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    3種黃檀屬木材DNA條形碼識(shí)別研究

    2023-08-16 06:10:52余敏張彭俐王金波高俊蘭
    安徽農(nóng)業(yè)科學(xué) 2023年14期

    余敏 張彭俐 王金波 高俊蘭

    摘要 以降香黃檀、交趾黃檀和微凹黃檀木材為研究對(duì)象,提取木材DNA并擴(kuò)增trnL和trnS-trnG序列,比較黃檀屬候選DNA條形碼序列的擴(kuò)增和測(cè)序成功率,構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹并評(píng)價(jià)不同DNA條形碼序列的鑒定能力。結(jié)果表明:3種黃檀屬木材葉綠體編碼基因片段trnL和葉綠體基因間隔區(qū)trnS-trnG序列的PCR擴(kuò)增成功率分別為82%和59%,PCR產(chǎn)物克隆測(cè)序成功率均為100%。候選DNA條形碼序列種間的堿基變異和插入缺失數(shù)量均高于種內(nèi)?;谌~綠體編碼基因序列trnL構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹能夠成功區(qū)分3種黃檀屬木材。

    關(guān)鍵詞 黃檀屬;DNA提??;DNA條形碼;木材識(shí)別

    中圖分類號(hào) TP391.44? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A? 文章編號(hào) 0517-6611(2023)14-0099-03

    doi:10.3969/j.issn.0517-6611.2023.14.024

    作者簡(jiǎn)介 余敏(1985—),男,河南信陽(yáng)人,講師,從事木材DNA識(shí)別研究。*通信作者,副研究員,博士,從事木材生物形成研究。

    DNA條形碼技術(shù)已被證實(shí)是一種科學(xué)有效的物種識(shí)別方法,該方法具有操作簡(jiǎn)單,不受個(gè)體發(fā)育階段和形態(tài)特征的限制,鑒定快速準(zhǔn)確等諸多優(yōu)點(diǎn),極大地彌補(bǔ)了傳統(tǒng)分類學(xué)方法的不足[ 1-2]。黃檀屬木材多具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值,其非法采伐和非法木材貿(mào)易情況嚴(yán)重,采用傳統(tǒng)的木材識(shí)別方法難以準(zhǔn)確識(shí)別到種[ 3-4]。為此,筆者以市場(chǎng)上3種常見(jiàn)的黃檀屬木材為研究對(duì)象,通過(guò)提取木材標(biāo)本DNA并擴(kuò)增葉綠體編碼基因片段trnL序列和葉綠體基因間隔區(qū)trnS-trnG序列,比較黃檀屬候選DNA條形碼序列的擴(kuò)增和測(cè)序成功率,并對(duì)物種間穩(wěn)定的變異位點(diǎn)進(jìn)行分析,采用NJ樹法評(píng)價(jià)2條候選DNA條形碼序列的鑒定能力,以期為黃檀屬木材候

    選DNA條形碼篩選和識(shí)別提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    所用的試驗(yàn)材料取自安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)木材標(biāo)本館,

    共選取22個(gè)試驗(yàn)樣品。其中,降香黃檀(Dalbergia odorifera T.Chen)木材樣品9個(gè),交趾黃檀(Dalbergia cochinchinensis Pierre)木材樣品6個(gè),微凹黃檀(Dalbergia retusa Hemsl.)木材樣品7個(gè)。

    1.2 試驗(yàn)方法

    1.2.1 木材DNA的提取和純化。

    木材DNA提取和純化參照已發(fā)表文獻(xiàn)方法進(jìn)行操作[ 5]。

    1.2.2 DNA條形碼序列的擴(kuò)增。

    分別以降香黃檀、交趾黃檀和微凹黃檀木材提取純化后的DNA為模板,擴(kuò)增葉綠體編碼基因片段trnL序列和葉綠體基因間隔區(qū)trnS-trnG序列。DNA條形碼PCR擴(kuò)增引物信息和擴(kuò)增反應(yīng)體系見(jiàn)表1。

    1.2.3 PCR產(chǎn)物的膠回收純化。

    針對(duì)具有非特異性擴(kuò)增的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物,需對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行膠回收純化處理,PCR產(chǎn)物的純化操作采用TIANgel Midi Purification Kit進(jìn)行膠回收純化。

    1.2.4 PCR產(chǎn)物的連接和轉(zhuǎn)化。

    PCR產(chǎn)物的連接和轉(zhuǎn)化操作按照全式金pEASY-T3 Cloning Kit操作說(shuō)明進(jìn)行。

    1.2.5 陽(yáng)性重組子的鑒定。

    陽(yáng)性克隆檢測(cè)采用M13通用引物擴(kuò)增克隆載體插入片段區(qū)域鑒定陽(yáng)性克隆。

    1.2.6 DNA條形碼序列測(cè)序。

    將鑒定為陽(yáng)性克隆重組子的菌液送至生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序[ 6],為保證測(cè)序結(jié)果準(zhǔn)確性,每個(gè)樣品選擇5個(gè)獨(dú)立的陽(yáng)性克隆重組子進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序所用儀器為ABI PRISM3730xl DNA Analyzer,所測(cè)樣品均選用雙向測(cè)序。

    1.2.7 DNA條形碼序列分析和系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建。

    采用Lasergene Suite 7軟件去除引物兩端載體序列,用BioEdit(Version7.01)編輯和校正多重比對(duì)結(jié)果。采用MEGA 7軟件對(duì)黃檀屬物種間的DNA條形碼序列進(jìn)行多重比對(duì),對(duì)種間穩(wěn)定的變異位點(diǎn)進(jìn)行分析。采用鄰接法(neighborjoining,NJ)將Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)中已公布的3種黃檀屬trnL和trnS-trnG序列(表2)和該研究中PCR產(chǎn)物克隆測(cè)序獲得的DNA條形碼序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,系統(tǒng)發(fā)育樹各分支的置信度用自舉檢驗(yàn)法(bootstrap text)作1 000次可信度分析[ 7-8]。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 DNA條形碼序列的擴(kuò)增和測(cè)序

    由圖1可知,葉綠體編碼基因片段trnL的PCR擴(kuò)增效率為82%,葉綠體基因間隔區(qū)trnS-trnG的PCR擴(kuò)增效率為59%。對(duì)有效擴(kuò)增的DNA條形碼序列進(jìn)行PCR產(chǎn)物克隆測(cè)序,測(cè)序成功率均為100%。PCR擴(kuò)增和測(cè)序結(jié)果表明,較短的DNA條形碼序列擴(kuò)增成功率高,片段越長(zhǎng),擴(kuò)增效率越低,葉綠體基因片段的擴(kuò)增成功率要高于葉綠體基因間隔片段。

    2.2 DNA條形碼序列的比對(duì)和分析

    通過(guò)對(duì)降香黃檀、交趾黃檀和微凹黃檀木材trnL和trnS-trnG序列進(jìn)行多重比對(duì),結(jié)果表明,3種黃檀屬木材的2條候選DNA條形碼序列的種間堿基變異和插入缺失數(shù)量均高于種內(nèi),trnL序列的變異來(lái)源主要來(lái)自于堿基序列的顛換,主要發(fā)生在120~275 bp位點(diǎn)上。trnS-trnG序列的變異來(lái)源主要為堿基的插入/缺失,主要發(fā)生在68~74 bp和131~135 bp位點(diǎn)上,堿基變異轉(zhuǎn)換數(shù)量大于顛換數(shù)量(表3、4)。

    2.3 3種黃檀屬木材系統(tǒng)發(fā)育樹聚類分析

    通過(guò)對(duì)候選DNA條形碼序列trnL和trnS-trnG進(jìn)行多重比對(duì),所有對(duì)位排列結(jié)果中的空位或缺失數(shù)據(jù)作完全刪除處理,采用鄰接法(neighborjoining,NJ)構(gòu)建無(wú)根系統(tǒng)發(fā)育樹[ 9-10]。使用trnL序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2),降香黃檀、交趾黃檀和微凹黃檀均能夠正確聚類,表現(xiàn)出明顯的單系性,各分支聚類支持率分別為98%、99%和99%,采用trnL序列可以將降香黃檀、交趾黃檀和微凹黃檀木材區(qū)分開(kāi)來(lái)。使用trnS-trnG序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3),僅降香黃檀能夠正確聚類,而交趾黃檀和微凹黃檀聚為一支,其識(shí)別成功率為33%。

    3 討論與結(jié)論

    從木材組織中提取的DNA溶解物呈暗黑色,這與木材組織死亡過(guò)程中鞣花單寧改變有關(guān)。邊材向心材組織轉(zhuǎn)變過(guò)程中,木材細(xì)胞老化并導(dǎo)致鞣花單寧逐漸氧化和聚合,使木材DNA在提取緩沖液中著色并抑制PCR擴(kuò)增反應(yīng)[ 11-12]。此外,木材在長(zhǎng)期存放過(guò)程中,受到外界環(huán)境的影響造成氧化腐朽等,也將進(jìn)一步損害降解木材組織中的DNA[ 13]。利用木材組織提取的DNA擴(kuò)增DNA條形碼序列往往豐度較低,采用直接測(cè)序的方式往往難以得到正確結(jié)果,而采用PCR產(chǎn)物克隆測(cè)序的方法可大大提高測(cè)序的成功率。在該研究中3種黃檀屬木材葉綠體編碼基因片段trnL和葉綠體基因間隔區(qū)trnS-trnG序列的PCR擴(kuò)增效率分別為82%和59%,克隆測(cè)序成功率均為100%。候選DNA條形碼種間的堿基變異和插入缺失數(shù)量均高于種內(nèi)。基于葉綠體編碼基因序列trnL構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹能夠成功地將3種黃檀屬木材區(qū)分開(kāi)來(lái)。

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