金鎖固精丸加味方對鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病腎病大鼠的保護作用研究

溫紫凌，梁謀

1. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東 廣州 510006

2. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)順德醫(yī)院，廣東 佛山 528300

糖尿病腎病以蛋白尿為主要臨床癥狀，而蛋白質(zhì)屬于人體的“精微”，蛋白尿的形成，即精微的外溢，與脾腎虧虛、腎氣不固、精氣外泄關(guān)系密切[1]，金鎖固精丸加味方是在金鎖固精丸的基礎(chǔ)上進行加減形成的經(jīng)驗方，目前臨床觀察對減少腎性蛋白尿有較好的療效。對臨床常見的糖尿病腎病的療效如何，尚待進一步研究。目前，相關(guān)研究表明，高糖環(huán)境下雷帕霉素可抑制腎小球系膜增殖，減少腎小球肥大的發(fā)生，進而有效抑制并改善糖尿病腎病的惡化進程[2]。本研究通過該方對大鼠糖尿病腎病模型的治療，并與雷帕霉素相對比，觀察并評估金鎖固精丸加味方對糖尿病腎病大鼠治療作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物雄性SPF 級SD 大鼠100 只[合格證號：XCXK（粵）2018-0002]，體質(zhì)量90～110 g，日齡28～30 d，均購于廣東省實驗動物中心。實驗于廣東省第二中醫(yī)院（廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院）SPF 級動物實驗室進行并通過倫理審查（編號：048582），恒溫25 ℃左右，12 h 光照/12 h 無光照環(huán)境，飲水充足。

1.2 試劑及飼料pH4.5 無菌枸櫞酸緩沖液（C0013，500 mL/瓶）、鏈脲佐菌素（S8050，1 g/瓶）均購于中國武漢駿泰生物技術(shù)有限公司。高糖高脂飼料（成分百分比為：蛋白質(zhì)20%，碳水化合物35%，脂肪45%）購自中國常州鼠一鼠二生物科技有限公司。常規(guī)飼料由廣東省實驗動物中心提供[SPF 級實驗動物飼料，成分：粗蛋白≥180 g/kg，粗纖維≤50 g/kg，粗脂肪≥40 g/kg]。

1.3 藥物金鎖固精丸加味方顆粒劑配方：沙苑子、金櫻子、芡實、蓮子、茯苓、太子參各15 g，柴胡、五味子各12 g，龍骨、牡蠣各20 g，黃芪30 g，玉米須、澤瀉各10 g，水蛭3 g。均為顆粒劑，全部由廣東一方制藥有限公司生產(chǎn)。西羅莫司（雷帕霉素）口服溶液由杭州中美華東制藥有限公司生產(chǎn)（國藥準(zhǔn)字H20051081，50 mL∶50 mg/瓶）。

1.4 實驗分組實驗分為5 組，分別為正常對照組（SD 大鼠，飲用水灌胃）、模型對照組（造模后飲用水灌胃）、中藥常規(guī)劑量組（中藥標(biāo)準(zhǔn)劑量12.78 g/kg體質(zhì)量，灌胃）、中藥加倍劑量組（中藥加倍劑量25.56 g/kg 體質(zhì)量，灌胃）、雷帕霉素組（雷帕霉素劑量0.5 mg/kg 體質(zhì)量，灌胃）。

1.5 大鼠造模及喂養(yǎng)將100 只SD 大鼠（200±20）g健康SPF 級雄性SD 大鼠，隨機分為正常對照組（n=20），糖尿病腎病造模組（n=80）。糖尿病腎病造模組采用高糖高脂飼料喂養(yǎng)1 個月，聯(lián)合腹腔注射鏈脲佐菌素2 次。用無菌枸櫞酸緩沖液（0.1 mol/L，pH4.5）配置成8 mg/mL 鏈脲佐菌素溶液，首次鏈脲佐菌素注射量為30 mg/kg 體質(zhì)量，注射后觀察大鼠狀態(tài)，并取尾部血測量血糖，1 周后再次腹腔注射鏈脲佐菌素35 mg/kg 體質(zhì)量。成模標(biāo)準(zhǔn)定為72 h 后測空腹血糖（FBG）＞16.7 mmol/L（每天尾尖取血測量）。正常對照組用常規(guī)飼料喂養(yǎng)1 個月結(jié)合腹腔注射枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩沖液（0.1 mol/L，pH4.5），注射量與造模組相當(dāng)容積。糖尿病腎病大鼠造模成功后，所有正常對照組及糖尿病腎病造模組的大鼠改為常規(guī)飼料繼續(xù)飼養(yǎng)。

1.6 干預(yù)方法將金鎖固精丸加味方用溫開水溶解，使得中藥濃度1.278 g/mL。按中國成人標(biāo)準(zhǔn)體質(zhì)量60 kg 的人的劑量每天1 劑，即生藥總量為210 g。參考《藥理實驗方法學(xué)》[3]，換算人-大鼠的金鎖固精丸加味方口服標(biāo)準(zhǔn)劑量：大鼠的劑量為12.78 g/kg體質(zhì)量[等效計量換算公式：D1=D2×R1/R2×（W2/W1）1/3，D1 是大鼠每公斤體質(zhì)量用藥劑量，D2 是人每千克體質(zhì)量用藥劑量，R1 是人的體型系數(shù)，R2 是大鼠體型系數(shù)，W1 為大鼠體質(zhì)量，W2 為成人的體質(zhì)量按60 kg 計算]。將成模型的糖尿病腎病大鼠隨機分為4 組，其中中藥常規(guī)劑量組按正常人的標(biāo)準(zhǔn)藥量換算大鼠的標(biāo)準(zhǔn)劑量為12.78 g/kg 體質(zhì)量，按大鼠體質(zhì)量取中藥劑量并灌胃；中藥加倍劑量組使用加倍劑量25.56 g/kg 體質(zhì)量，按大鼠體質(zhì)量取中藥劑量并灌胃；雷帕霉素組則先將雷帕霉素用飲用水配置成0.05 mg/mL 的溶液，按0.5 mg/kg 體質(zhì)量，灌胃（根據(jù)預(yù)實驗，按1 mg/kg 體質(zhì)量用藥，大鼠死亡較多，遂合適劑量為0.5 mg/kg 體質(zhì)量）；模型對照組則使用飲用水灌胃。余下正常對照組予相當(dāng)容積飲用水灌胃。造模成功當(dāng)天即用藥物治療，連續(xù)給藥12 周。

1.7 相關(guān)生化指標(biāo)檢測方法血液檢驗：分別在用藥前、用藥后12 周（實驗結(jié)束）于眼內(nèi)眥靜脈取血，送廣州金域醫(yī)學(xué)檢驗中心檢測FBG、血尿素氮（BUN）、血肌酐（SCr）、總膽固醇（TC）及白蛋白（Alb）；尿液檢驗：用代謝籠留取24 h 尿液，送廣州金域醫(yī)學(xué)檢驗中心查24 h 尿白蛋白定量（24 hUAlb）。

1.8 大鼠腎臟組織光鏡、電鏡檢查蘇木素-伊紅（HE）染色光鏡：新鮮腎組織固定于4%多聚甲醛，石蠟包埋切片，PAS 染色，光學(xué)顯微鏡下觀察腎組織病理改變；電鏡：新鮮腎組織取樣1 mm3大小，2.5%戊二醛電鏡固定液固定后，再以0.1 mol/L 磷酸緩沖液（PBS）（pH7.4）配制的1%鋨酸避光室溫固定，滲透包埋，超薄切片，染色，透射電子顯微鏡下觀察，采集圖像分析。觀察各組大鼠腎組織病理變化。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法各組生化指標(biāo)數(shù)值以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，用SPSS27.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進行正態(tài)性檢驗和方差齊性檢驗。本次研究各組數(shù)據(jù)全部符合正態(tài)分布（P＞0.05），多組間比較采用單因素方差分析（ANOVA）檢驗。方差齊時采用LSD 法，方差不齊時采用蓋姆斯-豪厄爾法。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠實際入組數(shù)量及造模前血清及尿液生化指標(biāo)比較見表1。造模前行血清及尿液生化指標(biāo)檢測，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。造模前擬定糖尿病腎病造模組80 只，其中72 只大鼠造模成功，8 只大鼠注射鏈脲佐菌素后血糖仍未達到16.7 mmol/L，予以剔除，成模率為90%。將72 只糖尿病腎病大鼠分成中藥常規(guī)劑量組（n=18）、中藥加倍劑量組（n=18）、雷帕霉素組（n=18）、模型對照組（n=18）。6 只造模組大鼠在藥物治療過程中死亡，包括中藥常規(guī)劑量組1 只，中藥加倍劑量組1 只，雷帕霉素組2 只，模型對照組2 只，死亡率為8%；正常對照組全部存活。66 只造模組大鼠完成為時12 周的實驗，其中中藥常規(guī)劑量組17 只，中藥加倍劑量組17 只，雷帕霉素組16 只，及模型對照組16 只。

表1 各組大鼠造模前血清及尿液生化指標(biāo)比較（）

表1 各組大鼠造模前血清及尿液生化指標(biāo)比較（）

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2.2 給藥結(jié)束后各組大鼠SCr、BUN、24 hUAlb比較見表2。與正常對照組比較，造模組（包括中藥常規(guī)劑量組、中藥加倍劑量組、雷帕霉素組及模型對照組）的SCr、BUN、24 hUAlb 水平均明顯升高（P＜0.05）；模型對照組的SCr、BUN 及24 hUAlb，與中藥常規(guī)劑量組、中藥加倍劑量組及雷帕霉素組比較，均出現(xiàn)明顯升高（P＜0.05）；與雷帕霉素組比較，中藥加倍劑量組的SCr、BUN、24 hUAlb 水平顯著降低（P＜0.05），而中藥常規(guī)劑量組大鼠的SCr、BUN、24 hUAlb 無明顯差異（P＞0.05）；中藥加倍劑量組BUN 水平低于中藥常規(guī)劑量組（P＜0.05）。

表2 給藥結(jié)束后各組大鼠SCr、BUN、24 hUAlb 比較（）

表2 給藥結(jié)束后各組大鼠SCr、BUN、24 hUAlb 比較（）

注：①與正常對照組比較，P＜0.05；②與模型對照組比較，P＜0.05；③與雷帕霉素組比較，P＜0.05；④與中藥常規(guī)劑量組比較，P＜0.05

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2.3 給藥結(jié)束后各組大鼠FBG、Alb、TC 比較見表3。與正常對照組比較，造模組（包括中藥常規(guī)劑量組、中藥加倍劑量組、雷帕霉素組及模型對照組）的FBG、TC 水平明顯升高，Alb 明顯降低（P＜0.05）；與模型對照組比較，中藥常規(guī)劑量組、中藥加倍劑量組及雷帕霉素組FBG、TC 水平較低，Alb水平較高（P＜0.05）；與雷帕霉素組比較，中藥常規(guī)劑量組及中藥加倍劑量組大鼠的FBG 及Alb 水平則無明顯差異（P＞0.05），中藥常規(guī)劑量組及中藥加倍劑量組的TC 均顯著降低（P＜0.05）；中藥加倍劑量組Alb 水平與中藥常規(guī)劑量組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

表3 給藥結(jié)束后各組大鼠FBG、Alb、TC 比較（）

表3 給藥結(jié)束后各組大鼠FBG、Alb、TC 比較（）

注：①與正常對照組比較，P＜0.05；②與模型對照組比較，P＜0.05；③與雷帕霉素組比較，P＜0.05；④與中藥常規(guī)劑量組比較，P＜0.05

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2.4 各組大鼠腎臟電鏡下病理學(xué)指標(biāo)比較見表4。腎小球基底膜厚度方面，各組別間比較無明顯差異（P＞0.05）。腎臟系膜區(qū)域面積方面，與正常對照組比較，模型對照組及雷帕霉素組的系膜區(qū)平均面積明顯升高（P＜0.05）；與雷帕霉素組比較，中藥組（包括中藥常規(guī)劑量組及中藥加倍劑量組）的系膜區(qū)平均面積均下降（P＜0.05），中藥組組間比較無明顯差異（P＞0.05）。腎小球平均面積方面，與正常對照組比較，造模組（包括模型對照組、中藥組及雷帕霉素組）的腎小球平均面積均明顯增加（P＜0.05），與雷帕霉素組比較，中藥加倍劑量組的腎小球平均面積明顯下降（P＜0.05），中藥常規(guī)劑量組則無顯著差異（P＞0.05）；與中藥常規(guī)劑量組比較，中藥加倍劑量組的腎小球平均面積顯著偏小（P＜0.05）。

表4 各組大鼠腎臟電鏡下病理學(xué)指標(biāo)比較（）

表4 各組大鼠腎臟電鏡下病理學(xué)指標(biāo)比較（）

注：①與正常對照組比較，P＜0.05；②與模型對照組比較，P＜0.05；③與雷帕霉素組比較，P＜0.05；④與中藥常規(guī)劑量組比較，P＜0.05

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2.5 各組大鼠腎臟病理學(xué)改變比較見圖1～2。圖1 光鏡下結(jié)果顯示：正常對照組腎小球、腎小管未見異常。模型對照組大鼠腎臟組織可見腎小囊囊腔明顯變窄，腎小球病變，球囊粘連，毛細血管袢與近端小管粘連，足細胞增生明顯，腎小管管腔內(nèi)可見壞死、脫落的上皮細胞及細胞碎片。腎間質(zhì)見炎癥細胞浸潤。中藥常規(guī)劑量組、中藥加倍劑量組、雷帕霉素組，以上癥狀均得到改善。圖2 電鏡下結(jié)果顯示：電鏡下，正常對照組（圖2-1），血管基底膜均勻，內(nèi)皮細胞完整，管腔內(nèi)可見紅細胞，足突無融合，系膜區(qū)結(jié)構(gòu)未見增生。中藥常規(guī)劑量組（圖2-2），血管基底膜均勻，內(nèi)皮細胞損傷，管腔內(nèi)可見紅細胞，足突融合較多。未見系膜基質(zhì)和系膜細胞增生。中藥加倍劑量組（圖2-3），視野中血管基底膜均勻，內(nèi)皮細胞有輕微損傷，管腔內(nèi)可見紅細胞，足突融合較多，系膜區(qū)結(jié)構(gòu)正常，未見系膜基質(zhì)和系膜細胞增生。雷帕霉素組（圖2-4），血管基底膜均勻，內(nèi)皮細胞有輕微損傷，管腔內(nèi)可見紅細胞，足突局部融合，系膜區(qū)結(jié)構(gòu)見系膜基質(zhì)增生和系膜細胞輕微增生。模型對照組（圖2-5），視野中血管基底膜不均勻，見免疫復(fù)合物沉積，內(nèi)皮細胞損傷，管腔內(nèi)可見紅細胞，足突融合，系膜區(qū)結(jié)構(gòu)可見系膜基質(zhì)和系膜細胞增生。綜上，雷帕霉素組及中藥組均可有效抑制基底膜、系膜基質(zhì)和系膜細胞增殖，從而改善腎功能，改善糖尿病腎病患者癥狀。

圖1 各組大鼠腎組織病理形態(tài)學(xué)改變（PAS，×400）

圖2 各組大鼠腎組織病理形態(tài)學(xué)改變（透射電鏡檢測，×10 000）

3 討論

糖尿病腎病主要癥狀為蛋白尿及腎功能損傷，為基因與環(huán)境兩者影響下形成的疾病[4]。炎性因子增加、氧化應(yīng)激反應(yīng)增加、腎臟灌注不足、缺氧和腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)的影響均導(dǎo)致糖尿病腎病的發(fā)病[5]。脂代謝紊亂可導(dǎo)致進一步損傷腎功能，同時腎病的進展又與加重血脂紊亂關(guān)系密切，目前考慮血脂異常加重可能增加炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生[6]。并且高血糖環(huán)境下，氧化應(yīng)激反應(yīng)加強[7]，腎小球系膜細胞異常增殖，分泌細胞因子，系膜基質(zhì)增生，導(dǎo)致腎小球肥大及基膜增生，腎小球呈彌漫性損害，進而出現(xiàn)腎小球硬化[8]。以上均是糖尿病腎病的發(fā)病因素。

目前，中醫(yī)根據(jù)糖尿病腎病的癥狀，命名為水腫、虛勞、關(guān)格等。腎主開闔，腎臟對精微的固守，源于腎氣的充足。若久病及腎，腎氣虛衰，腎臟封藏之功減退，蛋白質(zhì)等精微可經(jīng)過尿液外溢于人體[1]。仝小林教授等[9]認為糖尿病腎病以氣虛為主，標(biāo)以瘀和濁為主要體現(xiàn)。因此，以益氣固澀、化瘀降濁辨證論治，是中醫(yī)治療糖尿病腎病的重中之重。金鎖固精丸加味方具有健脾益氣、補腎固澀、利水祛瘀的功效。沙苑子、五味子、金櫻子、芡實等四者補腎固澀利水，付璐等[10]認為沙苑子總黃酮可抑制甘油三酯合成，改善血脂代謝以延緩慢性腎臟病的惡化。芡實-金櫻子藥對可起到益腎固精縮尿的作用。金櫻子中的槲皮素，可以抑制血管內(nèi)皮生長因子的分泌，達到抗凋亡及保護腎功能的作用。而芡實富含β-胡蘿卜素及維生素E 等抗氧化活性因子，通過抗氧化起到腎臟保護的治療作用[11]。相關(guān)研究表明，五味子乙素可下調(diào)腎臟高遷移率族蛋白B1（HMGB1）和Toll 樣受體4（TLR4）的表達，進而降低HMGB1、TLR4、白細胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等細胞因子和炎癥介質(zhì)的分泌，進而達到保護糖尿病腎病患者腎功能的功效[7]。蓮子的核心成分為多酚及阿樸啡類生物堿，均可抗自由基，抑制氧化反應(yīng)，從而減少對細胞膜的損傷。并利用其抗聚、抗凝的作用，抑制血栓形成，維持腎臟血流動力學(xué)的穩(wěn)定[12]。玉米須具有利濕消腫之功，玉米須多糖不僅能調(diào)控血糖，還可明顯減少24 hUAlb，減輕腎損傷，降低血脂水平。此外，玉米須提取物可下調(diào)腎臟轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1）的表達，阻礙腎小球系膜區(qū)增生，減少炎性介質(zhì)的產(chǎn)生[13]。黃芪、柴胡有補腎固攝、益氣扶正、升舉陽氣的功效。黃芪甲苷可利用NLRP3/Caspase-1 通路，抑制腎間質(zhì)纖維化[14]。柴胡皂苷A 可保護糖尿病大鼠自噬活性，提高腎臟還原型谷胱甘肽（GSH）水平，增強超氧化物歧化酶（SOD）活性，通過恢復(fù)自噬能力和增強抗氧化能力以保護腎功能[15]。龍骨與牡蠣，平肝潛陽、補腎收斂。太子參益氣健脾生津，肥胖的糖尿病腎病患者體內(nèi)的大量脂肪細胞會導(dǎo)致胰島素抵抗，而太子參環(huán)肽E 可加快分化3T3-L1 前脂肪細胞，通過提高脂肪組織的胰島素敏感性，加強脂肪細胞攝取葡萄糖的作用，達到調(diào)控機體血糖的目的[16]。茯苓健脾淡滲，澤瀉利水滲濕，茯苓-澤瀉此藥對可增強利水除濕之功，通調(diào)水道。周小文等[17]研究表明，茯苓-澤瀉可下調(diào)肝組織AQP8 和AQP9 mRNA 的表達，進而改善脂代謝紊亂。水蛭功效為活血化瘀，腎組織JAK2/STAT1/STAT3 信號通路可介導(dǎo)腎臟的炎性反應(yīng)，水蛭凍干粉可通過糖尿病腎病大鼠的抗氧化，抑制炎癥介質(zhì)，從而降低蛋白尿水平，發(fā)揮改善腎功能的重要作用[18]。綜合上述藥物的藥理作用，金鎖固精丸加味方對糖尿病腎病的良好治療效果可能與抑制通路活化、減少蛋白尿、提高胰島素敏感性、清除自由基、下調(diào)炎癥因子、抑制腎小球系膜區(qū)域增生及調(diào)節(jié)脂代謝等作用有關(guān)。

綜上，經(jīng)金鎖固精丸加味方干預(yù)后，可改善糖尿病腎病大鼠血糖、血脂、腎功能、蛋白尿、血清Alb 水平，改善腎小球肥大，阻礙腎小球系膜區(qū)域增殖，抑制腎組織病理惡化。在糖尿病腎病大鼠的生化指標(biāo)方面，金鎖固精丸加味方及雷帕霉素均可改善糖尿病大鼠SCr、BUN、24 hUAlb、TC、FBG、Alb水平。與雷帕霉素比較，不同劑量的金鎖固精丸加味方均可進一步降低糖尿病腎病大鼠的SCr、BUN、24 hUAlb、TC 水平，但與中藥常規(guī)劑量組比較，中藥加倍劑量組在改善SCr、BUN、24 hUAlb 水平方面更有優(yōu)勢。提示與雷帕霉素比較，金鎖固精丸加味方在降低糖尿病腎病大鼠的SCr、BUN、24 hUAlb 方面更有效，但呈劑量依賴性。在糖尿病腎病大鼠的腎臟組織病理表現(xiàn)中，其具體表現(xiàn)為：抑制系膜基質(zhì)和系膜細胞的增生方面，對比雷帕霉素，金鎖固精丸加味方在不同劑量下均效用更佳；在抑制腎小球肥大方面，對比雷帕霉素組及常規(guī)劑量組，加倍劑量的金鎖固精丸加味方更有優(yōu)勢，而常規(guī)劑量的金鎖固精丸加味方與雷帕霉素對比，其效用無顯著差異。提示不同劑量的金鎖固精丸加味方均可顯著抑制糖尿病腎病大鼠的腎小球系膜區(qū)域增生，而加倍劑量的金鎖固精丸加味方可顯著改善腎小球肥大，呈劑量依賴性。