SNP-9對(duì)魚藤酮所致帕金森病細(xì)胞模型的作用及機(jī)制研究

黃志歡，梁 瀟，高向東，陳 松

（中國藥科大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院江蘇省生物藥物成藥性研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 211198）

帕金森?。≒arkinson's disease，PD）是僅次于阿爾茨海默病的全球第二大神經(jīng)退行性疾病。中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的丟失和錯(cuò)誤折疊的α-突觸核蛋白（α-synuclein，α-syn）異常聚集形成的路易小體［1-2］，是PD 的典型病理特征。PD 患者臨床上表現(xiàn)為運(yùn)動(dòng)性障礙和非運(yùn)動(dòng)性障礙。運(yùn)動(dòng)性障礙主要包括運(yùn)動(dòng)遲緩、肌肉強(qiáng)直、靜止性震顫［3］，非運(yùn)動(dòng)性障礙包括焦慮、認(rèn)知障礙、失眠等［4-5］，這些癥狀嚴(yán)重影響PD 患者的生活質(zhì)量。當(dāng)前對(duì)于PD的發(fā)病機(jī)制尚未明確，可能涉及到神經(jīng)炎癥、氧化應(yīng)激、線粒體功能障礙、接觸毒性物質(zhì)等［6］，以及SNCA、PINK1、PRKN、LRRK2、GBA等基因突變［7］。隨著全球人口老齡化的加劇，PD 將會(huì)給公共衛(wèi)生、家庭和經(jīng)濟(jì)帶來更加沉重的負(fù)擔(dān)，開發(fā)有效的PD 治療手段受到越來越多的關(guān)注。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)絲素蛋白水解物（silk fibroin hydrolysate，SFH）具備神經(jīng)元保護(hù)功能［8-9］。通過對(duì)SFH進(jìn)一步研究，課題組獲得了多肽SNP-9。本文旨在前期研究基礎(chǔ)上，對(duì)SNP-9 抗PD 的作用及機(jī)制開展初步研究。

本研究使用魚藤酮損傷SH-SY5Y 細(xì)胞作為PD 細(xì)胞模型，探討魚藤酮作用下SNP-9 對(duì)PD 細(xì)胞模型細(xì)胞活力和凋亡的影響，并進(jìn)一步考察SNP-9對(duì)PD 細(xì)胞模型活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平，以及酪氨酸羥化酶（tyrosine hydroxylase，TH）、α-syn 和凋亡相關(guān)蛋白Bax/Bcl-2 的影響，為SNP-9防治PD的研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材 料

1.1 試 劑

DMEM 高糖培養(yǎng)基、胎牛血清（美國Gibco 公司）、胰蛋白酶（美國Sigma 公司）；SNP-9（序列：GSGAGAGSGAGAGSGAGSGSGA，純度：95.2%，中國金斯瑞生物科技有限公司）；魚藤酮（美國MCE 公司）；氨芐青霉素、鏈霉素、MTT（中國Biosharp 公司）；ROS 檢測試劑盒、BCA 蛋白濃度檢測試劑盒、Hoechst/PI 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒、RIPA 裂解液、SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液（5 ×）（中國碧云天生物技術(shù)有限公司）；胎牛血清白蛋白（德國Bio-Froxx 公司）；增強(qiáng)型ECL 發(fā)光液、PVDF 膜、蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑（美國Millipore 公司）；蛋白樣Marker（美國Thermo 公司）；TH 抗體、Bax 抗體、Bcl-2抗體、β-actin抗體（中國Abclonal公司）；α-syn抗體（美國BD Biosciences 公司）；山羊抗兔IgG、山羊抗鼠IgG（美國Cell Signaling Technology 公司）；其余試劑均為國產(chǎn)市售分析純。

1.2 儀 器

細(xì)胞培養(yǎng)箱、高速冷凍離心機(jī)、全波長酶標(biāo)儀（美國Thermo 公司）；倒置熒光顯微鏡（日本Olympus 公司）；電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀（美國Bio-Rad 公司）；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（中國Tanon 公司）；流式細(xì)胞儀（美國BD Biosciences公司）。

1.3 細(xì) 胞

神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y（ATCC）。

2 方 法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化

將SH-SY5Y 細(xì)胞復(fù)蘇后，置于含有10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基中，于含5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中37 ℃過夜培養(yǎng)。待細(xì)胞匯合度達(dá)到80%，進(jìn)行細(xì)胞傳代。待SH-SY5Y 細(xì)胞貼壁后，將細(xì)胞培養(yǎng)基更換為含1%胎牛血清和反式維甲酸（終濃度為10 μmol/L）的DMEM 培養(yǎng)基，培養(yǎng)3 d，將細(xì)胞培養(yǎng)基更換為含1%胎牛血清和十四烷酰佛波醇乙酸酯（終濃度為80 nmol/L）的DMEM 培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)3 d，即完成誘導(dǎo)分化。

2.2 魚藤酮致SH-SY5Y細(xì)胞損傷模型的建立

使用胰酶消化SH-SY5Y 細(xì)胞后，按照每毫升4 × 104個(gè)細(xì)胞的密度接種至96 孔板，每孔體積為100 μL。10 h 后設(shè)置不同濃度魚藤酮（0.05、0.1、0.2、0.4、0.8 μmol/L）與SH-SY5Y細(xì)胞共孵育24 h，通過MTT 法檢測細(xì)胞活力：每孔加入5 mg/mL MTT 10 μL，37 ℃孵育4 h，舍棄培養(yǎng)基，每孔加入二甲亞砜150 μL，置于搖板機(jī)上350 r/min 搖板10 min。使用全波長酶標(biāo)儀，設(shè)置570 nm 為檢測波長，630 nm 為參比波長，檢測各孔吸收度，計(jì)算細(xì)胞活力。

2.3 SNP-9 對(duì)魚藤酮致SH-SY5Y 細(xì)胞PD 模型細(xì)胞活力的影響

細(xì)胞培養(yǎng)及鋪板同“2.2”項(xiàng)。以0.1 μmol/L作為魚藤酮造模損傷濃度，分別設(shè)置加入魚藤酮和不加魚藤酮兩種條件。以含1%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基設(shè)置不同濃度的SNP-9（1、2、4、8 μmol/L），與細(xì)胞孵育24 h 后，通過MTT 法檢測各組細(xì)胞活力。

2.4 Hoechst/PI 雙染法檢測魚藤酮及SNP-9 對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞凋亡的影響

從培養(yǎng)箱中取出狀態(tài)良好的SH-SY5Y 細(xì)胞，胰酶消化后按照每毫升4×105個(gè)細(xì)胞的密度接種至6 孔板，置于5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中37 ℃過夜培養(yǎng)。次日設(shè)置實(shí)驗(yàn)組別：空白對(duì)照組、SNP-9（4 μmol/L）組、魚藤酮（0.1 μmol/L）組、魚藤酮（0.1 μmol/L）+ SNP-9（4 μmol/L）組。造模及SNP-9干預(yù)24 h后，舍棄培養(yǎng)基，使用PBS潤洗2次。在各孔中加入含有7 mmol/L Hoechst 的DMEM 培養(yǎng)基1 mL，置37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育25 min。舍棄培養(yǎng)基，使用PBS 潤洗細(xì)胞2 次，在各孔中加入含有2 mmol/L PI 的DMEM 培養(yǎng)基1 mL，置于室溫中避光孵育15 min。孵育結(jié)束，使用PBS 潤洗細(xì)胞3次，在各孔中加入無血清的DMEM 培養(yǎng)基1 mL，于倒置熒光顯微鏡下觀察檢測紅色和藍(lán)色熒光，考察細(xì)胞凋亡情況。

2.5 DCFH-DA 探針檢測魚藤酮及SNP-9 對(duì)SHSY5Y細(xì)胞ROS水平的影響

細(xì)胞培養(yǎng)、鋪板、分組同“2.4”項(xiàng)。造模及SNP-9 干預(yù)24 h 后，舍棄培養(yǎng)基，加入胰酶消化細(xì)胞，收集細(xì)胞并將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至EP 管中，使用離心機(jī)設(shè)置1 000 r/min，離心5 min 收集細(xì)胞。離心完畢，舍棄上清液，加入含有10 μmol/L DCFH-DA 的DMEM 培養(yǎng)基1 mL，置于37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中避光孵育30 min，其間隔3 min 顛倒混勻1 次。孵育結(jié)束，使用離心機(jī)設(shè)置1 000 r/min，離心5 min，舍棄上清液，加入PBS 潤洗3 次。使用篩網(wǎng)過濾后，通過流式細(xì)胞儀檢測各組別胞內(nèi)ROS水平。

2.6 Western blot 檢測魚藤酮及SNP-9 對(duì)SHSY5Y細(xì)胞TH、α-syn、Bax、Bcl-2水平的影響

細(xì)胞培養(yǎng)、鋪板、分組同“2.4”項(xiàng)。造模及SNP-9干預(yù)24 h后，提取細(xì)胞總蛋白。舍棄細(xì)胞培養(yǎng)基，使用PBS 潤洗細(xì)胞3 次后，在每個(gè)孔中加入RIPA裂解液（含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑）80 μL，使用細(xì)胞刮刀刮下細(xì)胞，轉(zhuǎn)移細(xì)胞至EP 管中，放置于冰上裂解30 min，每3 分鐘渦旋1 次。使用離心機(jī)設(shè)置條件為4 ℃、12 000 r/min，離心20 min。離心結(jié)束后收集上清液并記錄體積。通過BCA 法檢測各組別蛋白濃度，并調(diào)整為相同濃度，加入1/4 體積的5 × 上樣緩沖液，水浴加熱10 min。配制SDS-PAGE 膠進(jìn)行80 V 恒壓電泳。電泳完畢將SDS-PAGE 膠取出置于PVDF 膜上，300 mA 恒流濕法轉(zhuǎn)膜。取出PVDF 膜，置于5%BSA 中封閉2 h。封閉結(jié)束，使用TBST 洗膜5 次，孵育TH、α-syn、Bax、Bcl-2 一抗，于4 ℃放置過夜。次日取出PVDF 膜，使用TBST 洗膜5 次，加入對(duì)應(yīng)的山羊抗兔二抗或山羊抗鼠二抗孵育2 h，孵育結(jié)束，使用TBST 洗膜5 次，加入ECL 發(fā)光液進(jìn)行成像。

2.7 統(tǒng)計(jì)分析

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用GraphPad Prism 8.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表示為±s，采用Oneway ANOVA 進(jìn)行組間分析。P＜ 0.05 代表具有顯著性差異。

3 結(jié) 果

3.1 魚藤酮損傷SH-SY5Y細(xì)胞模型的建立

不同濃度魚藤酮與SH-SY5Y 細(xì)胞共孵育24 h后，MTT 法檢測細(xì)胞活力。結(jié)果如圖1 所示，魚藤酮對(duì)SH-SY5Y 細(xì)胞活力的損傷具有濃度依賴性。對(duì)比空白對(duì)照組，0.1 μmol/L魚藤酮處理組細(xì)胞活力降低約30%，選擇該濃度作為魚藤酮造模損傷濃度。

Figure 1 Effects of different concentrations of rotenone on SH-SY5Y cell viability (± s, n = 6)**P ＜ 0.01, ***P ＜ 0.001 vs control group

3.2 單獨(dú)給藥SNP-9 對(duì)SH-SY5Y 細(xì)胞活力的影響

通過含1%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基設(shè)置不同濃度SNP-9與SH-SY5Y細(xì)胞共孵育24 h后，MTT法檢測細(xì)胞活力。結(jié)果如圖2所示，對(duì)比空白對(duì)照組，SNP-9 單獨(dú)給藥組細(xì)胞活力無顯著變化，說明單獨(dú)給藥不同濃度SNP-9 對(duì)SH-SY5Y 細(xì)胞活力無顯著影響。

Figure 2 Effects of different concentrations of SNP-9 on SH-SY5Y cell viability (± s, n = 6)NS: No significance

3.3 SNP-9 對(duì)魚藤酮損傷SH-SY5Y 細(xì)胞活力的影響

0.1 μmol/L 魚藤酮及不同濃度SNP-9 與SHSY5Y 共孵育24 h 后，MTT 法檢測細(xì)胞活力。結(jié)果如圖3 所示，對(duì)比空白對(duì)照組，魚藤酮模型組細(xì)胞活力顯著降低。對(duì)比魚藤酮模型組，2、4、8 μmol/L SNP-9 可顯著緩解魚藤酮誘導(dǎo)的SH-SY5Y 細(xì)胞活力下降。最后選擇4 μmol/L 作為SNP-9 的給藥干預(yù)濃度開展進(jìn)一步研究。

Figure 3 Effects of rotenone and SNP-9 on SH-SY5Y cell viability(± s, n = 6)***P ＜ 0.001 vs control group; ###P ＜ 0. 001 vs rotenone group

3.4 SNP-9 對(duì)魚藤酮損傷SH-SY5Y 細(xì)胞凋亡的影響

實(shí)驗(yàn)分組為空白對(duì)照組、SNP-9（4 μmol/L）組、魚藤酮（0.1 μmol/L）組、魚藤酮（0.1 μmol/L）+SNP-9（4 μmol/L）組。魚藤酮及SNP-9 與SH-SY5Y細(xì)胞孵育24 h 后，進(jìn)行Hoechst/PI 雙染。結(jié)果如圖4 所示，對(duì)比空白對(duì)照組，魚藤酮模型組細(xì)胞凋亡水平增加。對(duì)比魚藤酮模型組，SNP-9給藥能夠減少魚藤酮誘導(dǎo)的PI陽性細(xì)胞水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明SNP-9能夠緩解魚藤酮導(dǎo)致的異常細(xì)胞凋亡。

Figure 4 Effects of SNP-9 and rotenone on apoptosis in SH-SY5Y cells (Scale bar, 100 μm)

3.5 SNP-9 及魚藤酮對(duì)SH-SY5Y 細(xì)胞胞內(nèi)ROS水平的影響

實(shí)驗(yàn)分組同“3.4”項(xiàng)。魚藤酮和SNP-9 給藥干 預(yù)SH-SY5Y 細(xì) 胞24 h 后，通 過DCFH-DA 探 針結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞胞內(nèi)ROS 水平。結(jié)果如圖5 所示，對(duì)比空白對(duì)照組，魚藤酮處理使SHSY5Y 細(xì)胞胞內(nèi)ROS 水平顯著升高。對(duì)比魚藤酮模型組，SNP-9 給藥干預(yù)后ROS 水平顯著降低，說明SNP-9 可緩解魚藤酮誘導(dǎo)的ROS 水平異常。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明SNP-9 具有緩解PD 細(xì)胞模型中氧化應(yīng)激的作用。

Figure 5 Effects of SNP-9 and rotenone on the ROS levels in SH-SY5Y cells (± s, n = 3)A: Detection of ROS levels in SH-SY5Y cells by flow cytometry; B: Quantitative analysis of ROS levels***P ＜ 0.001 vs control group; ###P ＜ 0. 001 vs rotenone group

3.6 SNP-9及魚藤酮對(duì)SH-SY5Y 細(xì)胞TH 和α-syn水平的影響

實(shí)驗(yàn)分組同“3.4”項(xiàng)。魚藤酮造模和SNP-9給藥干預(yù)SH-SY5Y 細(xì)胞24 h 后，提取細(xì)胞總蛋白，Western blot 檢測細(xì)胞TH、α-syn 水平。結(jié)果如圖6顯示，對(duì)比空白對(duì)照組，魚藤酮模型組細(xì)胞TH 水平顯著降低，α-syn 水平則顯著升高。對(duì)比魚藤酮模型組，SNP-9 給藥干預(yù)后緩解了TH 水平的異常降低和α-syn 水平的異常升高。Western blot 結(jié)果證明SNP-9能夠緩解魚藤酮誘導(dǎo)的PD病理。

Figure 6 Effects of SNP-9 and rotenone on the levels of tyrosine hydroxylase (TH) and α-syn in SH-SY5Y cells (± s, n = 3)A: Levels of TH and α-syn detected by Western blot; B, C: Quantitative analysis of the levels of TH and α-syn**P ＜ 0.01 vs control group; ##P ＜ 0.01 vs rotenone group

3.7 SNP-9 及魚藤酮對(duì)SH-SY5Y 細(xì)胞Bax、Bcl-2蛋白水平的影響

實(shí)驗(yàn)分組同“3.4”項(xiàng)。魚藤酮造模和SNP-9給藥干預(yù)SH-SY5Y 細(xì)胞24 h 后，提取細(xì)胞總蛋白，Western blot檢測細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bax和Bcl-2的水平。結(jié)果如圖7 所示，對(duì)比空白對(duì)照組，魚藤酮模型組細(xì)胞Bax/Bcl-2顯著增加。對(duì)比魚藤酮模型組，SNP-9 給藥干預(yù)顯著緩解Bax/Bcl-2 的異常增加。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明SNP-9 可能通過調(diào)控凋亡相關(guān)通路中的Bax/Bcl-2，進(jìn)而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

4 討 論

PD具有復(fù)雜的發(fā)病機(jī)制，目前對(duì)于PD的發(fā)病原因尚未完全明確。氧化應(yīng)激是PD 發(fā)病過程中的關(guān)鍵病理事件［10-11］。氧化應(yīng)激源于細(xì)胞內(nèi)氧化與抗氧化作用的失調(diào)，進(jìn)而造成ROS 的累積。過量的ROS 造成細(xì)胞膜脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和核酸氧化損傷，從而破壞神經(jīng)元的結(jié)構(gòu)完整性，造成神經(jīng)元信息傳遞受損［12］，提示氧化應(yīng)激可能與多巴胺能神經(jīng)元的退化密切相關(guān)。線粒體作為細(xì)胞的能量工廠，對(duì)于能量生成、ROS 產(chǎn)生、細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)至關(guān)重要［13］。魚藤酮是一種線粒體電子傳遞鏈復(fù)合物I 的抑制劑，能夠造成多巴胺神經(jīng)元α-syn 聚集［14］，并且導(dǎo)致ROS 的過度生成，引起多巴胺能神經(jīng)元的氧化應(yīng)激［15］，是模擬PD 病理常用的神經(jīng)毒性分子［16-17］。SH-SY5Y 細(xì)胞經(jīng)過分化后能夠提高多巴胺合成限速酶TH 的表達(dá)水平，并增加細(xì)胞對(duì)神經(jīng)毒性分子的敏感性［18-19］。因此，本研究通過魚藤酮損傷分化后的SH-SY5Y 細(xì)胞建立模擬PD 病理的細(xì)胞模型，考察SNP-9 對(duì)PD 細(xì)胞模型的作用和機(jī)制。

Figure 7 Effects of SNP-9 and rotenone on the levels of Bax and Bcl-2 in SH-SY5Y cells (± s, n = 3)A: Levels of Bax and Bcl-2 detected by Western blot; B: Quantitative analysis of the levels of Bax/Bcl-2***P ＜ 0.001 vs control group; ##P ＜ 0. 01 vs rotenone group

細(xì)胞凋亡可能參與了神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生發(fā)展，其中線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑，抑凋亡蛋白（Bcl-2和Bcl-xL）和促凋亡蛋白（Bax和Bak）的平衡起著關(guān)鍵作用［20］。抑制線粒體介導(dǎo)的凋亡可能對(duì)神經(jīng)退行性疾病具有保護(hù)作用［21］。在本研究中，SNP-9可能通過影響凋亡相關(guān)蛋白Bax/Bcl-2信號(hào)通路，減少魚藤酮誘導(dǎo)的SH-SY5Y 細(xì)胞凋亡和ROS 水平，緩解TH 和α-syn 水平異常。本研究為SNP-9應(yīng)用于治療PD提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。