腫瘤中乳酸脫氫酶B作用機制的研究進展

白 雁，郭心瑤，秦啟亮，嚴 方*

（1中國藥科大學藥物分析系，南京 210009；2青海省黃南藏族自治州食品藥品檢驗檢測中心，同仁 811399）

20世紀20年代，Otto Warburg發(fā)現即使在充足的氧氣為線粒體呼吸提供燃料的情況下，腫瘤細胞也會優(yōu)先使用糖酵解而不是線粒體氧化磷酸化（oxidative phosphorylation，OXPHOS）來產生三磷酸腺苷（adenosine-triphosphate，ATP），這種現象被稱為“Warburg效應”或有氧糖酵解［1］。有氧糖酵解被認為是腫瘤發(fā)生和進展的標志［2-3］，其為癌細胞提供大分子和細胞器生物合成所需的糖酵解中間體，以支持腫瘤快速增殖的需要［4］。乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）作為有氧糖酵解的關鍵酶，催化丙酮酸和乳酸之間的相互轉化，在糖酵解過程中發(fā)揮著重要作用。LDH 是一種四聚體酶，由 兩 種 亞 基LDHA 和LDHB 組 成［5］。其 中，LDHA 在許多惡性腫瘤中異常過表達，并與腫瘤的生長、維持和侵襲有關。上調的LDHA通過增加乳酸的產生、加速糖酵解、調節(jié)活性氧的產生以及大量腫瘤相關蛋白表達，從而促進腫瘤的惡性進展。同時，采用LDHA作為診斷和治療靶點的臨床試驗也取得了令人鼓舞的結果［6］。然而LDHB 在腫瘤中作用機制的相關研究相對較少，但日益增多的文獻報道均顯示，LDHB 作為一種糖酵解酶也與多種腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關，如肺癌［7］、胰腺癌［8］、前列腺癌［9］等。并且，與LDHA 在多種腫瘤中發(fā)揮促進腫瘤發(fā)展的作用不同的是，LDHB 在不同腫瘤中的作用不同，不僅可以作為致癌因子發(fā)揮促癌作用，而且可以作為抑癌因子發(fā)揮抑癌作用［10］，因此本文對LDHB 在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的功能進行了綜述。

1 有氧糖酵解和LDHB

大量研究表明，腫瘤細胞中糖酵解明顯升高的主要原因之一是代謝途徑相關酶和轉運體基因的轉錄增強，從而使相應蛋白表達增加，如LDH、磷酸果糖激酶1（phosphofructokinase-1，PFK-1）、己糖激酶（hexokinase，HK）、葡萄糖轉運蛋白1（glucose transporter 1，GLUT1）等［11］。其中LDH 是有氧糖酵解中催化丙酮酸和乳酸轉化可逆反應的關鍵酶，包含五種同工酶分別是LDH1（H4）、LDH2（MH3）、LDH3（M2H2）、LDH4（M3H）、LDH5（M4），均為LDHA（M 亞基）和LDHB（H 亞基）兩種亞基組成的四聚體酶［5］。LDHA 由位于染色體11p15.1上的ldha基因編碼，主要在骨骼肌中表達；LDHB 由位于染色體12p12.1上的ldhb基因編碼，主要在心肌中表達。LDHA 與LDHB 有著相似的分子結構，但蛋白活性位點周圍的帶電殘基存在差異，從而帶有不同的正負電荷，表現出不同的動力學特征。LDHA 蛋白分子上帶1 個正電荷，而LDHB 蛋白分子上帶6 個負電荷，所以LDHA 優(yōu)先與丙酮酸結合，催化丙酮酸轉化為乳酸的正向反應；LDHB 優(yōu)先與乳酸結合，催化乳酸轉化為丙酮酸的逆向反應［10，12-13］。

2 腫瘤細胞中調控LDHB表達及酶活的機制

在不同的腫瘤細胞中，多種途徑可調控LDHB的表達及酶活。其中DNA 甲基化修飾、轉錄因子調控、轉錄后調控和其他調控機制都調控了LDHB的表達，只有蛋白質翻譯后修飾調控了LDHB 的酶活。

2.1 DNA甲基化修飾調控LDHB表達

DNA 甲基化是指DNA 序列上特定的堿基在DNA 甲基化轉移酶的催化作用下，以S-腺苷甲硫氨酸作為甲基供體，通過共價鍵結合的方式獲得一個甲基基團的化學修飾過程，可以發(fā)生在胞嘧啶、腺嘌呤以及鳥嘌呤等位點，其中胞嘧啶上第5位碳原子的甲基化是哺乳動物DNA 甲基化的唯一形式。啟動子的異常甲基化會使基因轉錄受到抑制，從而調節(jié)基因表達［14］。Cui 等［15］研究發(fā)現胰腺癌細胞中LDHB 的啟動子高度甲基化，導致LDHB表達下調。而Liu 等［9］的研究則表明，前列腺癌細胞中的成纖維細胞生長因子受體1（fibroblast growth factor receptor 1，FGFR1）促進了LDHB 啟動子甲基化，抑制了其轉錄，下調了其蛋白表達。

2.2 轉錄因子調控LDHB表達

2.2.1 轉錄因子HIF-1 調控LDHB 表達 缺氧誘導因子1（hypoxia-inducible factor-1，HIF-1）是一種含有α 和β 亞基的異二聚體。當缺氧時，穩(wěn)定的HIF-1α 進入細胞核結合HIF-1β，然后這種復合物與缺氧響應元件（hypoxia-responsive elements，HRE）結合，激活靶基因轉錄［6］。臨床病例研究中，Zhang 等［16］檢測79 例結直腸癌患者的蛋白表達情況發(fā)現，HIF-1α 和LDHB 的表達呈顯著正相關。而在細胞水平上的研究則發(fā)現，在神經母細胞瘤細胞中，過表達HIF-1α 后LDHB 表達上調，敲低HIF-1α 后LDHB 表達下調［17］。然而，在乳腺癌細胞中，過表達HIF-1α 后LDHB 的表達則下調，顯示HIF-1α 和LDHB 的表達呈負相關［18］。這些研究結果表明，HIF-1α對LDHB具有雙向調控作用。

2.2.2 轉錄因子STAT3調控LDHB表達 信號轉導和轉錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）是一種細胞質轉錄因子，可將細胞外信號傳導至細胞核。STAT3 在細胞質中以無活性的形式存在，當其酪氨酸殘基磷酸化后被激活。活化的STAT3 形成二聚體結構，并通過核轉運蛋白進入細胞核，與基因啟動子結合，進而激活靶基因轉錄［19］。Zha 等［20］發(fā)現人前列腺癌細胞PC3，肝癌細胞Bel-7402、HepG2，非小細胞肺癌細胞A549，胰腺癌細胞PANC-1 和乳腺癌細胞MDA-MB-468 等細胞中的哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）可以激活STAT3，活化的STAT3 進一步激活LDHB 轉錄，上調LDHB 表達，增強糖酵解，從而促進mTOR 介導的腫瘤發(fā)生。

2.2.3 轉錄因子KLF14 調控LDHB 表達Krüppel-like 轉錄因子14（Krüppel-like transcription factor 14，KLF14）是 Krüppel-like 轉 錄 因 子（Krüppel-like transcription factor，KLF）家族成員中唯一不含內含子的基因，其N 端含有一個轉錄調節(jié)域，C 端含有一個高度保守的DNA 結合域，且C端結合區(qū)含有3 個連續(xù)的C2H2 鋅指模體，能特異性識別和結合靶基因啟動子區(qū)域的GC 盒、CACCC盒等核心元件，進而調節(jié)靶基因的轉錄［21］。Wu等［22］的研究顯示，結直腸癌細胞中的KLF14 可降低LDHB 啟動子活性，并顯著下調LDHB 表達，降低糖酵解通量，進而抑制結直腸癌的進展。

2.3 轉錄后調控LDHB表達

轉錄后調控是指基因轉錄后在mRNA 加工、翻譯等過程中的調節(jié)。轉錄后調控包括RNA 的可變剪接、mRNA 的5′加帽和3′加尾、microRNA（miRNA）調控等。miRNA 是一類由19～22 個核苷酸組成的非編碼小RNA 分子，參與多種生物學過程，包括發(fā)育、分化、凋亡和細胞增殖。它們通過翻譯抑制和mRNA 切割調節(jié)基因表達［23］。在默克爾細胞癌［24］和甲狀腺乳頭狀癌［25］等腫瘤的細胞中都發(fā)現miR-375 和LDHB 表達水平呈負相關，并通過降解LDHB mRNA，降低LDHB mRNA 的豐度，從而下調LDHB 蛋白表達。這些研究成果表明，miR-375 可以靶向LDHB 的mRNA，從而負調控LDHB蛋白表達。

2.4 其他機制調控LDHB表達

長 鏈 非 編 碼RNA（long non-coding RNAs，lncRNAs）是長度超過200 個核苷酸的非蛋白編碼RNA 分子，可與DNA、RNA 和蛋白質結合，在各個水平上進行基因調控［26］。La Montagna 等［27］在非小細胞肺癌細胞中發(fā)現LncRNA KIMAT1 可與LDHB 蛋白結合，增強LDHB 蛋白穩(wěn)定性，從而上調LDHB表達水平。

此外，啟動子區(qū)的堿基突變會改變啟動子活性，導致基因轉錄活性發(fā)生變化，從而調節(jié)基因表達。Liu 等［28］對90 例三陰性乳腺癌患者和110 例非三陰性乳腺癌患者以及169 例健康漢族患者的LDHB 啟動子區(qū)進行了測序和分析，發(fā)現三陰性乳腺癌患者LDHB啟動子區(qū)發(fā)生了rs11046147 G ＞ A的突變，這種突變顯著增強了LDHB 啟動子活性，提高了LDHB 的表達。該突變體在三陰性乳腺癌患者中普遍存在，對三陰性乳腺腫瘤發(fā)生可能起到關鍵作用。

2.5 蛋白質翻譯后修飾調控LDHB酶活

翻譯后修飾（post-translational modifications，PTMs）是蛋白質功能調控的重要方式，它通過改變蛋白質的帶電性、親/疏水性和空間結構等性狀來影響蛋白質的結構和功能。蛋白質的PTMs 方式極其多樣，以乙?；?、磷酸化、糖基化、泛素化等較為常見［29］。近年來研究發(fā)現，腫瘤的發(fā)生常伴隨PTMs異常，其在腫瘤進展中起重要作用。

Shi 等［30］研究發(fā)現LDHB 是一個乙?；鞍?，去乙?；?（sirtuin 5，SIRT5）可使LDHB 329 位賴氨酸（K329）去乙?；?。去乙?；疞DHB 的酶活性顯著增加，并且其有利于結直腸癌細胞中溶酶體酸化和自噬溶酶體成熟，進而增加癌細胞自噬。同時，LDHB K329 去乙?；€可以通過促進癌細胞的呼吸作用和ATP 生成，從而加速結直腸癌細胞的增殖和腫瘤生長。此外，Cheng 等［31］的研究發(fā)現，Aurora-A 可以直接與LDHB 相互作用并磷酸化其162 位絲氨酸。磷酸化LDHB 解除了丙酮酸的底物抑制作用，導致其丙酮酸還原為乳酸活性顯著提高，進一步促進了癌細胞中糖酵解通量、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+）的再生、乳酸的產生和糖酵解中間體的生物合成，從而促進了腫瘤細胞增殖。

3 LDHB和腫瘤發(fā)生發(fā)展的關系

3.1 LDHB促進和抑制腫瘤作用

LDHB 在不同腫瘤中有不同作用，既可促進又可抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展。

3.1.1 LDHB 的促癌作用 LDHB 在多種腫瘤中高表達并且發(fā)揮著促進腫瘤生長的作用，如乳腺癌、骨肉瘤、甲狀腺乳頭狀癌等。

臨床病例研究中，Wang 等［8］采用免疫組化檢測了50 對胰腺癌組織和匹配的鄰近正常組織中LDHB 蛋白的表達，發(fā)現與鄰近正常組織相比，胰腺癌組織表達更高水平的LDHB。類似情況，Wang 等［32］比較56 例骨肉瘤組織和相鄰正常組織也發(fā)現，與相鄰正常組織相比，骨肉瘤組織中LDHB表達水平顯著升高。另外，Luo 等［33］在對胰腺導管腺癌標本、瘤周組織標本、良性胰腺標本和正常胰腺標本研究中發(fā)現，106 例胰腺導管腺癌標本中，57例（53.8%）檢測到LDHB陽性表達；35例瘤周組織標本中，11 例（31.4%）檢測到LDHB 陽性表達；55例良性胰腺標本中，13例（23.6%）檢測到LDHB陽性表達；13例正常胰腺組織中均未檢測到LDHB的表達。這些數據表明，胰腺導管腺癌中LDHB蛋白陽性表達率顯著高于瘤周組織、良性胰腺和正常胰腺組織。LDHB 陽性表達的瘤周組織和胰腺良性病變還顯示出不典型增生或上皮內瘤變，提示LDHB是一種致癌因子，參與胰腺導管腺癌的癌變過程。此外，LDHB 的表達還與乳腺腫瘤狀態(tài)有關，Yustisia Ika 等［34］在對32 例乳腺纖維腺瘤和31例浸潤性乳腺癌臨床樣本的研究中發(fā)現，32 例纖維腺瘤中29 例（91%）表達LDHB，然而31 例浸潤性乳腺癌中只有20 例（64.5%）表達LDHB，表明LDHB在不同腫瘤狀態(tài)之間的表達存在顯著差異。

在細胞水平上的相關研究發(fā)現，沉默LDHB會降低甲狀腺乳頭狀癌［25］、非小細胞肺癌［35］和胰腺癌［8］細胞中的有氧糖酵解，抑制癌細胞生長。同時LDHB 表達上調促進了骨肉瘤細胞增殖、遷移和侵襲活性，抑制了細胞凋亡［32，36］。此外，McCleland等［7，37］研究發(fā)現LDHB在三陰性乳腺癌和含有癌基因kras 擴增型與突變型的肺腺癌細胞中過度表達；并且體外實驗結果顯示LDHB敲除可抑制癌細胞增殖，體內異種移植腫瘤實驗證實了LDHB敲除可顯著抑制小鼠體內異種移植瘤的生長。這些結果顯示了LDHB對于三陰性乳腺癌和kras擴增型與突變型肺腺癌的生長是必需的。除此之外，Brisson等［38］在對多種癌細胞的研究中還發(fā)現，LDHB 通過控制溶酶體活性與酸化、自噬囊泡成熟和細胞內蛋白質水解，增強癌細胞自噬，進而促進癌細胞增殖；而沉默LDHB 可抑制癌細胞自噬和增殖，并誘導凋亡細胞死亡。

3.1.2 LDHB的抑癌作用 有趣的是，LDHB雖在多種腫瘤中表現出促進腫瘤發(fā)展的作用，但其在膀胱尿路上皮癌和肝癌等腫瘤中又發(fā)揮了抑制腫瘤生長的作用，抑制LDHB表達反而會增強癌細胞增殖、侵襲能力。

Sheng 等［39］運用比較蛋白質組學研究了20 例臨床膀胱尿路上皮癌腫瘤樣本發(fā)現，LDHB 表達水平隨著組織學分級升高而降低，在高級別膀胱癌組織中的表達明顯低于非高級別膀胱尿路上皮癌組織。Chen 等［40］在對75 例肝癌患者正常及癌變組織的LDHB 表達水平進行研究時也發(fā)現，LDHB在肝癌組織中的表達明顯低于非癌組織，且與肝癌病理分級、血管浸潤、淋巴結轉移相關。細胞水平上研究則表明，下調LDHB表達可增強前列腺癌細胞的致瘤性［9］。

3.2 LDHB促進和抑制腫瘤的分子機制

3.2.1 LDHB 的促癌作用分子機制 Rosso 等［41］分析了21 例乳腺癌患者的腫瘤組織發(fā)現，乳腺癌組織中的LDHB 表達水平與上皮鈣黏蛋白（epithelial cadherin，E-cadherin）變體水平呈正相關。在細胞水平上，下調LDHB 表達可導致穩(wěn)定轉染E-cadherin 變體乳腺癌細胞活力顯著降低，增殖減少。同樣在乳腺癌細胞中，Fu 等［42］研究發(fā)現高遷移率族框蛋白2（high-mobility group box 2，HMGB2）也與LDHB 表達水平呈正相關，HMGB2 通過上調LDHB 表達，增強糖酵解、加速癌細胞增殖，從而促進乳腺癌進展。此外，Li 等［43］研究發(fā)現在非小細胞肺癌細胞中，LDHB 和發(fā)育多潛能相關蛋白4（developmental pluripotency-associated 4，Dppa4）的表達水平呈正相關。敲低LDHB 可逆轉Dppa4 對癌細胞糖酵解和增殖的促進作用，Dppa4-LDHB 軸在非小細胞肺癌細胞的糖酵解過程中起重要作用，參與調控非小細胞肺癌的發(fā)生發(fā)展。LDHB還可以通過降低AMP活化蛋白激酶α（AMP-activated protein kinase α，AMPKα）磷酸化水平阻礙其激活，進而促進癌基因kras介導的肺腫瘤發(fā)生［27］。

在更詳細的代謝途徑研究中，突變異檸檬酸脫氫酶（isocitrate dehydrogenases，IDHs）產生的代謝物R-2-羥基戊二酸（R-2-hydroxyglutarate，R-2HG），被報道具有抗腫瘤活性。Qing 等［44］研究發(fā)現，在白血病細胞中，R-2HG 通過脂肪和肥胖相關蛋白（fat mass and obesity-associated protein，FTO）/血小板型磷酸果糖激酶（phosphofructokinase platelet，PFKP）/LDHB 軸抑制LDHB 的表達，從而抑制有氧糖酵解，發(fā)揮抗腫瘤活性。而抗癌藥物4-氨基-2-三氟甲基苯基維甲酸酯（4-amino-2-t-rifluoromethylphenyl retinate，ATPR）則是通過視黃酸受體α（retinoic acid receptor α，RARα）/LDHB/細胞外調節(jié)蛋白 激 酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）糖酵解信號通路下調LDHB 表達，抑制糖酵解，抑制白血病細胞增殖，從而產生了抗白血病的作用［45］。同時，在胰腺癌細胞中L型氨基酸轉運蛋白2（L-type amino acid transporter 2，LAT2）可以通過LAT2-mTOR-LDHB 通路，靶向激活mTOR 并上調LDHB 表達；過表達LDHB 可激活糖酵解通路，并促進胰腺癌細胞對吉西他濱的化療耐藥性［46］。

3.2.2 LDHB 的抑癌作用分子機制 Hong 等［47］通過研究肝癌細胞發(fā)現，LDHB 沉默可誘導糖酵解增強，并通過乳酸介導丙酮酸脫氫酶激酶（pyruvate dehydrogenase kinase，PDK）激活，增加丙酮酸脫氫酶（pyruvate dehydrogenase，PDH）的抑制性磷酸化，減弱PDH 活性，從而降低氧化磷酸化通量。這一結果顯示了，LDHB 沉默是增強糖酵解的關鍵機制，并在肝癌進展中參與線粒體功能障礙的維持，抑制氧化磷酸化通路。此外，Kim等［48］還報道了LDHB 抑制不僅可以啟動和維持代謝向有氧糖酵解的轉變，而且通過誘導緊密連接蛋白-1（claudin-1，Cln-1）蛋白表達促進了肝癌細胞的侵襲。

3.3 LDHB與臨床患者預后

LDHB 不僅發(fā)揮促進與抑制腫瘤作用，而且其表達水平還與患者預后相關。Luo 等［33］研究發(fā)現LDHB 表達水平與胰腺導管腺癌患者生存率呈負相關，LDHB 陽性表達的患者存活時間明顯短于LDHB 陰性表達的患者，LDHB 蛋白的陽性表達與胰腺導管腺癌患者的進展和不良預后有關。此外，LDHB 高表達對三陰性乳腺癌［37］、胰腺癌［46，8］、骨肉瘤［36］和肺腺癌［7］患者生存率有著顯著影響，LDHB過表達的患者預后較差。Sun等［49］的研究則顯示了LDHB 的過表達會導致口腔鱗狀細胞癌細胞對紫杉醇、順鉑和5 氟尿嘧啶（TPF）新輔助化療方式中紫杉醇的耐藥性，高LDHB 表達與TPF化療效果差以及口腔鱗狀細胞癌患者較短的總生存期和無病生存期相關。

相反，Koh 等［50］研究發(fā)現LDHB 陽性肺鱗狀細胞癌患者的無復發(fā)生存率高于LDHB 陰性患者。高LDHB 表達和血清LDH 水平與肺鱗狀細胞癌患者更好的臨床治療結果顯著相關。此外，有研究報道低LDHB/LDHA 比值與肝癌、前列腺癌患者不良預后顯著相關。LDHB 的低表達和LDHA 的過表達與前列腺癌患者的生化復發(fā)和生存時間短相關，LDHB 表達越低的前列腺癌患者的無復發(fā)生存率越差［9，12，47］。

4 LDHB作為腫瘤診斷的生物標志物

LDHB 可作為一種臨床生物標志物，用于對腫瘤患者的診斷，對腫瘤治療具有重要意義。研究表明LDHB 是肺鱗狀細胞癌［50］、骨肉瘤［36］復發(fā)的獨立預測標志物以及頭頸部鱗狀細胞癌［51］的潛在預后標志物。除此之外，de Haas 等［52］還發(fā)現，ldhb、ccnb1和myc3 種基因的表達水平能夠預測成神經管細胞瘤患者的生存情況；腫瘤組織中同時表達LDHB 和周期蛋白B1（cyclin B1，CCNB1）蛋白的患者預后很差，而低表達MYC 蛋白的患者預后良好；多因素分析則顯示LDHB/CCNB1 和MYC 均是獨立的成神經管細胞瘤的預后標志物。

5 總結與展望

腫瘤是一種生物能量代謝失調的疾病。代謝重編程是腫瘤的主要特征，為癌細胞提供了獨特的生存環(huán)境以及大量生物合成途徑所需的中間體，滿足了快速增殖癌細胞的營養(yǎng)需求。腫瘤代謝重編程包括谷氨酰胺分解增加以及脂質代謝、有氧糖酵解增加等。有氧糖酵解在腫瘤增殖、遷移和侵襲中起著關鍵作用，與腫瘤生長和進展密切相關。

LDHB 是有氧糖酵解的關鍵酶，不僅參與了多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展，而且可以作為生物標志物用于對腫瘤患者的診斷和預后判斷。雖然LDHB 和LDHA 都與腫瘤進展有關，但是與LDHA 相比，LDHB 與腫瘤的關系要復雜得多。LDHA 在所有腫瘤細胞中均表現出相似高的表達水平，然而從目前有關LDHB 的研究來看，LDHB 在不同腫瘤中的表達水平不同，并參與了多種不同的信號轉導通路，發(fā)揮了不同的生物學作用。在乳腺癌、肺癌、甲狀腺乳頭狀癌等腫瘤中LDHB作為一種致癌因子，發(fā)揮著增強糖酵解的作用，促進腫瘤增殖、侵襲和遷移；但有趣的是LDHB又在前列腺癌、肝癌、膀胱尿路上皮癌等腫瘤中作為糖酵解的抑制因子發(fā)揮抑癌作用，高LDHB表達反而會降低癌細胞增殖和侵襲活力。本課題組研究發(fā)現LDHB 是一個糖基化蛋白，同時在肝癌細胞上的研究顯示，糖基化LDHB會降低肝癌細胞糖酵解通量，抑制肝癌細胞增殖。本研究結果和已有文獻報道結果一致，表明了LDHB在肝癌中作為糖酵解抑制因子，抑制肝癌進展。此外，后續(xù)實驗還將聚焦于糖酵解通路相關蛋白與代謝物的研究，深入了解LDHB在糖酵解通路中的具體作用機制。

綜上所述，LDHB 與各種腫瘤的關系相當復雜，因此還需要更多的研究來闡明LDHB在不同腫瘤中的作用以及影響腫瘤進展詳細的分子機制，為其今后用于腫瘤診斷和治療奠定理論基礎。