基因增強骨組織工程中脂肪干細胞成骨的研究進展

郭棟,時靜,李文晉,3*

(1.山西醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院·口腔醫(yī)院,山西 太原 030001;2.天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院口腔科,天津 300070;3.山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院口腔科,山西 太原 030001)

對于外傷、腫瘤等疾病所引起的骨折,骨修復(fù)一直是一個極大的難題。傳統(tǒng)療法骨再生率低,也會造成慢性疼痛和感染[1]?；蛟鰪姽墙M織工程融合了基因治療與骨組織工程技術(shù)的優(yōu)點,在骨修復(fù)領(lǐng)域具有良好的前景。近年來脂肪干細胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)逐漸引起人們的關(guān)注,成為基因增強骨組織工程中更有前景的干細胞。本文就ADSCs在基因增強骨組織工程中的研究進展做一綜述,為后續(xù)研究提供理論支持。

1 ADSCs與骨組織工程

骨組織工程的主要目標是將種子細胞、生長因子、復(fù)合支架結(jié)合起來,產(chǎn)生模擬細胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu),促進組織修復(fù)和再生[2]。

1.1 ADSCs與生長因子 種子細胞的常規(guī)來源是骨髓間充質(zhì)干細胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs),但其應(yīng)用仍存在不少問題,如BMSCs提取時所帶來的痛苦、提取的干細胞產(chǎn)量低、干細胞特征的不穩(wěn)定、分化潛能發(fā)生變化、需要額外補充生長因子來促進成骨以及骨折的不完全愈合等[3-5]。ADSCs來源于豐富的脂肪組織,最早由Zuk等[6]在脂肪組織的血管基質(zhì)片段中分離得到。ADSCs已證明具有多系分化能力,包括成脂肪、成軟骨、成肌和成骨譜系,已在體內(nèi)用于再生脂肪、軟骨、骨以及更復(fù)雜的組織,如牙周組織和椎間盤;還可以分化為內(nèi)皮細胞,可以作為血管化骨組織工程的單細胞來源[7];它也是一種良好的基因載體細胞,易于接受基因修飾來獲得成骨誘導(dǎo)功能的定向加強[8]。在下頜骨缺損、顱骨缺損治療、膝關(guān)節(jié)、髖關(guān)節(jié)以及軟骨修復(fù)等方面均取得了較為理想的進展[9]。它的優(yōu)勢在于：(1)ADSCs占脂肪組織中有核細胞總數(shù)的5%,可以高產(chǎn)量獲得,而骨髓中的BMSCs不到0.01%;(2)ADSCs的收集程序相對簡單、無痛,且并發(fā)癥有效降低;(3)ADSCs在培養(yǎng)期間能保持較高的增殖潛能,平均群體倍增時間為2～3 d;(4)沒有遺傳改變或復(fù)制性衰老,即使是長達20代的長期培養(yǎng),也不會引起ADSCs的顯著染色體畸變,并保留其形態(tài)、免疫表型、正常分裂周期及其凋亡調(diào)節(jié)功能。冷凍保存超過10年,也不會影響它們的生存能力、分化潛能和免疫表型特征[10]。

生長因子可以誘導(dǎo)干細胞和炎癥細胞遷移到損傷部位,通過自分泌或旁分泌機制促進骨形成,這些因子也會增加瘢痕形成,加速愈合過程。目前常用的生長因子有轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)、胰島素樣生長因子-1(insulin-like growth factors-1,IGF-1)、成纖維細胞生長因子(fibroblast growth factor,FGF)等[2]。BMP-2是骨形態(tài)發(fā)生蛋白家族中最具骨誘導(dǎo)性的成員,是目前美國食品和藥物管理局(Food and Drug Administration,FDA)批準的第一個,也是唯一一個用作骨移植替代物的骨誘導(dǎo)生長因子,在堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)和骨鈣素(osteocalcin,OC)等成骨標志物的表達中起關(guān)鍵作用[11],可以顯著增強ADSCs體內(nèi)以及體外的成骨分化能力[12]。多個生長因子也可以一起轉(zhuǎn)導(dǎo),從而協(xié)同調(diào)節(jié)內(nèi)源性蛋白質(zhì)合成,增強生物活性。有學(xué)者用 IGF-1和BMP-2的構(gòu)建物轉(zhuǎn)染ADSCs,發(fā)現(xiàn)IGF-1和BMP-2驅(qū)動了ADSCs的軟骨形成,促進ADSCs分化為成熟的軟骨細胞樣細胞和形成軟骨結(jié)節(jié)[13]。

1.2 ADSCs與復(fù)合支架 支架設(shè)計目的是促進細胞增殖、存活、黏附、遷移以及加速骨重塑,其必須具有生物相容性和非細胞毒性,并且具有與骨組織相似的機械和表面性質(zhì)。

在某些情況下還可以作為生長因子或抗生素的載體材料,與生長因子結(jié)合后為生長因子提供一定的機械強度,使生長因子持續(xù)緩釋,可增加其在生物體內(nèi)的濃度,刺激細胞的黏附[14]。支架材料多分為天然聚合物、合成聚合物和陶瓷材料三種,但均存在一定的不足,其微觀結(jié)構(gòu)的變化會影響間充質(zhì)干細胞的反應(yīng),并可能改變細胞與支架表面的黏附、細胞增殖和成骨分化。目前研究人員常將兩種或者兩種以上的材料通過物理、化學(xué)混合或改性的方式來提高其力學(xué)和生物學(xué)特性,保留其各自的優(yōu)勢,以獲得良好性能[15]。

天然聚合物具有良好的生物相容性,包含特定的分子結(jié)構(gòu)域,可在細胞發(fā)育的各階段支持和引導(dǎo)細胞分泌更多相關(guān)的細胞外基質(zhì),從而增強支架與組織的相互作用。常用的天然聚合物有多糖、膠原(collagen,Col)、海藻酸鹽(sodium alginate,Alg)、透明質(zhì)酸(hyaluronic acid,HA)等材料[16]。也可添加其他誘導(dǎo)劑來增強成骨,如Wu等[17]在HA涂層孔或富含HA的纖維蛋白水凝膠中用辛伐他汀處理ADSCs可促進ADSCs的軟骨分化。天然聚合物與陶瓷材料相比質(zhì)地較軟,可適應(yīng)所需形狀的要求,但存在降解速率過快、機械性能交叉等問題,因此可與骨組織工程中其他更為堅固的材料聯(lián)合應(yīng)用。

合成聚合物是一種半結(jié)晶的可生物降解聚合物,屬于一種疏水性材料,其優(yōu)勢在于具有生物相容性、非細胞毒性、降解性能和可調(diào)節(jié)的機械性能,常用的材料有聚乳酸(polylactic acid,PLA)、聚乳酸-羥基乙酸共聚物[poly(lactic-co-glycolic acid),PLGA]和聚己內(nèi)酯(polycaprolactone,PCL)。但由于其生物活性低,影響細胞附著、骨傳導(dǎo)和骨誘導(dǎo)[18]。因此有學(xué)者將多種材料聯(lián)合應(yīng)用,如通過同軸靜電紡絲制備了PLGA/PCL-BMP-2(PP-B)纖維支架,將ADSCs種植在支架上,與傳統(tǒng)的PLGA/PCL支架在支架形態(tài)和BMP-2釋放能力方面進行了比較,發(fā)現(xiàn)復(fù)合支架顯著促進了ADSCs的增殖和成骨分化,PP-B組次之,傳統(tǒng)的PLGA/PCL支架增殖和成骨能力最差[19]。

陶瓷材料也稱為生物吸收性材料,其最大優(yōu)勢在于生物相容性好,具有合適的剛度、優(yōu)異的骨傳導(dǎo)性和骨誘導(dǎo)性、耐化學(xué)腐蝕特性,可促進生物礦化。但其脆性大,多與其他材料聯(lián)合使用,其中最常用的是β-磷酸三鈣(β-Tricalcium phosphate,β-TCP)和羥基磷灰石(hydroxyapatite,HAP)[20]。在一項BMP-2修飾的ADSCs負載于β-TCP載體植入犬尺骨缺損模型的實驗中,發(fā)現(xiàn)新形成的骨體積顯著增加,16周后缺損處的骨修復(fù)基本完成[21]。HAP也常與膠原結(jié)合,對膠原處理和BMP-2結(jié)合后的多孔HAP支架進行表面改性后對HAP支架的整體性能沒有影響,但極大的增強了HAP支架的抗壓能力。HAP、改性HAP和膠原-BMP-2功能化HAP的抗壓強度依次遞增,膠原蛋白和BMP-2的聯(lián)合應(yīng)用效果更佳[22]。Liao等[23]通過低溫法構(gòu)建明膠/HAP/BMP-2(GNB)支架,發(fā)現(xiàn)GNB支架可以通過上調(diào)早期標記蛋白Ⅰ型膠原蛋白和晚期標記蛋白骨橋蛋白,使得ADSCs堿性磷酸酶活性和礦化程度的升高,達到較為理想的成骨效應(yīng)。

2 ADSCs與基因治療

基因治療分為體內(nèi)法和體外法,體外法的原理是通過外源性基因轉(zhuǎn)染從機體上分離出靶細胞并進行體外培養(yǎng),然后再轉(zhuǎn)移到缺損部位進行骨誘導(dǎo)修復(fù);體內(nèi)法的原理是將目的基因注入機體,使其在體內(nèi)轉(zhuǎn)染細胞并進行表達。兩種方法均可持續(xù)輸送少量、生理性強的BMP-2,大大減少所需的BMP-2數(shù)量,為機體提供持久的骨再生刺激,將不良反應(yīng)的發(fā)生率降到最低[24]。目前常用的基因?qū)胼d體包括病毒載體和非病毒載體兩大類,病毒載體如反轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒(lentiviru,Lv)、腺病毒(adenovirus,Ad)、腺相關(guān)病毒等;非病毒載體如脂質(zhì)體、陽離子多聚物、殼聚糖、無機納米粒子等[25]。

Ad具有易制備、高滴度、感染效率高、宿主細胞范圍廣、不整合至宿主細胞染色體內(nèi)、在表達時間上具有自限性、遺傳毒性低等優(yōu)點,已經(jīng)成為臨床試驗中使用率最高的一種病毒載體,占病毒載體的30.2%[26]。Dragoo等[27]首次報道了Ad介導(dǎo)的BMP-2基因轉(zhuǎn)染人類ADSCs后,體外細胞外基質(zhì)中有大量鈣的沉積;在一項治療大鼠頂骨缺損的實驗中,其成骨效率也優(yōu)于單獨應(yīng)用ADSCs[28]。

Lv具有無毒,不易誘發(fā)宿主免疫反應(yīng),所能插入的目的基因片段容量大,能感染分裂細胞、非分裂細胞和終末分化細胞(如神經(jīng)細胞、肌纖維細胞、視網(wǎng)膜細胞和肝細胞等),也能夠整合于宿主細胞基因組,理論上實現(xiàn)目的基因永久表達等優(yōu)點[29],已成為當(dāng)前基因傳遞載體研究的熱點。Virk等[30]發(fā)現(xiàn)與Ad轉(zhuǎn)導(dǎo)的BMP-2轉(zhuǎn)移相比,Lv轉(zhuǎn)導(dǎo)的BMP-2顯示了更好的骨修復(fù)趨勢。通過Lv產(chǎn)生BMP-2的BMSC在體外具有誘導(dǎo)長期蛋白質(zhì)生成的能力,并在體內(nèi)產(chǎn)生大量的新骨形成。Bougioukli等[31]首次報導(dǎo)了對BMSCs和ADSCs在Lv兩步轉(zhuǎn)錄擴增系統(tǒng)(two-step transcriptional amplification system,TSTA)轉(zhuǎn)染BMP-2(Lv-TSTA-BMP-2)成骨的研究,發(fā)現(xiàn)兩者均可快速誘導(dǎo)成骨分化,但ADSCs效果更佳。與BMSCs相比,大多數(shù)培養(yǎng)的ADSCs共同表達正確的CD標記物,ADSCs產(chǎn)生的BMP-2幾乎是BMSCs的3倍。此實驗也證實了年齡與人體脂肪抽吸物組織的細胞產(chǎn)量之間沒有關(guān)聯(lián),脂肪組織分離的細胞在所有傳代中都具有更快的細胞生長和更高的細胞產(chǎn)量。也有學(xué)者將分別轉(zhuǎn)染Lv-BMP-2和Lv-BMP-7的ADSCs單獨或聯(lián)合植入β-TCP支架上進行體外培養(yǎng),然后將ADSCs/β-TCP構(gòu)建物植入大鼠股骨缺損中6周。結(jié)果表明BMP-2和BMP-7基因共轉(zhuǎn)染組在體內(nèi)比BMP-2組和BMP-7組顯著提高了新骨形成效率[32]。

殼聚糖作為一種非病毒基因載體,具有良好的生物相容性和生物可降解性,是一種安全、易于構(gòu)建的高分子,可以保護DNA免受降解[33]。有學(xué)者評估了Lv與BMP-2/FGF-2雙基因系統(tǒng)共轉(zhuǎn)染的ADSCs的體外成骨特性,結(jié)果顯示兩種因子之間具有良好的協(xié)同作用,與單獨轉(zhuǎn)染其他因子相比具有更高的成骨指數(shù)[34]。

3 ACSDs與基因增強組織工程

基因增強組織工程是將兩者相結(jié)合的新技術(shù),選擇合適的基因轉(zhuǎn)移方式、理想的目標基因、優(yōu)化種子細胞、制備高效的轉(zhuǎn)移體系來進行骨修復(fù)。其優(yōu)勢為：轉(zhuǎn)染的細胞可持續(xù)高效地表達特定功能因子以促進其自身及其他效應(yīng)細胞的增殖與分化,從而能更好、更快地形成骨修復(fù)再生所需的組織;合成分泌的特定功能因子在缺損部位的濃度和活性更高,避免了外源性功能因子大劑量反復(fù)使用所帶來的副作用;載體的穩(wěn)定性好,半衰期長,持續(xù)時間足以滿足缺損修復(fù)再生的需要[35]。有學(xué)者將TGF-β1和BMP-2加載到殼聚糖上,然后與海藻酸鈉/透明質(zhì)酸/膠原(Alg/HA/Col)結(jié)合構(gòu)建頜骨支架,并對Alg/HA/Col頜骨支架的含水量、孔隙率、拉伸性能、生物相容性和成骨誘導(dǎo)分化能力進行了研究。發(fā)現(xiàn)該方法能夠成功構(gòu)建一種全新的三維多孔頜骨支架,其孔徑為100～250 μm,孔隙率>90%,與正常骨組織極為接近,同時對ADSCs無細胞毒性,支架的ALP定量、OC表達量均上調(diào),這種三位支架具有廣泛的應(yīng)用前景[36]。Vakhshori[37]將編碼BMP-2的Lv轉(zhuǎn)導(dǎo)ADSCs后植入TCP/HAP載體上來評估大鼠股骨缺損的療效,實驗發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)導(dǎo)Lv的BMP-2(約0.48 μg)誘導(dǎo)形成的骨質(zhì)量與10 μg重組人BMP-2相當(dāng),在平均扭矩、扭轉(zhuǎn)剛度和扭轉(zhuǎn)致骨折的力度方面與正常骨比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

4 總結(jié)與展望

ADSCs來源穩(wěn)定豐富,具有良好的成骨效應(yīng),是骨再生領(lǐng)域最有前景的種子干細胞之一。隨著基因載體的選擇性逐漸增加、復(fù)合支架的物理及化學(xué)特性,材料之間的融合技術(shù)日趨成熟,ADSCs在體外以及動物實驗中都取得了較大進展。但基因轉(zhuǎn)染后細胞在體內(nèi)的穩(wěn)定性,以及ADSCs向成骨、成軟骨分化的具體機制尚不明確,雖然偶有ADSCs應(yīng)用于臨床的治療報導(dǎo),但其安全性仍需進一步評估。