.5 Vc對H37Ra的抑制作用

    在正常培養(yǎng)基中加入Vc,檢測其對結(jié)核分枝桿菌的抑制作用。在培養(yǎng)基中加入500 μL Vc,在培養(yǎng)第4天和第11天觀察結(jié)核分枝桿菌生長情況,同時設(shè)不加Vc組。結(jié)果(表4)顯示,第4天,正常培養(yǎng)基中長菌,加入Vc后均有抑菌效果;第11天,1 mmol/L Vc不抑菌,而4 mmol/L Vc仍可抑菌。與只加多肽或Vc的培養(yǎng)基相比,加多肽、Vc的培養(yǎng)基,均可抑菌,抑菌效果隨著給藥劑量增加而增強,且隨時間增加而增強。

    3 討論

    隨著越來越多的多肽藥物研發(fā)批準(zhǔn)上市,多肽的研究也越來越受到重視,已成藥多肽有安塞納肽,重組人粒細胞集落刺激因子注射液等。目前已知的異檸檬酸裂解酶的抑制劑有3-溴丙酮酸和3-硝基丙酸鹽,抑制劑常數(shù)(Ki)分別為120 和3 μmol/L[13,14]。這幾種化合物抑制劑可以有效地降低異檸檬酸裂解酶的活性。但是這些化合物由于自身結(jié)構(gòu)等限制,具有很強的生物毒性,所以并不具有藥用及開發(fā)價值。賴煦卉等[5]檢測到化合物FD20的IC50值為62.2 μg/mL,具有較好的成藥物理參數(shù),并能在低濃度下有效抑制細胞內(nèi)細菌生長,是非常具有成藥潛力的抗結(jié)核先導(dǎo)化合物,但仍具有生物毒性,也不是理想的抗結(jié)核藥物。目前還沒有發(fā)現(xiàn)可作為抗結(jié)核病治療藥物的異檸檬酸裂解酶抑制劑。而多肽作為藥物,與現(xiàn)有中藥和化合物類抑制劑相比,免疫原性低、生理活性強、療效高,副作用小、不會聚積體內(nèi)而引起中毒,因此可解決化合物類生物毒性問題。

    Vc是已知的一種抗氧化劑和促氧化劑,具有許多生物學(xué)功能,包括參與氨基酸代謝、增加對感染的抵抗能力、參加解毒功能、抗組胺及阻止致癌物質(zhì)生成等作用。Vilcheze等[10]觀察劑量反應(yīng)關(guān)系表明,Vc在抑制結(jié)核分枝桿菌生長的最小抑菌濃度1 mmol/L,有短暫的抑菌效果,然后恢復(fù)性增長。由于Vc降解,每天分別添加1 mmol/L Vc,連續(xù)添加4 d對結(jié)核分枝桿菌的治療效果和直接添加4 mmol/L Vc效果一樣。Vc對結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)基的殺菌效果是由于其促氧化劑活性,亞鐵離子濃度的增加導(dǎo)致ROS的產(chǎn)生,脂質(zhì)的改變,氧化還原失衡和DNA損傷,進而達到殺菌效果。

    本研究的抑制劑為多肽類抑制劑,以正常和限制碳源兩種培養(yǎng)基做抑菌試驗,多肽濃度梯度稀釋為:1 500、1 000、800、500和200 μg/mL。同時以相同條件的DMSO為陰性對照,利福平和異煙肼為陽性對照,利福平和異煙肼濃度稀釋為:1.5、1.0、0.8、0.5和0.2 μg/mL。檢測到不同培養(yǎng)基條件的多肽均有抑菌效果,并與劑量相關(guān)。濃度為800-1 500 μg/mL時,各組多肽均抑菌。濃度為500 μg/mL時,正常培養(yǎng)基中只有2號肽有抑菌作用,而限制碳源培養(yǎng)基中均不能抑菌。這說明限制碳源時因體內(nèi)代謝狀態(tài)改變而導(dǎo)致肽類抑制劑耐藥性增大。陽性對照組,兩種培養(yǎng)基抑菌效果一致,利福平MIC為0.8 μg/mL,異煙肼MIC為0.5 μg/mL。這與已有報道中利福平為0.5 μg/mL,異煙肼為0.2 μg/mL有所不同,可能與培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件的選擇有關(guān)。

    在兩種培養(yǎng)基中加入Vc,濃度為1 mmol/L和4 mmol/L檢測到多肽、利福平和異煙肼的抑菌效果呈劑量依賴性提高。給藥4 d,每天分別添加1 mmol/L Vc,與直接添加4 mmol/L Vc各組抑菌效果一樣,這與已有研究結(jié)果[10]一致。給藥11 d,4 mmol/L Vc組仍具有抑菌效果,而1 mmol/L Vc組H37Ra恢復(fù)增長,這應(yīng)與Vc降解有關(guān)。可見Vc與多肽、利福平和異煙肼一起給藥對H37Ra抑制有協(xié)同效果,較單獨給藥具有更好的抑菌作用,但Vc作為輔助藥與多肽化合物聯(lián)合應(yīng)用的效應(yīng)及機制有待探討,Vc給藥濃度仍有待于研究。在此,選用正常培養(yǎng)基重復(fù)試驗,對篩選出的4條多肽MIC進一步測定,檢測結(jié)果合理,為以多肽類抑制劑做新型抗結(jié)核藥物提供了理論依據(jù)。進一步優(yōu)化篩選H37Ra抑制劑,為抗結(jié)核藥物設(shè)計提供新的思路。在現(xiàn)有研究報告中,尚未有Vc與多肽聯(lián)合應(yīng)用的相關(guān)報道,可望為結(jié)核病治療開辟新的途徑。

    多肽類抑制劑具有較好的成藥物理參數(shù),并且能在低濃度下有效抑制細菌生長,具有成藥潛力,是理想的抗結(jié)核藥物。此外,Vc來源廣泛,與多肽一起聯(lián)合給藥抑菌克數(shù)比常規(guī)藥物大10個數(shù)量級,藥物半衰期延長,這在抗結(jié)核藥物研究領(lǐng)域尚未報道,有利于下一步研究對其進行結(jié)果改造,具有廣闊的應(yīng)用前景。

    4 結(jié)論

    ICL是結(jié)核桿菌在人體內(nèi)處于持續(xù)感染狀態(tài)乙醛酸支路代謝中的關(guān)鍵酶,本研究以ICL作為研發(fā)抗結(jié)核藥物的靶點。利用噬菌體肽庫篩選技術(shù)和分子對接技術(shù),成功篩選出4種ICL肽類抑制劑,通過抑菌試驗測定均有抑菌活性,并與劑量相關(guān)。確定不同培養(yǎng)基條件下多肽化合物的MIC,進而在正常培養(yǎng)基中加入Vc,檢測到多肽抑菌效果呈劑量依賴性升高。

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    (責(zé)任編輯 馬鑫)

    Optimization Screening of Peptides Inhibition to H37Ra

    Wu Congmei Li Lingling Guan Xiaoxia Liu Xintao Chen Ji Yin Yuhe
    (School of Chemistry and Life Science,Changchun University of Technology,Changchun 130012)

    By inhibition experiments to determine the inhibitory effect of peptide compounds under different culture conditions, and measure theirs minimal inhibitory concentration(MIC). Adding Vc to compare inhibitory effect and future optimize screening H37Ra inhibitors. According to the results of ELISA test screen the phage peptide library, and then uses the Molecular docking software to simulate peptide docking with ICL protein crystal(1F8I). The successful docking peptide uses the solid-phase synthesis method of Fmoc for synthesis, and tests its biological activity. By preparative reversed phase HPLC purifies the synthesized peptides and detects mass spectrometry. Four peptides were screened, all of which have bacteriostatic effect, and correlated with the dose. The results showed that when the concentration between 800 and 1 500 μg/mL all group were bacteriostat. When the concentration is 500 μg/mL, only one peptide has bacteriostatic effect in the normal medium, while all cannot inhibit in the limit carbon medium. The inhibitory effect of No.2 peptide is best, and its MIC is 200 μg/mL in normal culture, while it is 500 μg/mL in carbon limitations. Positive control group, two media’s inhibitory effect were consistent, RIF’s and INH’s MIC were 0.8 μg/mL and 0.5 μg/mL, respectively. According to MIC results, the inhibitory effects of peptide, RIF and INH were improved when adding Vc to the normal culture, and to be a dose-dependent increase.

    Peptides MIC Phage peptide library Molecular docking Solid-phase synthesis method of Fmoc

    2014-03-31

    吉林省科技發(fā)展計劃項目(2008110)

    吳叢梅,女,教授,研究方向:生物工程學(xué);E-mail:wucmyue@sina.com

    殷玉和,男,講師,研究方向:生物工程學(xué);E-mail:yyhlxt72@sina.com

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