基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)探討小青龍湯治療慢性支氣管炎的分子靶點(diǎn)和作用機(jī)制

賴(lài)永健，何麗清，儲(chǔ)開(kāi)博，柴 希，柴溥苒

（山西中醫(yī)藥大學(xué)，山西 晉中 030619）

慢性支氣管炎（chronic bronchitis，CB）是肺部氣管和周?chē)M織產(chǎn)生非特異性炎癥的臨床疾病，其定義是連續(xù)2年內(nèi)每年至少3個(gè)月咳嗽咳痰，同時(shí)排除導(dǎo)致慢性排痰性咳嗽的其他呼吸道或心臟原因[1]。CB的形成通常與接觸刺激性氣體或藥物有關(guān)，但遺傳性疾病或呼吸道感染也是發(fā)生CB的原因之一。目前研究認(rèn)為，CB形成主要與腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1（IL-1）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）等的異常表達(dá)有關(guān)[2]。常規(guī)治療以預(yù)防為主，發(fā)作時(shí)采用抗生素、支氣管擴(kuò)張藥、解痙平喘藥等治療。

根據(jù)慢性支氣管炎的臨床表現(xiàn)，其屬于中醫(yī)學(xué)“咳嗽”“喘證”“痰飲”等疾病范疇，臨床上治療咳嗽咳痰、氣喘、肺中有寒飲者，當(dāng)屬小青龍湯最妙。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)小青龍湯具有抗過(guò)敏、抗炎、止咳平喘等作用，常用于治療慢性支氣管炎、呼吸道感染、慢性阻塞性肺疾病等呼吸系統(tǒng)疾病。研究表明，小青龍湯可以通過(guò)抑制絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路中的細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）、Jun氨基末端激酶（JNK）、p38絲裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）等蛋白的表達(dá)，改善CB患者的氣道炎癥反應(yīng)[3]。但是，小青龍湯治療CB的其他作用機(jī)理及其有效化學(xué)成分還需進(jìn)一步探索。為此，本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)整合分子對(duì)接模擬方法，對(duì)小青龍湯治療CB的作用機(jī)制及有效成分進(jìn)行探討，為小青龍湯的現(xiàn)代科學(xué)研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 小青龍湯活性成分篩選

在HERB數(shù)據(jù)庫(kù)（本草組鑒，http：//herb.ac.cn/）進(jìn)行藥物成分的查找[4]，依次檢索小青龍湯中麻黃、芍藥、細(xì)辛、甘草、干姜、桂枝、五味子、半夏的化學(xué)成分，篩選去重后，進(jìn)入PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）根 據(jù) 成 分名稱(chēng)查找“Canonical SMILES”號(hào)[5]。然后通過(guò)SwissADME 數(shù) 據(jù) 庫(kù)（http：//www.swissadme.ch/）篩選活性成分，篩選標(biāo)準(zhǔn)包括：（1）藥物動(dòng)力學(xué)選擇胃腸道吸收（gatrointestinal absorption）為“high”；（2）類(lèi)藥性5個(gè)標(biāo)準(zhǔn)中至少滿(mǎn)足其中2個(gè)[6-7]，即①氫鍵供體不超過(guò)5個(gè)；②氫鍵受體不超過(guò)10個(gè)；③脂水分配系數(shù)不超過(guò)5；④分子量在500以下；⑤可旋轉(zhuǎn)鍵數(shù)不超過(guò)10個(gè)。

1.2 小青龍湯活性成分的靶點(diǎn)篩選

將篩選出來(lái)的活性成分的“Canonical SMILES”號(hào)通過(guò) SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.swisstargetprediction.ch/）進(jìn)行對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)預(yù)測(cè)[8]，物種一欄中選擇“homo sapiens”（智人），就可以得到該成分對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)（每個(gè)成分最多只有100個(gè)靶點(diǎn)）。納入所有概率值大于0的靶點(diǎn)，然后將所有靶點(diǎn)去重后，即得到小青龍湯所有有效成分對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)。

1.3 CB 疾病靶點(diǎn)的篩選

以“chronic bronchitis”為關(guān)鍵詞，在TTD數(shù)據(jù) 庫(kù)（http：//db.idrblab.net/ttd/）、GeneCard 數(shù) 據(jù) 庫(kù)（https：//www.genecards.org/）以 及OMIM 數(shù) 據(jù) 庫(kù)（https：//www.omim.org/）進(jìn)行檢索，獲得疾病靶點(diǎn)并去重，基于Uniport數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.uniprot.org/）對(duì)獲得的疾病靶點(diǎn)進(jìn)行篩選，限定物種為“human”。

1.4 小青龍湯治療CB 的靶點(diǎn)篩選

將篩選的CB疾病靶點(diǎn)和小青龍湯活性成分靶點(diǎn)導(dǎo)入Venny 2.1.0（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）分析工具，取兩者交集即可得兩者的共同靶點(diǎn)。

1.5 小青龍湯治療CB 的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心靶點(diǎn)的篩選

將得到的共同靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//cn.string-db.org/），最低相互作用閾值設(shè)為0.9，構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)。將蛋白互作網(wǎng)絡(luò)信息及活性成分信息導(dǎo)入Cytoscape 3.8.2 軟件，在CytoNCA 插件中勾選中介中心性（betweenness centrality，BC）、緊密中心性（closeness centrality，CC）、度中心性（degree centrality，DC），在結(jié)果中按DC≥2×DC中位數(shù)，BC和CC大于或等于其中位數(shù)進(jìn)行篩選[9]，得到最終核心靶點(diǎn)，同時(shí)獲得有效活性成分節(jié)點(diǎn)度值（Degree）。

1.6 小青龍湯治療CB 靶點(diǎn)基因本體功能富集分析（Geneontology，GO）和京都基因與基因組百科全書(shū)（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析

將篩選出來(lái)的核心靶點(diǎn)，利用Metascape數(shù) 據(jù) 庫(kù)（https：//metascape.org/）進(jìn) 行GO 功 能 和KEGG通路富集分析，分別將分析得到的生物過(guò) 程（biological process，BP）、細(xì) 胞 組 成（cellular component，CC）、分子功能（molecular function，MF）數(shù)據(jù)取前20 條導(dǎo)出，算出-LogP 值，然后錄入GraphPad Prism 9.3.1軟件中，獲取GO功能分析圖；選取排名前20條KEGG通路，將數(shù)據(jù)導(dǎo)入微生信（http：//www.bioinformatics.com.cn/）分析工具，繪制氣泡圖。

1.7 小青龍湯活性成分與核心靶點(diǎn)分子對(duì)接

取節(jié)點(diǎn)Degree值排名前10位的活性成分，在PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)下載對(duì)應(yīng)成分的2D結(jié)構(gòu)，保存為sdf格式；再利用Chem 3D軟件獲得對(duì)應(yīng)的3D結(jié)構(gòu)，并保存為mol2格式。取排名前10位的最終核心靶點(diǎn)，分別在PDB 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//metascape.org/）檢索，獲得靶點(diǎn)的3D結(jié)構(gòu)，保存為pdb格式，利用PyMOL 2.6.0軟件進(jìn)行去水、去殘基配體操作。利用AutoDock Tools 1.5.7軟件對(duì)活性成分和靶點(diǎn)進(jìn)行對(duì)接驗(yàn)證，最后用PyMOL 2.6.0軟件進(jìn)行可視化處理。

2 結(jié) 果

2.1 小青龍湯活性成分及靶點(diǎn)篩選

從HERB 數(shù)據(jù)庫(kù)得到小青龍湯活性成分2271個(gè)，其中，麻黃485個(gè)，桂枝268個(gè)，干姜269個(gè)，細(xì)辛256 個(gè)，半夏179 個(gè)，甘草401 個(gè)，白芍242 個(gè)，五味子171 個(gè)，合并去重后共獲取活性成分1837 個(gè)；將這些成分通過(guò)SwissADME數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行篩選，得到活性成分共1141個(gè)，其中，麻黃254 個(gè)，桂枝153 個(gè)，干姜106 個(gè)，細(xì)辛115，半夏96個(gè)，甘草222 個(gè)，白芍105 個(gè)，五味子90 個(gè)，去重后共987個(gè)活性成分；將這些活性成分輸入SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)篩選，去重后共得到1411個(gè)靶點(diǎn)。

2.2 小青龍湯治療CB 的靶點(diǎn)篩選

以疾病“chronic bronchitis”為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)有1194個(gè)靶點(diǎn)，OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)80個(gè)，TTD數(shù)據(jù)庫(kù)2個(gè)，去重后共1267個(gè)靶點(diǎn)。將小青龍湯活性成分靶點(diǎn)和CB疾病靶點(diǎn)導(dǎo)入Venny 2.1.0分析工具，獲得共有靶點(diǎn)261個(gè)。結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 小青龍湯治療CB 的靶點(diǎn)韋恩圖

2.3 小青龍湯治療CB 的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心靶點(diǎn)的篩選

在 STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)獲得共有靶點(diǎn)的蛋白相互作用數(shù)據(jù)信息，將其與活性成分信息導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件中繪制PPI網(wǎng)絡(luò)。PPI網(wǎng)絡(luò)中共有260個(gè)節(jié)點(diǎn)（靶基因），通過(guò)4703條邊發(fā)生相互作用，舍棄1個(gè)獨(dú)立基因靶點(diǎn)MYLK2，得到小青龍湯治療CB的活性成分108 個(gè)，按Degree值排名取前20 位，結(jié)果見(jiàn)表1。按DC≥2×DC中位數(shù)，BC和CC大于或等于其中位數(shù)，篩選得到最終核心靶點(diǎn)53個(gè)，結(jié)果見(jiàn)表2、圖2。節(jié)點(diǎn)大小及顏色亮度與Degree值成正比，圓點(diǎn)越大，顏色越深，說(shuō)明Degree值越大，靶點(diǎn)與靶點(diǎn)之間的相互作用越強(qiáng)。Degree值排名前10 位的為腫瘤壞死因子（TNF）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）、血清白蛋白（ALB）、IL-6、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（AKT1）、細(xì)胞腫瘤抗原p53（TP53）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白3（STAT3）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A（VEGFA），提示其可能是小青龍湯治療CB的關(guān)鍵核心靶點(diǎn)。

表2 小青龍湯治療CB 的核心靶點(diǎn)信息

圖2 小青龍湯治療CB 核心靶點(diǎn)PPI 網(wǎng)絡(luò)

2.4 小青龍湯治療CB 靶點(diǎn)GO 功能富集分析

將小青龍湯治療CB 的核心靶點(diǎn)導(dǎo)入Metascape 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行GO 功能富集分析，共獲得生物過(guò)程（BP）237 個(gè)，主要涉及炎癥反應(yīng)（inflammatory response）、細(xì)胞活化（cell activation）、免疫反應(yīng)的正向調(diào)節(jié)（positive regulation of protein phosphorylation）、蛋 白 質(zhì) 磷 酸 化（protein phosphorylation）等過(guò)程；細(xì)胞組成（CC）107 個(gè)，主要涉及細(xì)胞頂端（apical part of cell）、受體復(fù)合物（receptor complex）、染色體（chromosome）、囊泡腔（vesicle lumen）、細(xì)胞質(zhì)核周區(qū)（perinuclear region of cytoplasm）等；分子功能（MF）109個(gè)，主要涉及蛋白激酶活性（protein kinase activity）、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合（protein domain specific binding）、內(nèi)肽酶活性（endopeptidase activity）、細(xì)胞因子受體結(jié)合（cytokine receptor binding）等。將分析數(shù)據(jù)導(dǎo)入GraphPad Prism9.3.1軟件中，獲取GO功能富集分析圖。結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 小青龍湯治療CB 核心靶點(diǎn)GO 功能富集分析

2.5 小青龍湯治療CB 靶點(diǎn)KEGG 通路富集分析

將小青龍湯治療CB 的核心靶點(diǎn)導(dǎo)入Metascape 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行KEGG功能富集分析，共有182條通路信息，主要涉及癌癥通路（pathways in cancer）、鈣信號(hào)通路（calcium signaling pathway）、神經(jīng)活性配體-受體相互作用（neuroactive ligand-receptor interaction）、NF-κB信號(hào)通路（NF-kappa B signaling pathway）、中性粒細(xì)胞胞外陷阱形成（neutrophil extracellular trap formation）、壞死性凋亡（necroptosis）等信號(hào)通路。將排名前20條通路數(shù)據(jù)導(dǎo)入微生信分析工具，進(jìn)行可視化。結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 小青龍湯治療CB 核心靶點(diǎn)KEGG 通路富集分析

2.6 小青龍湯有效活性成分與核心靶點(diǎn)分子對(duì)接

取小青龍湯排名前10 位的核心靶點(diǎn)和排名前10 位的有效活性成分，利用AutoDock Tools 1.5.7 軟件進(jìn)行分子對(duì)接，結(jié)果見(jiàn)圖5。數(shù)值大小和顏色深淺代表結(jié)合的能量強(qiáng)弱，數(shù)值越小，顏色越深，結(jié)合需要的能量越小，發(fā)生相互作用的可能性越大。結(jié)合能≤-5.0 kJ/mol表示結(jié)合性能良好。11-甲氧基胡蔓藤堿乙（11-methoxyhumantenine）與GAPDH、AKT1 對(duì) 接能 量 分 別 為-9.1 kcal/mol、-9.4 kcal/mol；3-甲氧基草棉黃素（3-Methoxyherbacetin）與GAPDH、AKT1 對(duì) 接 能 量 分 別 為-9.0 kcal/mol、-9.2 kcal/mol。對(duì)以上4組結(jié)果進(jìn)行可視化，結(jié)果見(jiàn)圖6。

圖5 小青龍湯排名前10 位核心靶點(diǎn)和有效活性成分分子對(duì)接熱圖

圖6 分子對(duì)接模式圖

3 討 論

通過(guò)小青龍湯治療CB的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)信息，獲得排名前10位的有效活性成分為1-（3H）異苯并呋喃酮、11-甲氧基胡蔓藤堿乙、3-甲氧基草棉黃素、醋酸、醋酸法呢醇、鄰苯二甲酸二丁酯、7-去甲基軟木花椒素、2-十五烷酮、α-亞麻酸以及1-苯基-1，2-丙二酮，這10種有效成分都是麻黃中的成分，醋酸是麻黃和桂枝共有的成分，鄰苯二甲酸二丁酯既屬于麻黃、桂枝，又屬于甘草、干姜，證實(shí)麻黃是小青龍湯的君藥以及麻黃多成分、多靶點(diǎn)藥理作用的特點(diǎn)，說(shuō)明麻黃治療肺系疾病除麻黃堿和偽麻黃堿以外，可能其他成分也發(fā)揮重要作用。1-（3H）異苯并呋喃酮屬于異苯并呋喃酮衍生物中的一種，具有抗菌和抗氧化活性[10]。

通過(guò)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)信息，得到前10個(gè)核心靶點(diǎn)，包括TNF、GAPDH、ALB、IL-6、AKT1、TP53、IL-1β、EGFR、STAT3、VEGFA。TNF是免疫系統(tǒng)重要的細(xì)胞因子，TNF信號(hào)通路的激活與細(xì)胞凋亡、細(xì)胞成活、炎癥反應(yīng)和免疫功能等生物過(guò)程密切相關(guān)[11]。IL-6是白細(xì)胞介素-6的基因靶點(diǎn)，常參與炎癥反應(yīng)、體液免疫反應(yīng)[12]，參與急性炎癥反應(yīng)的積極調(diào)節(jié)，是細(xì)胞急性期反應(yīng)的有效誘導(dǎo)劑[13]。AKT1參與細(xì)胞對(duì)表皮生長(zhǎng)因子和神經(jīng)生長(zhǎng)因子刺激的反應(yīng)、細(xì)胞增殖及細(xì)胞凋亡等過(guò)程[14-15]。GAPDH主要參與體液免疫反應(yīng)和NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)等[16-17]。

鄭爽等[18-19]研究認(rèn)為小青龍湯治療慢性腎小球腎炎（CGN）主要涉及TNF信號(hào)通路、磷脂酰肌醇3-激酶/絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（PI3K/AKT）信號(hào)通路、VEGFA信號(hào)通路，這與本研究結(jié)果有共同之處。通過(guò)這些共有靶點(diǎn)通路，或許可以闡述小青龍湯“異病同治”及中醫(yī)“肺腎相關(guān)”的機(jī)理。

通過(guò)對(duì)小青龍湯治療CB的靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能富集分析發(fā)現(xiàn)，靶點(diǎn)主要與細(xì)胞炎癥反應(yīng)、細(xì)胞活化、細(xì)胞免疫反應(yīng)等過(guò)程有關(guān)。KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，小青龍湯治療CB的相關(guān)信號(hào)通路主要涉及NF-κB信號(hào)通路、中性粒細(xì)胞胞外陷阱形成、壞死性凋亡等。NF-κB是一個(gè)高度保守的轉(zhuǎn)錄因子家族，調(diào)節(jié)許多重要的細(xì)胞行為，特別是炎癥反應(yīng)、細(xì)胞生長(zhǎng)和凋亡[20]，涉及癌癥、關(guān)節(jié)炎和哮喘等疾病[21]。中性粒細(xì)胞是人體抵御微生物病原體的第一道防線(xiàn)，同時(shí)可介導(dǎo)組織損傷和無(wú)菌性炎癥。在其啟動(dòng)時(shí)，會(huì)釋放中性粒細(xì)胞胞外陷阱以限制病原體傳播并殺死微生物[22]。因此NF-κB信號(hào)通路、中性粒細(xì)胞胞外陷阱形成、壞死性凋亡等信號(hào)通路的表達(dá)可能與慢性支氣管炎的炎癥反應(yīng)和免疫功能密切相關(guān)。

4 結(jié) 論

通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接研究，推測(cè)小青龍湯治療CB的作用機(jī)制可能是小青龍湯中的11-甲氧基胡蔓藤堿乙、3-甲氧基草棉黃素、7-去甲基軟木花椒素等有效成分作用于A(yíng)KT1、GAPDH、IL-6、TNF等關(guān)鍵靶點(diǎn)，進(jìn)而對(duì)NF-κB信號(hào)通路、中性粒細(xì)胞胞外陷阱形成、壞死性凋亡等信號(hào)通路進(jìn)行調(diào)控而產(chǎn)生療效。同時(shí)，也提示小青龍湯基于多成分、多靶點(diǎn)、多通路治療慢性支氣管炎的特點(diǎn)，因此有必要繼續(xù)對(duì)其機(jī)理進(jìn)行更深入的研究和驗(yàn)證。