黑曲霉液體發(fā)酵制備苦蕎膳食纖維及降脂活性研究

劉有志 劉國廠 于長生

摘要：苦蕎食藥兼用，具有抗氧化、降血糖和抗動(dòng)脈硬化等多種生物活性功效，苦蕎中富含膳食纖維，目前膳食纖維的研究主要集中于加工工藝和生物活性方面，對(duì)發(fā)酵苦蕎膳食纖維和生物活性的研究較少，該試驗(yàn)基于此，利用黑曲霉液體發(fā)酵技術(shù)，對(duì)苦蕎膳食纖維進(jìn)行加工發(fā)酵，并對(duì)發(fā)酵后的苦蕎膳食纖維營養(yǎng)物質(zhì)和降脂功效進(jìn)行研究。研究結(jié)果表明，發(fā)酵前后苦蕎膳食纖維中的蛋白質(zhì)、水分和脂質(zhì)含量基本保持不變，膳食纖維的總含量基本穩(wěn)定，但發(fā)酵后苦蕎膳食纖維中的不可溶性膳食纖維減少，可溶性膳食纖維增加；發(fā)酵后苦蕎膳食纖維的持水力、持油性和膨脹力均得到了提高，調(diào)節(jié)高脂飲食小鼠腸道中微生物群落結(jié)構(gòu)能力得到了增強(qiáng)，為發(fā)酵型苦蕎膳食纖維的功能應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：膳食纖維；降脂功效；苦蕎；基因組分析

中圖分類號(hào)：TS210.9????? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A???? 文章編號(hào)：1000-9973（2023）08-0081-04

Preparation of Tartary Buckwheat Dietary Fiber by Liquid Fermentation of

Aspergillus niger and Study on Its Lipid-Lowering Activity

LIU You-zhi1， LIU Guo-chang2， YU Chang-sheng1

（1.Yongcheng Vocational College， Yongcheng 476600， China; 2.Huanghe S & T

University， Zhengzhou 450006， China）

Abstract： Tartary buckwheat is used as both food and medicine， and has multiple bioactive functions such as anti-oxidation， regulating blood sugar level and anti-arteriosclerosis. Tartary buckwheat is rich in dietary fiber. At present， the research on tartary buckwheat dietary fiber is mainly focused on processing technology and biological activity， with less research on fermented tartary buckwheat dietary fiber and biological activity. Based on this， in this test， Aspergillus niger liquid fermentation technology is used to process and ferment tartary buckwheat dietary fiber， and the nutrients and lipid-lowering effect of the fermented tartary buckwheat dietary fiber are studied. The results show that the content of protein， water and lipid before and after fermentation remains unchanged basically， the total content of dietary fiber is basically stable， but the insoluble dietary fiber in the fermented tartary buckwheat dietary fiber decreases， the soluble dietary fiber increases. After fermentation， the water holding capacity， oil holding capacity and expansibility of tartary buckwheat dietary fiber are all improved， and the ability to regulate the microbial community structure in the gut of mice with high-fat diet is enhanced， which has provided a theoretical basis for the functional application of fermented tartary buckwheat dietary fiber.

Key words： dietary fiber; lipid-lowering effect; tartary buckwheat; genome analysis

收稿日期：2023-02-18

基金項(xiàng)目：2018年度河南省社科聯(lián)規(guī)劃類型項(xiàng)目（SKL-2018-2810）

作者簡介：劉有志（1982-），男，講師，碩士，研究方向：運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練與食品營養(yǎng)。

苦蕎食藥兼用[1]，在我國被廣泛栽培。近些年的研究結(jié)果表明[2—3]，苦蕎中富含有營養(yǎng)價(jià)值和藥理價(jià)值的成分[4]，也是制作苦蕎醋等調(diào)味品的基本原料[5—7]。

苦蕎醋是一種色、香、味俱全的保健醋[8]，生產(chǎn)工藝和傳統(tǒng)老陳醋加工工藝相似[9-10]?？嗍w醋中富含氨基酸和微量元素[11]，在軟化血管、降血脂、降血糖、調(diào)節(jié)機(jī)體代謝平衡方面具有明顯的生物活性[12]。

苦蕎富含膳食纖維，膳食纖維具有很高的持水性和膨脹力[13]，食用之后能產(chǎn)生明顯飽腹感[14]；此外，膳食纖維具有較好的持油力[15]和降低膽固醇的功效，被廣泛應(yīng)用于食品加工工業(yè)中[16]。

黑曲霉常用于食品生產(chǎn)和發(fā)酵，在國際上被廣泛使用[17]，經(jīng)過發(fā)酵之后會(huì)產(chǎn)生纖維素酶、植酸酶和果膠酶等。本研究基于此，利用黑曲霉發(fā)酵技術(shù)，加工制備發(fā)酵型苦蕎膳食纖維，并通過宏基因技術(shù)對(duì)比發(fā)酵前后苦蕎膳食纖維對(duì)高脂飲食小鼠腸道中微生物群落的影響，為苦蕎產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供了理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試劑

苦蕎、黑曲霉、葡萄糖、膽固醇、膽酸鈉、乙醇、α-淀粉酶、氯化鈣、蛋白胨、硫酸亞鐵、硫酸亞鎂、瓊脂、氯化鈉、無水乙醇、RNA引物、酵母粉等。

1.2 試驗(yàn)儀器

水浴鍋、粉碎機(jī)、滅菌鍋、蒸發(fā)儀、電子顯微鏡、分析儀、紅外光譜儀、超凈工作臺(tái)、離心機(jī)、分光光度計(jì)、PCR儀、純水儀。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 培養(yǎng)基的制作

斜面培養(yǎng)基：葡萄糖10 g，蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，瓊脂18 g，水1 mL，自然pH。

馬鈴薯培養(yǎng)基：葡萄糖10 g，馬鈴薯粉43 g，硫酸鎂2 g，水1 mL，自然pH。

將上述的培養(yǎng)基制作完成之后，在121 ℃條件下滅菌15 min。

1.3.2 苦蕎膳食纖維持水力的測(cè)定

苦蕎膳食纖維持水力的測(cè)定參考文獻(xiàn)[18]的方法進(jìn)行。

1.3.3 苦蕎膳食纖維持油力的測(cè)定

苦蕎膳食纖維持油力的測(cè)定參考文獻(xiàn)[19]的方法進(jìn)行。

1.3.4 苦蕎膳食纖維膨脹力的測(cè)定

苦蕎膳食纖維膨脹力的測(cè)定參考文獻(xiàn)[20]的方法進(jìn)行；稱取2 g苦蕎膳食纖維，添加去離子水40 mL，搖勻之后靜置。

膨脹力=V1－V2M。

式中：V1表示樣品的初始體積，mL；V2表示靜置之后的膨脹體積，mL；M表示加入樣品的體積，mL。

1.3.5 小鼠腸道中微生物PCR擴(kuò)增和測(cè)序

每個(gè)小鼠隨機(jī)取3份樣品，對(duì)每個(gè)樣品進(jìn)行DNA提取、PCR擴(kuò)增，再通過電泳技術(shù)檢測(cè)，最后將PCR結(jié)果送至測(cè)序公司進(jìn)行高通量分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 苦蕎膳食纖維制備及理化性質(zhì)的分析

2.1.1 發(fā)酵前后苦蕎膳食纖維中基本成分分析

通過對(duì)比發(fā)酵前后苦蕎膳食纖維中的營養(yǎng)成分，發(fā)現(xiàn)采用黑曲霉發(fā)酵前后苦蕎中灰分、蛋白質(zhì)和脂肪的含量基本一致。由表1可知，苦蕎中的膳食纖維包括不可溶性膳食纖維和可溶性膳食纖維，發(fā)酵前苦蕎膳食纖維中不可溶膳食纖維含量為（17.67±1.2）%，可溶性膳食纖維含量為（3.21±0.6）%；發(fā)酵后苦蕎膳食纖維中不可溶膳食纖維含量為（16.23±0.8）%，可溶性膳食纖維含量為（4.57±0.8）%。結(jié)果表明發(fā)酵后的苦蕎膳食纖維中不可溶膳食纖維含量減少，而可溶性膳食纖維含量增加。

2.1.2 苦蕎膳食纖維持水力、持油力和膨脹力的測(cè)定

由圖1可知，隨著時(shí)間的增加，發(fā)酵前后的苦蕎膳食纖維持水力先上升后下降。發(fā)酵后苦蕎膳食纖維持水力最高為3.5 mg/g，發(fā)酵前苦蕎膳食纖維持水力最高為3.0 mg/g，發(fā)酵后苦蕎膳食纖維持水力明顯高于發(fā)酵前苦蕎膳食纖維持水力，這是由于發(fā)酵后的苦蕎膳食纖維結(jié)構(gòu)更加疏松多孔，表面積增加，使得苦蕎膳食纖維的吸水能力和保水作用更強(qiáng)。

膳食纖維的持油力是評(píng)價(jià)膳食纖維品質(zhì)的重要標(biāo)準(zhǔn)，正常情況下，膳食纖維的持油能力越強(qiáng)，則表示對(duì)膽固醇的吸附能力越強(qiáng)，其降血脂和降血糖的作用更好。膳食纖維持油力與分子大小、表面特性和電荷總數(shù)有關(guān)。由圖2可知，隨著時(shí)間的增加，發(fā)酵后苦蕎膳食纖維持油力先升高后降低；發(fā)酵前苦蕎膳食纖維持油力先升高再趨于穩(wěn)定最終呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)。經(jīng)過發(fā)酵后的苦蕎膳食纖維持油力相比于發(fā)酵前的苦蕎膳食纖維持油力更強(qiáng)，說明發(fā)酵后的膳食纖維更加疏松多孔，持油力也有所增加。

苦蕎膳食纖維的膨脹力和其分子大小、表面特征和化學(xué)成分密切相關(guān)，更大的表面積和更小的粒徑使得苦蕎膳食纖維的膨脹力更高。此外，苦蕎膳食纖維的提取溫度、pH值和粉碎程度對(duì)膳食纖維的吸水膨脹力也會(huì)產(chǎn)生影響。由圖3可知，經(jīng)過發(fā)酵后的苦蕎膳食纖維膨脹力有所增加，當(dāng)時(shí)間為2 h時(shí)，苦蕎膳食纖維的膨脹力從3.5 mL/g上升到4.2 mL/g，發(fā)酵后的苦蕎膳食纖維膨脹力更高，這為發(fā)酵后的苦蕎膳食纖維在食品中運(yùn)用提供了指導(dǎo)和理論依據(jù)。

2.2 苦蕎膳食纖維對(duì)高脂飲食小鼠腸道中微生物群落的影響

2.2.1 Alpha 多樣性分析

人體和動(dòng)物的腸道中存在各種各樣的微生物，腸道微生物與人體長期共存，先前的研究結(jié)果表明，膳食纖維可以改良人體中的微生物種類和數(shù)量，從而對(duì)人體健康產(chǎn)生影響。

隨著高通量技術(shù)的發(fā)展，測(cè)序的準(zhǔn)確性和靈敏度也得到提高，通過對(duì)比飼喂發(fā)酵前苦蕎膳食纖維、發(fā)酵后苦蕎膳食纖維和未飼喂苦蕎膳食纖維的高脂飲食小鼠腸道中微生物組成及變化，以研究經(jīng)過黑曲霉發(fā)酵的苦蕎膳食纖維對(duì)高脂飲食小鼠腸道微生物菌群的影響。

通過高通量技術(shù)對(duì)飼喂發(fā)酵前苦蕎膳食纖維、發(fā)酵后苦蕎膳食纖維和未飼喂膳食纖維（空白組）小鼠的腸道微生物多樣性進(jìn)行分析。

由圖4可知，3個(gè)小組中共有微生物總數(shù)為100個(gè)，飼喂苦蕎膳食纖維的小鼠腸道中獨(dú)有的微生物總數(shù)為581個(gè)；飼喂未經(jīng)過發(fā)酵苦蕎膳食纖維的小鼠體內(nèi)微生物總數(shù)為664個(gè)；未飼喂膳食纖維的小鼠體內(nèi)微生物總數(shù)為1 345個(gè)，與未飼喂苦蕎膳食纖維的小鼠相比，飼喂苦蕎膳食纖維的小鼠體內(nèi)微生物種類明顯減少，說明食用一定量的膳食纖維，能夠干預(yù)小鼠腸道中的微生物多樣性和豐富性。

2.2.2 苦蕎膳食纖維對(duì)高脂飲食小鼠腸道中微生物Beta多樣性分析

采用聚類分析每3個(gè)樣品之間微生物的相似性，試驗(yàn)結(jié)果表明，每3個(gè)樣品出現(xiàn)明顯的聚集，小鼠體內(nèi)的微生物多樣性相似度較高，3個(gè)不同的小組說明微生物群落之間有著一定程度差異，見圖5。不同處理方式使得小鼠腸道中的微生物群落結(jié)構(gòu)不同，見圖6。

2.2.3 微生物群落門水平的差異分析

采用16S rRNA對(duì)小鼠腸道中的微生物門水平進(jìn)行分析，由圖7可知，不同的樣本微生物的多樣性不同。飼喂苦蕎膳食纖維（A）的小鼠腸道中厚壁菌門含量最高，占總微生物數(shù)的71.23%，其次是擬桿菌門，含量為18.89%；飼喂經(jīng)過發(fā)酵后的苦蕎膳食纖維，小鼠腸道中的后壁菌門含量降低，為54.25%，而擬桿菌門含量增加，為31.23%；未飼喂苦蕎膳食纖維的小鼠腸道中的微生物種類上下波動(dòng)幅度較大。結(jié)果表明，發(fā)酵型苦蕎膳食纖維調(diào)節(jié)腸道微生物穩(wěn)定能力強(qiáng)于未發(fā)酵苦蕎膳食纖維。

2.2.4 微生物群落屬水平的差異分析

從微生物屬水平對(duì)小鼠腸道中微生物組成進(jìn)行分析，3個(gè)小組中的乳酸桿菌（Lactobacillus）含量差異明顯，見圖8。飼喂未發(fā)酵的苦蕎膳食纖維（A）和飼喂發(fā)酵型苦蕎膳食纖維（B）的小鼠腸道中的乳酸菌含量低于未飼喂苦蕎膳食纖維（C）的小鼠。飼喂發(fā)酵型苦蕎膳食纖維的小鼠腸道中的乳酸桿菌含量為7.52%，飼喂未發(fā)酵的苦蕎膳食纖維小鼠腸道中的乳酸菌含量為4.56%，未飼喂苦蕎膳食纖維的小鼠腸道中的乳酸菌含量為2.13%，說明發(fā)酵型苦蕎膳食纖維能夠增加小鼠腸道中的乳酸菌含量且能改善腸道中微生物群落結(jié)構(gòu)。

3 小結(jié)

發(fā)酵后苦蕎膳食纖維中的蛋白質(zhì)、水分和脂質(zhì)含量基本保持不變。膳食纖維總含量也基本保持不變，但苦蕎膳食纖維中的不可溶膳食纖維減少，可溶性膳食纖維增加。發(fā)酵后的苦蕎膳食纖維持水力、持油力和膨脹力均得到了提高，調(diào)節(jié)高脂飲食小鼠腸道中微生物能力得到了增強(qiáng)，另外，經(jīng)過發(fā)酵后的苦蕎膳食纖維中的生物活性成分也得到了明顯提高，這為發(fā)酵型苦蕎膳食纖維的功能應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)。

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