卓資熏雞致腐菌群多樣性分析

楊茹艷，李春雨，郭亞男，高 麗，王利利

（包頭師范學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，內(nèi)蒙古 包頭 014030）

由微生物引起的食品腐敗和污染是全球食品工業(yè)面臨的主要問題，也是各國政府對食品質(zhì)量安全與食品供應(yīng)保障的關(guān)注焦點[1]。據(jù)世界衛(wèi)生組（WHO） 報告，每年全世界約25%的食品損失是由于微生物腐敗造成的，不但給生產(chǎn)者帶來巨大經(jīng)濟壓力，還加重了社會的環(huán)境負擔(dān)[2-4]。卓資熏雞是內(nèi)蒙古自治區(qū)烏蘭察布市卓資縣的傳統(tǒng)名特禽美食，曾被譽為全國“三大名雞”之一，以其個大體肥、色澤紅潤、味道鮮美、肉質(zhì)細嫩而深受消費者喜愛[5]。為保證消費者健康，對其微生物控制變得尤為重要。由于熏雞具有豐富的蛋白質(zhì)、脂類等營養(yǎng)成分，其環(huán)境非常適宜微生物的生長繁殖，因此也極易在貯藏過程中引起腐敗變質(zhì)，導(dǎo)致熏雞的色、香、味等感官異常，甚至產(chǎn)生組胺、亞硝酸鹽等有害物質(zhì)，極大地降低了卓資熏雞的市場形象[6]。因此，探究卓資熏雞腐敗期間致腐菌群多樣性是控制細菌繁殖、延長貨架期的基礎(chǔ)。

目前在食品腐敗方面，國內(nèi)外已開展了很多相關(guān)的研究，如李潔等人[7]運用了形態(tài)學(xué)和生理生化鑒定的方法，發(fā)現(xiàn)引起半干面腐敗的致腐菌主要是芽孢桿菌屬和葡萄球菌屬，張春江等人[8]運用了微生物菌落計數(shù)方法監(jiān)測扒雞在加工過程中優(yōu)勢致腐菌群的變化等，采用的方法大多是傳統(tǒng)的微生物分離、生化鑒定等。該方法雖然簡便易操作，但會受到可培養(yǎng)的條件限制，分析的結(jié)果不能完全反映樣品中微生物群落情況。近年來，隨著高通量測序技術(shù)的迅速發(fā)展，關(guān)于食品中腐敗微生物的研究方法逐漸增多，尤其是以16S rRNA 高通量測序最為典型，是近年研究菌群多樣性的新手段。其特點是信息量大、效率高，能夠更加準(zhǔn)確、全面反映樣本的微生物群落結(jié)構(gòu)，因此該技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于微生物群落組成的分析[9]。如宋相宇等人[10]采用高通量測序技術(shù)探究不同包裝及儲存溫度對白切雞中微生物菌群結(jié)構(gòu)的影響，發(fā)現(xiàn)白切雞優(yōu)勢菌屬為假單胞菌屬。顧春濤等人[11]運用16S rRNA 高通量測序技術(shù)結(jié)合微生物培養(yǎng)分析冷鮮牛肉中的致腐菌群多樣性變化等。

利用16S rRNA 高通量測序技術(shù)快速分析食品中微生物菌群結(jié)構(gòu)已成功應(yīng)用于豬肉、雞肉等生鮮肉品中，而對于肉制品，尤其是熏雞制品的研究較少，對其致腐菌群結(jié)構(gòu)分析較少[12-14]。基于此，首次以當(dāng)?shù)貍鹘y(tǒng)特色美食卓資熏雞為研究對象，結(jié)合高通量測序技術(shù)分析腐敗過程細菌菌群組成及多樣性變化，意在分析導(dǎo)致熏雞腐敗的優(yōu)勢菌群，為熏雞制品的加工、貯藏過程中有針對性地控制微生物污染提供借鑒和參考，并且為下一步防腐保鮮提供可用的方法，從而能更好地將當(dāng)?shù)靥厣抠Y熏雞制品推廣銷售至全國，拓展銷路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

熏雞，購自內(nèi)蒙古自治區(qū)包頭市青山區(qū)張金濤熏雞總店；DNA 提取試劑盒及凝膠回收試劑盒，北京天根公司提供。

1.2 儀器與設(shè)備

超凈工作臺（HDL APPARATUS）、冰箱（Haier BCD-190TMPK）、稱量天平（Sartorius BS224S）、高速冷凍離心機（TECHCOMP CT14RD）、PCR 儀（Applied Biosystems 2720 Thermal Cycler） 等。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品的采集

將購買回來的新鮮熏雞分成大小均勻的小塊分裝于滅菌的鋁制盒中，室溫下存放在實驗室超凈工作臺中等待其腐敗變質(zhì)。

1.3.2 樣品的預(yù)處理

將放置2，5 d 后的腐敗熏雞樣品分別置于滅菌的研缽中充分研磨搗碎，分別稱取5 g 溶解于100 mL無菌水中制備成菌懸液，即獲得腐敗早期樣品（day2）和腐敗中期樣品（day5）。為了減少試驗誤差，每個處理組設(shè)置3 個平行重復(fù)樣品。

1.3.3 DNA 提取及測序

按照試劑盒說明書操作提取樣品總DNA，利用引物341F(5'-CCTACGGGNGGCWGCAG-3') 和805R(5'-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3')擴增細菌16S rRNA 基因的V3-V4 高變區(qū)，然后使用DNA 凝膠回收試劑盒對PCR 產(chǎn)物進行純化，定量后送去百邁克生物公司進行高通量測序。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

首先將Illumina PE250 平臺測序得到的PE reads根據(jù)overlap 關(guān)系進行拼接，同時對序列質(zhì)量進行質(zhì)控和過濾，高質(zhì)量序列以97%的序列同一性聚類為可操作的分類單位（OUT）。利用QIIME 對OTU 進行測序深度的檢測及物種多樣性指數(shù)分析；利用RDP Classifier 方法和GreenGene 數(shù)據(jù)庫進行物種分類學(xué)信息分析；利用LEfSe 分析組間顯著差異的物種；采用KEGG 預(yù)測細菌功能。

2 結(jié)果與分析

2.1 序列信息統(tǒng)計

熏雞腐敗過程中細菌群落的稀釋曲線（a） 和Shannon-Wiener 多樣性曲線（b） 見圖1。

圖1 熏雞腐敗過程中細菌群落的稀釋曲線（a） 和Shannon-Wiener 多樣性曲線（b）

從樣本中共獲得了62 884～74 974 條有效序列（平均長度429 bp）。在97%的序列相似度水平下，總共獲得了225 個OTU，其中每個樣本的平均OTU數(shù)為125±7。這些OTU 被分為11 個門，19 個綱，23 個目，61 個科和128 個屬。稀疏曲線可以反映樣品的取樣深度，如圖1（a） 隨著測序深度的增加，各樣本的稀釋度逐漸趨于平緩，表明此次測序能夠反映樣本中微生物的多樣性，并且Shannon-Wiener多樣性曲線圖1（b） 顯示隨著測序數(shù)量增多，曲線趨向平坦，說明測序數(shù)據(jù)量合理，可以反映樣品中絕大多數(shù)的微生物實際情況。

熏雞腐敗過程中細菌群落在OTUs（a）、門（b）和屬（c） 水平下的韋恩圖見圖2。

圖2 熏雞腐敗過程中細菌群落在OTUs（a）、門（b） 和屬（c） 水平下的韋恩圖

在OTU 水平上，腐敗早期（day2） 和腐敗中期（day5） 樣本共有OTU 為138 個，而早期特有的OTU 為47 個，中期特有的OTU 為42 個（圖2（a））；在門水平上，2 個時期樣本共有門為10 個，而特有的門只有1 個存在于腐敗中期樣品中（圖2（b））；在屬水平上，2 個時期樣本共有屬為73 個，而早期特有的屬為30 個，中期特有的屬為25 個（圖2（c）），表明了腐敗早、中期樣品群落組成存在差異。

2.2 a 多樣性和β 多樣性分析

熏雞腐敗過程中細菌群落的α 多樣性分析見圖3。

圖3 熏雞腐敗過程中細菌群落的α 多樣性分析

采用α 多樣性指標(biāo)Chao1、ACE 和Shannon 指數(shù)分析不同腐敗時期細菌群落分布的豐富度和多樣性。腐敗早期（day2） 和腐敗中期（day5） 樣本中細菌的α 多樣性指數(shù)除了Chao1 指數(shù)（157.215 9±36.47 和176.536 8±43.87，p=0.28） 差異不明顯外，其他指數(shù)ACE 指數(shù)（157.778 7±32.64 和202.737 4±37.69，p=0.042） 和Shannon 指數(shù)（2.388 7±1.45 和3.443 4±0.78，p=0.002 9） 均顯示存在顯著差異，表明了不同腐敗時期樣品中的細菌群落在豐富度和多樣性上存在差異，且腐敗中期菌群的豐富度和多樣性較高。

采用β 多樣性分析來確定不同腐敗時期細菌群落組成是否存在差異，使用非加權(quán)UniFrac 距離的非度量多維尺度分析（Non-metric multidimensional scaling，NMDS） 制作散點圖。

熏雞腐敗過程中細菌群落的NMDS 分析圖見圖4。

圖4 熏雞腐敗過程中細菌群落的NMDS 分析圖

同時期的腐敗樣品存在聚類趨勢，而不同時期腐敗樣品組間存在明顯差異，表明不同腐敗時期樣本之間的細菌群落組成存在顯著差異。

2.3 不同腐敗時期細菌群落組成分析

為了分析腐敗過程中主要細菌群落組成的動態(tài)變化，選取樣本中豐度大于1%的細菌進行聚集信息統(tǒng)計。

熏雞腐敗過程中細菌群落在在門（a） 和屬（b）水平物種豐度柱狀圖見圖5。

圖5 熏雞腐敗過程中細菌群落在在門（a） 和屬（b） 水平物種豐度柱狀圖

基于門水平的分析結(jié)果如圖5（a），各組樣本共鑒定出9 個門，其中平均相對豐度大于1%的菌門有厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）和放線菌門（Actinobacteria），前2 個門在每個樣本中都占主導(dǎo)地位，平均累積占比可達97.72%，說明熏雞腐敗過程的絕對優(yōu)勢菌門為厚壁菌門和變形菌門。同時發(fā)現(xiàn)隨著腐敗時間的變化，細菌群落的豐度在門水平上呈現(xiàn)動態(tài)變化，從早期變形菌門為主變成了中期以厚壁菌門為主，早期放線菌門豐度僅占0.02%到中期上升至4.27%。

基于屬水平的分析結(jié)果如圖5（b），各組樣本共鑒定出74 個屬，其中平均相對豐度大于1%的菌屬有7 個，為不動桿菌屬（Acinetobacter）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、未經(jīng)培養(yǎng)的腸桿菌屬細菌（Uncultured Bacterium f Enterobacteriaceae）、賴氨酸芽孢桿菌屬（Lysinibacillus）、巨球菌屬（Macrococcus） 和谷氨酸桿菌屬（Glutamicibacter）。其中，前4 個屬在每個樣本中都占主導(dǎo)地位，平均累積占比為82.09%，說明熏雞腐敗過程的優(yōu)勢菌屬為不動桿菌屬、葡萄球菌屬、芽孢桿菌屬和未經(jīng)培養(yǎng)的腸桿菌屬細菌。同時發(fā)現(xiàn)在腐敗過程中細菌的相對豐度在屬水平上變化更加明顯：從早期以不動桿菌屬占比最高變成了中期以葡萄球菌屬占比最高，早期的巨球菌屬（豐度9.27%） 也被中期的賴氨酸芽孢桿菌屬（豐度17.02%） 和谷氨酸桿菌屬（豐度3.60%） 取代成為新的優(yōu)勢腐敗菌屬。

2.4 不同腐敗時期細菌群落組間差異分析

使用LEfSe 分析腐敗早期（day2） 及中期（day5）樣品之間細菌組成的差異性。

熏雞腐敗過程中細菌群落組間LEfSe 差異分析統(tǒng)計見圖6。

圖6 熏雞腐敗過程中細菌群落組間LEfSe 差異分析統(tǒng)計

在門水平上腐敗早、中期之間差異顯著的微生物有4 個，腐敗早期樣品中相對豐度較高的差異物種是變形菌門（Proteobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidete），腐敗中期樣品中相對豐度較高的差異物種是厚壁菌門（Firmicutes）、放線菌門（Actinobacteria） （LDA＞2.0，p＜0.05）。在屬水平上腐敗早、中時期之間差異顯著的微生物有23 個，腐敗早期樣品中相對豐度較高的差異物種是不動桿菌屬（Acinetobacter）、巨球菌屬（Macrococcus）、魏斯氏菌屬（Weissella）、腸球菌屬（Enterococcus）、普雷沃菌屬（Prevotella）、產(chǎn)糞甾醇真細菌（Eubacterium coprostanoligenes group）、鹽單胞菌（Halomonas）、擬桿菌屬（Bacteroides） 等共9 個，腐敗中期樣品中相對豐度較高的差異物種是賴氨酸芽孢桿菌屬（Lysinibacillus）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）、未經(jīng)培養(yǎng)的腸桿菌屬細菌（Uncultured Bacterium f Enterobacteriaceae）、谷氨酸桿菌屬（Glutamicibacter）、乳球菌屬（Lactococcus）、棒桿菌屬（Corynebacterium）、嗜冷桿菌屬（Psychrobacter）、羅氏菌屬（Rothia）、考克氏菌屬（Kocuria）、微球菌屬（Micrococcus） 等共18 個。

2.5 不同腐敗時期細菌群落功能預(yù)測分析

利用KEGG 數(shù)據(jù)庫對不同腐敗時期細菌群落功能進行預(yù)測。

熏雞腐敗過程中細菌群落功能預(yù)測KEGG 圖見圖7。

圖7 熏雞腐敗過程中細菌群落功能預(yù)測KEGG 圖

從組成上看，腐敗早期（day2） 和中期（day5）樣品中的細菌群落參與代謝途徑基本相同，可歸為七大類，包括遺傳信息處理（Genetic Information Processing）、生物體系統(tǒng)（Organismal Systems）、代謝（Metabolism）、人類疾?。℉uman Diseases）、細胞過程（Cellular Processes）、環(huán)境信息處理（Environmental Information Processing） 和 未 分 類 的 功 能（Other）；從豐度上看，代謝是腐敗過程中細菌的主要功能，其次為環(huán)境信息處理和遺傳信息處理，體現(xiàn)了微生物應(yīng)對環(huán)境變化的基因調(diào)控功能（圖7（a））。隨后比較腐敗早、中期組間菌群在代謝途徑上的變化和差異（圖7（b）），除未分類的功能外，其他六大類代謝通路均具有顯著差異（p＜0.05），推測主要與菌落結(jié)構(gòu)發(fā)生更替與豐度變化有關(guān)。

3 討論

卓資熏雞作為內(nèi)蒙古中西部地區(qū)的傳統(tǒng)名食，已有近百年的歷史，是人們喜愛的熏肉制品[15]。其通過傳統(tǒng)的配方調(diào)制和特殊的鹵制、熏制工藝，使熏雞在具有獨特風(fēng)味的同時也極大地降低了微生物濃度，起到很好地防腐作用[16]。但在熏雞后期貯藏、銷售、運輸?shù)拳h(huán)節(jié)又很容易受到微生物污染，而微生物污染是食品腐敗變質(zhì)的主要原因。

目前，關(guān)于雞肉類食品中腐敗菌研究多集中在冰鮮雞肉上，如賴宏剛等人[17]發(fā)現(xiàn)冷鮮雞的腐敗菌以假單胞菌、乳酸菌為主，而在雞肉制品上研究較少，只有關(guān)于一些鹵雞制品的研究，如湯敏等人[18]發(fā)現(xiàn)冷藏過程中的德州扒雞主要腐敗菌為假單胞菌屬、腸桿菌屬、葡萄球菌屬等，對熏雞制品腐敗菌的研究報道更是很少。因此，利用高通量測序技術(shù)首次對卓資熏雞致腐菌群多樣性進行研究，發(fā)現(xiàn)在腐敗過程中豐度較高的2 個門：厚壁菌門和變形菌門，以及4 種優(yōu)勢致腐菌：不動桿菌屬、葡萄球菌屬、芽孢桿菌屬和未經(jīng)培養(yǎng)的腸桿菌屬，而在以往的研究中發(fā)現(xiàn)這些菌多見于肉類食品中[19-22]。值得注意的是在研究中發(fā)現(xiàn)的假單胞菌屬豐度極低，可能是由于不同溫度導(dǎo)致樣品腐敗的優(yōu)勢腐敗菌不同[23]。同時，在腐敗過程中還發(fā)現(xiàn)一些病原菌，如腸球菌屬、普雷沃菌屬、擬桿菌屬、棒桿菌屬、羅氏菌屬等，因此加強微生物控制，保證食品安全是十分重要的。

隨后探究熏雞腐敗過程中細菌群落的動態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)不同腐敗時期的菌群組成及多樣性存在顯著差異，可能原因是隨著腐敗時間的延長，微生物也在不斷適應(yīng)新環(huán)境，一些優(yōu)勢細菌易適應(yīng)環(huán)境而大量繁殖，在數(shù)量與比例上占絕對優(yōu)勢，而一些細菌所占比例減少或不再繁殖。隨后針對其中腐敗早、中期菌群的差異物種進行分析，發(fā)現(xiàn)在腐敗早期相對豐度較高的差異菌，如巨球型菌屬、魏斯菌屬、腸球菌屬、普雷沃菌屬、擬桿菌屬等均是厭氧菌，到了腐敗中期這些菌可能由于好氧菌的大量繁殖被競爭抑制，相對豐度下降；而相應(yīng)的腐敗中期相對豐度較高的差異菌多為好氧菌，如賴氨酸芽孢桿菌屬、谷氨酸棒狀桿菌屬、羅氏菌屬、考克氏菌屬、棒桿菌屬、微球菌屬等。其中，賴氨酸芽孢桿菌屬和谷氨酸棒桿菌屬變化最顯著，以往研究發(fā)現(xiàn)這些菌多存在于泡菜發(fā)酵中，在腐敗過程中會產(chǎn)生不同類型的有機酸、揮發(fā)性氣體等，造成食物氣味、顏色等異常，且更能適應(yīng)后期變質(zhì)后的生存環(huán)境[24-27]。由于腐敗過程中菌落組成及豐度存在動態(tài)變化，相應(yīng)的菌群功能會發(fā)生差異性變化。利用KEGG 數(shù)據(jù)庫對腐敗早、中期細菌群落功能進行預(yù)測，發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)的細菌參與了代謝（Metabolism） 這一類別，說明在腐敗過程盡管細菌群落會發(fā)生改變，但是其主要功能通過代謝實現(xiàn)的。

4 結(jié)論

綜上所述，采用16S rRNA 高通量測序技術(shù)對卓資熏雞腐敗過程中致腐菌群組成及多樣性進行研究。結(jié)果共獲得225 個操作分類單元（OUTs），分為11個門、128 個屬，其中鑒定出了2 個絕對優(yōu)勢的致腐菌門（厚壁菌門和變形菌門） 和4 個絕對優(yōu)勢的致腐菌屬（不動桿菌屬、葡萄球菌屬、芽孢桿菌屬和未經(jīng)培養(yǎng)的腸桿菌屬）。α、β 多樣性顯示不同腐敗時期的細菌菌群組成及多樣性存在顯著差異；對其中腐敗早、中期樣品進行LEfSe 組間差異分析，發(fā)現(xiàn)在門水平上差異顯著的細菌有4 個，在屬水平差異顯著的細菌有23 個；利用KEGG 數(shù)據(jù)庫對腐敗早、中期細菌群落功能進行預(yù)測，發(fā)現(xiàn)代謝是腐敗過程中細菌最主要功能，且2 個時期的菌群在六大類代謝通路均具有顯著差異，表明食物腐敗過程中細菌群落結(jié)構(gòu)、組成及功能存在相應(yīng)的變化，呈現(xiàn)出一定的演替規(guī)律。評估了卓資熏雞腐敗過程中細菌種類的多樣性及動態(tài)變化，為熏雞制品的加工、貯藏過程中有針對性地控制微生物污染提供借鑒和參考。