氫氧化鈉-乳酸協(xié)同處理對貽貝殼角質(zhì)層的凈化作用

柯志剛,陳進(jìn)宇,相興偉,陳慧,周緒霞,金友定,戴央章,鄧尚貴,周小敏,丁玉庭,劉書來,8*

1(浙江工業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院,浙江 杭州,310014)2(浙江省深藍(lán)漁業(yè)資源高效開發(fā)利用重點實驗室,浙江 杭州,310014)3(國家遠(yuǎn)洋水產(chǎn)品加工技術(shù)研發(fā)分中心(杭州),浙江 杭州,310014)4(海洋食品精深加工關(guān)鍵技術(shù)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心,大連工業(yè)大學(xué),遼寧 大連,116034)5(嵊泗縣景晟貽貝產(chǎn)業(yè)發(fā)展有限公司,浙江 嵊泗,316000)6(浙江海洋大學(xué) 食品與藥學(xué)學(xué)院,浙江 舟山,316000)7(浙江興業(yè)集團(tuán)有限公司,浙江 舟山,316000)8(寧海縣浙工大科學(xué)技術(shù)研究院,浙江 寧波,315600)

貽貝是一種常見的食用性貝類,其營養(yǎng)豐富,蛋白質(zhì)含量高,且富含多種生理活性物質(zhì),具有抗菌、調(diào)節(jié)血壓、抗凝血等功能[1],在我國山東、遼寧、浙江等沿海省份大量養(yǎng)殖。我國目前對貽貝的利用主要局限于可食用的貝肉部分,對占總質(zhì)量60%以上的貝殼卻很少涉及。未被利用的貝殼作為固體廢棄物丟棄在海邊,不但占用了土地資源,還會造成環(huán)境污染和部分沿海區(qū)域生態(tài)系統(tǒng)的嚴(yán)重退化[2]。貽貝殼的主要成分是CaCO3,作為海洋源CaCO3,其安全性優(yōu)于礦石和動物骨源CaCO3,這是由于礦石源CaCO3常殘留有重金屬等有害成分,而動物骨源CaCO3品質(zhì)易受畜禽疫情的影響[3]。

鈣是動物體內(nèi)僅次于碳、氫、氧、氮的第5種重要元素,對維持生物體正常結(jié)構(gòu)和功能有重要作用。以貝殼為鈣源,已制備出乳酸鈣、葡萄糖酸鈣、氨基酸螯合鈣等一系列補鈣產(chǎn)品[4-6]。貽貝殼由外及內(nèi)可分為角質(zhì)層、棱柱層、珍珠層[7]。角質(zhì)層主要由硬質(zhì)蛋白組成,其中含有大量天然黑色素[8]。棱柱層和珍珠層是CaCO3晶體,主要有方解石CaCO3和球霰石CaCO3[9],是貝殼的主要成分。黑色素溶解性差,不易分離,且因含有吲哚環(huán)、芳香環(huán)、氨基和烴基等官能團(tuán)[10]而具有吸附性,使貽貝殼表面含有一定量的其他元素和重金屬[11]。這些成分不僅影響鈣補充劑制備效率,甚至?xí)绊懫淦焚|(zhì)和安全性。在已有以貝殼為鈣源制備各種鈣補充劑的相關(guān)研究中[12-13],均未對貝殼表面的角質(zhì)層及黏連角質(zhì)層的低純CaCO3進(jìn)行脫除,因此產(chǎn)品品質(zhì)存在一定的不確定性。

貽貝殼中的黑色素易溶于堿溶液[14],表面黏連有硬質(zhì)蛋白的低純CaCO3可與酸反應(yīng)生成可溶的鈣離子化合物[15]。鑒于此,本研究擬采用NaOH-乳酸溶液協(xié)同處理,以明暗度和質(zhì)量損失率為指標(biāo),篩選出對貽貝殼表面角質(zhì)層和黏連有角質(zhì)層的低純CaCO3具有最佳凈化效果的條件。為減少所使用試劑對環(huán)境可能帶來的污染,本探究所選用的NaOH濃度較低(pH 9～13),且選用有機酸乳酸(pH 2～5)進(jìn)行酸處理劑。對凈化后貽貝殼的微觀結(jié)構(gòu)和表面殘留成分的化學(xué)組成進(jìn)行分析,對其表面元素組成、表面鈣含量、重金屬含量等進(jìn)行測定,綜合評判NaOH-乳酸協(xié)同處理對貽貝殼的凈化作用,為高品質(zhì)貽貝殼源鈣補充劑的制備提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

貽貝殼,杭州朝暉六區(qū)農(nóng)貿(mào)市場;NaOH(食品級),湖北鑫潤德化工有限公司;乳酸(食品級),上海鼎通生物工程有限公司;鹽酸(食品級),武漢三勤化工科技有限公司;KBr(光譜級),上海泰坦科技股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

電熱鼓風(fēng)干燥箱,上海一恒科學(xué)儀器有限公司;KQ-300DE超聲清洗設(shè)備,昆山清洗設(shè)備有限公司;DLH-250型高速多功能粉碎機,武義祺騰電器有限公司;Color Quest色差儀,美國HunterLab公司;PHS-E pH計,上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司;Prisma-E掃描電鏡,美國FEI公司;Nicolet 6700傅里葉變換紅外光譜儀,Thermo Nicolet公司;NexION 300X電感耦合等離子質(zhì)譜儀,美國PerkinElmer公司;真空冷凍干燥機,北京四環(huán)起航科技有限公司;高速冷凍臺式離心機,美國Danaher Corporation公司。

1.3 貽貝殼的NaOH-乳酸凈化處理

將貽貝殼外表面刷洗干凈并去除內(nèi)表面黏附的貝肉,將貝殼放入65 ℃干燥箱中烘干3 h,將烘干后貝殼用小錘敲打破碎成小塊(直徑約2～3 cm)。稱取破碎的貽貝殼25 g,向其中加入250 mL不同濃度(0.01 mmol/L、0.3 mmol/L、2.5 mmol/L、12.5 mmol/L、0.125 mol/L)的NaOH溶液(pH 9～13)浸泡處理24～72 h。在浸泡處理的第1小時和最后1小時分別進(jìn)行超聲波協(xié)同處理,超聲波頻率40 kHz,功率300 W。處理后的貝殼用清水沖洗干凈并置入65 ℃干燥箱烘干3 h,為NaOH處理樣品。

稱取NaOH處理且干燥后的貽貝殼25 g,向其中加入250 mL不同濃度(700、7、0.07、7×10-4mmol/L)的乳酸溶液(pH 2～5)浸泡處理1～5 h。處理后的貝殼用清水沖洗并置于65 ℃干燥箱中烘干3 h。為敘述方便,本文將經(jīng)NaOH溶液處理后再經(jīng)乳酸溶液處理簡述為NaOH-乳酸處理。

1.4 貽貝殼明暗度L值的測定

用高速多功能粉碎機將未經(jīng)處理、NaOH處理、NaOH-乳酸處理的貽貝殼進(jìn)行粉碎,過80目篩,將篩下物置于105 ℃烘箱干燥至恒重,制備貽貝殼粉。將干燥后的貝殼粉置于PE自封袋中并壓緊,用色差儀對樣品的色澤進(jìn)行測定。

1.5 掃描電子顯微鏡(scanning electron microscope,SEM)和X-射線能譜分析儀(energy dispersive spectrometer,EDS)

分別選取未處理、NaOH處理和NaOH-乳酸處理的貽貝殼,在載物盤上黏附導(dǎo)電膠,取噴金處理后樣品黏附于導(dǎo)電膠上,使用吸耳球清除未黏附的粉末雜質(zhì)。對樣品進(jìn)行掃描電鏡觀察和EDS能譜分析。

1.6 傅里葉變換紅外光譜(Fourier transform infrared spectroscopy,FTIR)測定

取適量貽貝殼粉與KBr按質(zhì)量比1∶100混合、研磨、壓片。對樣品進(jìn)行FTIR測定,掃描范圍為4 000～400 cm-1,分辨率為4 cm-1。采用同樣方法對堿溶酸提的貽貝殼黑色素進(jìn)行測定。黑色素的堿溶酸提流程為:用pH 13的NaOH溶液浸泡處理貽貝殼36 h(參照1.3節(jié)),取10 g脫落的角質(zhì)層并向其中加入40 mL NaOH溶液(2 mol/L)浸泡處理4 h,10 000 r/min離心10 min,取上清液,用6 mol/L鹽酸溶液調(diào)節(jié)其pH至2.0后析出沉淀物,取沉淀物進(jìn)行真空冷凍干燥(-40 ℃、≤5 Pa)處理12 h獲得黑色素。

1.7 重金屬檢測

參照VOICA等[16]的方法使用電感耦合等離子體質(zhì)譜(inductively coupled plasma mass spectrometry,ICP-MS)對貽貝殼粉的金屬元素含量進(jìn)行檢測。稱取0.5 g樣品并加入10 mL濃硝酸,室溫靜置1 h,隨后利用微波消解儀進(jìn)行消解,前5 min升溫至120 ℃,恒溫處理5 min;5 min內(nèi)升溫至150 ℃并恒溫處理10 min;然后5 min內(nèi)升溫至190 ℃并恒溫處理20 min。冷卻后緩慢打開罐蓋排氣,用少量水沖洗內(nèi)蓋,再將消解罐置于控溫電熱板上,于100 ℃加熱30 min。隨后用去離子水定容至25 mL備用。以不添加貝殼粉樣品、但經(jīng)相同處理的溶液為空白對照。將空白溶液和試樣溶液分別注入電感耦合等離子體質(zhì)譜儀中,設(shè)定射頻功率1 500 W,輔助氣和霧化氣的流速分別為1.2和1.03 L/min,等離子體流速為18 L/min,泵速為2.0 mL/min。測定待測元素和內(nèi)標(biāo)元素的信號響應(yīng)值,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到消解液中待測元素的濃度。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計及分析

每組實驗平行進(jìn)行3次,使用Origin 2017對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,SPSS 26.0進(jìn)行顯著性分析,P<0.05認(rèn)為具有顯著性差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 pH和浸泡時間對NaOH溶液脫除黑色素效果的影響

如圖1-a所示,未經(jīng)NaOH處理的對照樣品明暗度為67.28,而經(jīng)pH 9的NaOH溶液浸泡處理24 h后,其明暗度增加至82.26。若NaOH溶液pH為13,其明暗度則增加至84.06。在pH 10～13范圍內(nèi),樣品明暗度雖略有增加但并無顯著性差異(P>0.05),但黑色素的脫除效果卻有明顯差別。如圖1-a插圖所示,pH 12的NaOH溶液處理后貽貝殼表面仍有部分黑色素殘留,而pH 13的NaOH溶液處理后黑色素基本脫落。上述結(jié)果表明NaOH溶液pH對其脫除貽貝殼表面的黑色素有明顯影響,隨著溶液pH的升高,脫除作用增強。后續(xù)研究中選定的NaOH溶液pH為13。

a-pH對明暗度的影響(插圖分別為pH 12和13處理時貽貝的圖片);b-浸泡時間對明暗度的影響(pH=13)

如圖1-b所示,pH=13時,在0～72 h,隨著浸泡時間的延長,貽貝殼粉明暗度呈先上升后下降的趨勢。當(dāng)浸泡時間為24、36 h時,貽貝殼粉明暗度由對照組的67.28分別增加至84.06、90.64。進(jìn)一步延長浸泡時間至48、60、72 h,其明暗度則分別減小至88.61、87.43、89.28。長時間浸泡導(dǎo)致其明暗度減小的原因可能是長時間NaOH處理使得貽貝殼棱柱層暴露增加,結(jié)構(gòu)愈加松散,孔隙率不斷上升,從而增加了其對溶解的黑色素的吸附作用[17]。因此,后續(xù)研究中選定的NaOH浸泡時間為36 h。

2.2 乳酸溶液pH和浸泡時間對脫除黏連有角質(zhì)層的低純CaCO3的影響

由圖2-a可知,隨著乳酸溶液pH的降低,貽貝殼粉明暗度呈現(xiàn)上升趨勢。只經(jīng)pH 13的NaOH浸泡處理36 h的貽貝殼粉明暗度為90.64,若再用pH2～5的乳酸溶液浸泡處理4 h后,其明暗度分別增加至94.03、93.95、93.02、92.36。雖然隨著pH升高,樣品間明暗度有一定程度減少,但并無顯著性差異(P>0.05)。如圖2-b所示。pH 2的乳酸溶液處理后樣品的質(zhì)量損失率為9.78%,顯著高于pH 3～5的乳酸溶液處理的樣品(P<0.05)。綜上可知,乳酸處理能明顯進(jìn)一步脫除貽貝殼表面黏連有角質(zhì)層的低純CaCO3,溶液pH對其脫除效果有一定影響。后續(xù)研究中選取的乳酸pH為2。

a-乳酸溶液pH對貽貝殼粉明暗度的影響(浸泡處理4 h);b-乳酸溶液pH對貽貝殼質(zhì)量損失率的影響(浸泡處理4 h);c-處理時間對貽貝殼粉明暗度的影響(乳酸pH 4);d-處理時間對貽貝殼質(zhì)量損失率的影響(乳酸pH 4)

如圖2-c所示,對照組(pH 13的NaOH溶液浸泡36 h)貽貝殼粉的明暗度為90.64,經(jīng)pH 2的乳酸浸泡處理1、2、3、4、5 h后,貽貝殼粉的明暗度分別增加至92.48、92.72、92.97、93.02、93.57,呈現(xiàn)上升趨勢,并無顯著性差異(P>0.05),但其質(zhì)量損失率卻存在顯著性差異(P<0.05)。處理4和5 h的樣品質(zhì)量損失率顯著高于處理3 h樣品。后續(xù)研究中選擇乳酸的浸泡處理時間為4 h。

2.3 微觀結(jié)構(gòu)表征

利用掃描電鏡對最佳凈化條件下NaOH和NaOH-乳酸處理的貽貝殼微觀結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析(見圖3)。結(jié)合FENG等[18]對貽貝殼礦物相的結(jié)構(gòu)和晶體取向研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),未處理樣品因表面含有大量的有機質(zhì)而呈致密、光滑形態(tài)[19];NaOH處理組樣品表面黑色素脫落,角質(zhì)層出現(xiàn)明顯的斷裂;而經(jīng)NaOH-乳酸處理后,與棱柱層黏連的角質(zhì)層發(fā)生明顯脫落,柱狀棱柱層清晰可見。SEM分析結(jié)果表明,NaOH-乳酸協(xié)同處理可有效脫除貽貝殼表面的黑色素及黏連有角質(zhì)層的低純CaCO3。

a-對照組(×2 000);b-NaOH處理組(×2 000);c-NaOH-乳酸處理組(×2 000);d-對照組(×5 000);e-NaOH處理組(×5 000);f-NaOH-乳酸處理組(×5 000)

2.4 FTIR分析

a-紅外光譜;b-1 000～2 000 cm-1內(nèi)紅外光譜

2.5 表面元素分析

基于EDS的貽貝殼表面元素分析結(jié)果如圖5和表1所示。未處理的貽貝殼表面含有C、O、Na、Br、S、Cl、Ca等多種元素,其中C、O含量最高,其質(zhì)量比分別達(dá)66.22%、27.96%,二者主要來自貽貝殼表面的角質(zhì)層。Na、Br、S、Cl等主要來自角質(zhì)層的吸附作用,其中Br元素含量較高,其質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.96%。雖然貽貝殼中含有大量的CaCO3,但由于角質(zhì)層的包被,觀測到的Ca元素強度較低,其質(zhì)量分?jǐn)?shù)僅為0.39%。經(jīng)NaOH處理后,C元素質(zhì)量分?jǐn)?shù)減小至27.63%,O、Ca元素質(zhì)量分?jǐn)?shù)則分別增加至40.95%、30.15%,而Br元素則未檢出。而經(jīng)最佳凈化條件下NaOH-乳酸處理后,C元素質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)一步減小至12.80%,而O、Ca元素質(zhì)量分?jǐn)?shù)則分別增加至49.25%、37.58%,三者均接近純CaCO3中各元素質(zhì)量比(C∶O∶Ca=12∶48∶40)。上述結(jié)果進(jìn)一步表明,NaOH-乳酸處理可有效脫除貽貝殼表面角質(zhì)層及其吸附的其他元素,從而提高貽貝殼中CaCO3純度。

表1 各處理組表面元素組成

a-未處理;b-NaOH處理;c-NaOH-乳酸處理

2.6 重金屬含量分析

海水及沉積物中含有鎘、鉛、銅和鋅等重金屬,而貝殼角質(zhì)層中的有機質(zhì)具有較強的吸附性能,可與重金屬結(jié)合形成重金屬-有機絡(luò)合物[24]。利用ICP-MS對最佳凈化條件下NaOH-乳酸處理的貽貝殼中4種重金屬進(jìn)行了檢測,并與未經(jīng)凈化處理的對照組進(jìn)行比較,結(jié)果如表2所示。本研究所用貽貝殼含有一定量的Cu、Zn、Pb等元素,Cd未檢出。所檢出重金屬含量均未超過GB 2762—2022《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中污染物限量》的規(guī)定。經(jīng)NaOH-乳酸凈化處理后,Zn、Pb含量有一定程度下降,分別由凈化前的5.86、0.80 mg/kg降低至4.79 mg/kg和未檢出。但Cu含量卻有少許增加,這可能與貽貝殼對不同離子的吸附部位相關(guān)。

表2 凈化前后貽貝殼中重金屬元素含量變化表 單位:mg/kg

3 結(jié)論

NaOH-乳酸協(xié)同處理可有效脫除貽貝殼表面的角質(zhì)層,最佳凈化處理條件為:pH 13 NaOH溶液浸泡36 h,再經(jīng)pH 2的乳酸溶液浸泡處理4 h。最佳處理條件下貽貝殼制備的粉末的明暗度由未處理組的67.28增加至93.02。SEM-EDS、FTIR及ICP-MS分析顯示,NaOH-乳酸協(xié)同處理有效脫除了貽貝殼表面的黑色素、黏連角質(zhì)層的低純CaCO3及其吸附的Br、Zn、Pb等元素,凈化后貽貝殼中CaCO3純度顯著提高,各元素質(zhì)量比接近CaCO3中元素的理論質(zhì)量比。本研究結(jié)果可為貽貝殼源高品質(zhì)鈣源補充劑的制備提供一定的借鑒和參考。