對羥基苯甲酸-殼聚糖接枝物的合成及性能研究

王皎龍

(海南大學 食品科學與工程學院,海南 ?？? 570228)

殼聚糖(chitosan,CS)是自然界的第二大天然有機物甲殼素的脫乙酰產(chǎn)物,具有無毒[1]、生物相容性[2]、抗氧化[3]、抑菌[4]和可生物降解[5]等優(yōu)點,在食品、藥品、農(nóng)業(yè)、紡織、化妝品和水處理等領域存在極大的應用潛力[6-10]。由于CS分子內(nèi)和分子間存在強烈的相互作用,導致其生物學性能較差,如溶解性低、抗氧化、抑菌效果不強等,限制了其應用[11]。增強CS生物活性并賦予其某些新特性的有效方法是化學修飾,接枝共聚反應是化學修飾的最常用方法[12]。H2O2和抗壞血酸(維生素C)是一種經(jīng)濟實惠的水溶性氧化還原引發(fā)劑,可作為接枝共聚反應的引發(fā)劑。與傳統(tǒng)引發(fā)劑相比,H2O2/維生素C氧化還原引發(fā)劑不會產(chǎn)生有毒物質(zhì),且反應條件溫和,可以在環(huán)境溫度下進行[13]。這些優(yōu)點表明,由H2O2/維生素C氧化還原系統(tǒng)引發(fā)的自由基反應非常適合食品、醫(yī)療領域。使用這種方法將抑菌或抗氧化因子接枝并共價固定在CS的分子上,有望改善CS的性能,使其成為新型的綠色抑菌或抗氧化材料。

對羥基苯甲酸酯是一種常見的防腐劑,在食品、化妝品等領域被廣泛應用[14-15]。對羥基苯甲酸酯被認為對人體是安全無副作用的,它由對羥基苯甲酸(p-hydroxybenzoic acid,PA)和羥基(—OH)經(jīng)酯化反應得到。理論上,在一定條件下,PA可以與CS反應,生成無毒害的對羥基苯基酸-殼聚糖酯。由于具有酚羥基,所以理論上產(chǎn)物的抗氧化和抑菌活性會被大大增強。

現(xiàn)已有多種酚酸接枝到CS及其衍生物上的研究[16],如沒食子酸、咖啡酸、阿魏酸、水楊酸和綠原酸等。但是目前通過自由基介導將酚酸PA接枝到CS的研究鮮有報道。因此,本文使用H2O2/維生素C氧化還原對,通過自由基反應,制備了3種不同枝接率的PA改性的CS(p-hydroxybenzoic acid-chitosan,PA-g-CS),以期探明PA接枝對CS的影響。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

殼聚糖(脫乙酰度95%)、DPPH,麥克林生化科技有限公司;對羥基苯甲酸(分析純)、福林酚、乙醇等試劑,國藥集團化學試劑有限公司。

大腸桿菌、金黃色葡萄球菌,來自中國普通微生物菌種保藏管理中心,經(jīng)傳代培養(yǎng)后使用。

Tensor 27傅里葉變換紅外光譜(Fourier transform infrared spectroscopy,FT-IR)儀,德國Bruker公司;TGA/DSC 1/1100熱重/差熱分析儀,美國梅特勒-托利多公司;S-3000N掃描電子顯微鏡,日本Hitachi公司;TU1800紫外-可見分光光譜儀,北京普析通用儀器公司;Rigaku SmartLab X射線衍射(X-ray diffraction,XRD)儀,日本理學株式會社。

1.2 實驗方法

1.2.1 PA-g-CS制備

將1.20 g CS完全溶解于100 mL 2%(體積分數(shù))乙酸溶液中。以PA與CS重復單元物質(zhì)的量比為0.3∶1、0.7∶1與1∶1分別將PA添加到不同的三頸圓底燒瓶中。所有反應器中加入0.2 g維生素C后,通入高純N2排除空氣。然后,加入1 mL體積分數(shù)30% H2O2溶液。以N2隔絕空氣,反應12 h后,使用8～14 kDa透析袋透析反應液以除去未反應的PA及其他可溶性物質(zhì)。透析72 h,每8 h更換1次透析水,然后冷凍干燥得到樣品PA-g-CS-Ⅰ(0.3∶1),PA-g-CS-Ⅱ(0.7∶1)和PA-g-CS-Ⅲ(1∶1)。

1.2.2 PA-g-CS接枝度測定

采用福林酚法測量PA-g-CS中的PA含量[17]。將凍干PA-g-CS粉末溶解在1%(體積分數(shù))的乙酸中,終質(zhì)量濃度1 mg/mL。將福林酚試劑稀釋5倍后取2.0 mL與2.0 mL樣品溶液混勻,避光30 min,加入6 mL質(zhì)量分數(shù)20%Na2CO3溶液,搖勻后在室溫下反應2 h,750 nm處測其吸光值。根據(jù)PA標準品建立的標準曲線計算PA-g-CS的接枝度,結(jié)果表示為mg PA/g PA-g-CS(mg PA/g)。

1.2.3 紫外可見光譜分析

將PA、CS和PA-g-CS以4 mg/mL分別溶解于乙酸水溶液(0.4%,體積分數(shù))中,在200～600 nm進行全波長掃描。乙酸水溶液用作空白,掃描進行3次,取平均值。掃描速度為0.5 nm/s。

1.2.4 FT-IR分析

將樣品置于FT-IR儀的附件上,壓頭壓緊后使之與晶體表面緊密接觸,在衰減全反射模式下測試,掃描范圍為4 000～400 cm-1。

1.2.5 結(jié)晶性檢測

使用XRD儀得到CS和PA-g-CS的XRD圖譜。采用Cu-Kα 射線源(λ=0.154 2 nm),測試電壓40 kV,電流40 mA。測量角度2θ=10°～40°,步長0.02°,掃描速度0.1°/s。

1.2.6 熱重分析(thermogravimetric analysis,TGA)

在N2氣氛下以10 ℃/min的升溫速率使用熱重分析儀將CS和PA-g-CS從25 ℃加熱到600 ℃。

1.2.7 掃描電鏡

將樣品固定在導電膠上,鍍金后,使用掃描電子顯微鏡在10 kV加速電壓下觀察CS和PA-g-CS表面形貌。

1.2.8 抗氧化活性

參考XIE等[18]的方法,并稍作修改。50 μL(0.125～4 mg/mL)樣品與200 μL 0.4 mmol/L DPPH乙醇溶液在96孔板中混合均勻,室溫下反應30 min。使用酶標儀在517 nm處測量吸光度。DPPH自由基清除率計算如公式(1)所示:

(1)

式中:I,DPPH自由基清除率,%;A0,DPPH與樣品溶劑的吸光度;A1,DPPH與樣品的吸光度;A2,樣品與溶劑的吸光度。

1.2.9 抑菌活性

參考文獻[19]的方法,并稍作修改。將菌株(大腸桿菌和金黃色葡萄球菌)傳代培養(yǎng)后,接種到Mueller-Hinton MH肉湯培養(yǎng)基(25 g/L,pH 7.2)中,37 ℃培養(yǎng)8 h左右。隨后,使用MH肉湯培養(yǎng)基將所得培養(yǎng)物稀釋至106CFU/mL。將滅菌的MH肉湯培養(yǎng)基倒入到直徑9 cm的無菌培養(yǎng)皿中。冷卻并固化培養(yǎng)基后,將100 μL稀釋的細菌懸浮液均勻地分散在固體培養(yǎng)基的表面。之后將5個無菌牛津杯放置在接種好的平板上。在牛津杯中添加200 μL(5 mg/mL)樣品后,37 ℃培養(yǎng)24 h。使用游標卡尺測量抑菌圈直徑,無菌生理鹽水(質(zhì)量分數(shù)為0.85%)用作對照。

1.3 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示。使用Excel 2016和Origin 2017C軟件進行數(shù)據(jù)分析及作圖。使用SPSS 13.0軟件進行顯著性差異分析。P<0.05被認為具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 PA-g-CS的反應機理及取代度

圖1展示了PA和CS之間可能的反應機理。首先,維生素C和H2O2反應產(chǎn)生·OH,·OH隨后引發(fā)聚合反應(圖1-a)。然后,生成的·OH從CS分子吸收氫原子并形成CS自由基(圖1-b)。此后,反應位點附近的PA成為CS自由基的受體,形成了PA-g-CS(圖1-c)。一般認為,該過程是維生素C/H2O2引發(fā)的自由基枝接反應的反應機理[20]。

圖1 PA-g-CS形成可能的反應機理

2.2 紫外-可見光譜分析

如圖2所示,PA在245 nm處存在一個較寬的吸收帶,這與苯環(huán)π鍵有關。CS在225 nm處存在一個弱峰,這是因為CS分子上存在的未完全脫去的乙酰基[21]。3種接枝物中,PA-g-CS-Ⅰ存在2個吸收峰(234、252 nm),PA-g-CS-Ⅱ在251.5 nm附近的吸收帶比PA-g-CS-Ⅰ更寬,同樣PA-g-CS-Ⅲ在246 nm附近的吸收帶比其他2種接枝物更寬。這可能歸因于接枝到CS分子的PA數(shù)量的變化,隨著PA-g-CS樣品中PA當量的增加,CS殘基和PA殘基的吸收峰逐漸合并為一個吸收帶,并且這些峰逐漸向PA的峰型轉(zhuǎn)變。紫外-可見光譜的差異證實了PA已成功接枝到CS上。

圖2 CS、PA和PA-g-CS(Ⅰ～Ⅲ)的紫外-可見光譜

2.3 FT-IR光譜

圖3 CS和PA-g-CS(Ⅰ～Ⅲ)的FT-IR光譜

2.4 晶體結(jié)構(gòu)

如圖4所示,CS在衍射角2θ=11°和20°處有2個明顯的衍射峰,分別與晶型I和II有關[25]。3種接枝物均在2θ=13°和20°處出現(xiàn)峰,在2θ=13°時,接枝物的弱峰取代了CS在2θ=11°時的弱峰。而且,接枝物的峰強度明顯低于CS的峰強度,所以CS分子骨架上引入PA基團后,削弱或者破壞了CS分子內(nèi)原有的氫鍵作用,使CS的結(jié)晶度減弱。這可能會導致PA-g-CS分子上更多的羥基和氨基裸露出來,從而極大地增強接枝物的抑菌、抗氧化和水溶性。同時也可能會降低接枝物的熱穩(wěn)定性。XRD結(jié)果再次驗證了PA已成功接枝到CS上。

圖4 CS和PA-g-CS(Ⅰ～Ⅲ)的XRD光譜

2.5 掃描電鏡觀察

CS和PA-g-CS微觀結(jié)構(gòu)如圖5所示,CS在接枝前后表面形態(tài)具有明顯差異。由于CS分子之間存在強烈的氫鍵相互作用,CS(圖5-a)具有光滑片狀表面,相反,PA-g-CS的表面較粗糙,表現(xiàn)為疏松多孔的網(wǎng)絡。接枝物的這種結(jié)構(gòu)增加了其表面積和比表面積,這可能會使接枝物具有強烈的吸附能力。用原兒茶酸[22]和肉桂酸[26]接枝的CS得到了相似的結(jié)果。從圖5-b～圖5-d可以清楚地觀察到,接枝度越大,PA-g-CS表面上的空隙越多,其表面積和比表面積越大。因此使得通過操控PA-g-CS的接枝率,從而控制PA-g-CS的表面形態(tài)成為可能。

a-CS;b-PA-g-CS-Ⅰ;c-PA-g-CS-Ⅱ;d-PA-g-CS-Ⅲ

2.6 熱穩(wěn)定性分析

熱穩(wěn)定性可以確定PA-g-CS在生產(chǎn)加工和使用過程中所能承受的最高溫度。TGA是研究共聚物熱穩(wěn)定性的常規(guī)技術,微商熱重(derivative thermogravimetric,DTG)是TGA的一階導數(shù)。由DTG曲線可知(圖6),CS、PA-g-CS(Ⅰ～Ⅲ)均出現(xiàn)兩步質(zhì)量損失,在25～100 ℃,失重與水蒸氣蒸發(fā)有關,CS的失重率最低,PA-g-CS-Ⅰ的失重率最高,表明PA-g-CS可能具有更強的吸濕能力。CS在100～250 ℃是穩(wěn)定的,當溫度>250 ℃時,CS快速分解并在300 ℃時達到峰值。PA-g-CS(Ⅰ～Ⅲ)在140 ℃開始緩慢分解,也在300 ℃達到峰值。在600 ℃下,CS和PA-g-CS(Ⅰ～Ⅲ)的殘留物質(zhì)量分別為36.2%、22.6%、28.9%和25.7%。TGA和DTG結(jié)果表明CS在250 ℃以下穩(wěn)定。PA-g-CS于140 ℃開始分解。與CS相比,PA-g-CS的熱穩(wěn)定性降低,這與前人的研究相符[21-22]。然而,PA的取代度并未對PA-g-CS的分解溫度有明顯影響。該結(jié)果類似于阿魏酸接枝的CS[27]。熱穩(wěn)定性降低可能是因為PA-g-CS的結(jié)晶度降低引起的。

圖6 CS、PA-g-CS(Ⅰ～Ⅲ)的TGA和DTG曲線

2.7 抗氧化活性

如圖7所示,與CS相比,PA-g-CS在0.125～4 mg/mL時DPPH自由基清除能力顯著提高(P<0.05),該結(jié)果與WU等[28]將沒食子酸接枝到CS的結(jié)果一致。此外,CS、PA及PA-g-CS的DPPH自由基清除能力均與質(zhì)量濃度呈正相關。在一定的質(zhì)量濃度范圍內(nèi),PA-g-CS的DPPH自由基清除能力與枝接率呈正相關,PA-g-CS-Ⅲ的DPPH自由基清除率顯著高于PA-g-CS-Ⅰ和PA-g-CS-Ⅱ(P<0.05)。此外,相對于PA,PA-g-CS具有更強的DPPH自由基清除能力。這與CHO等[29]將沒食子酸接枝到CS上的結(jié)果相似。這些發(fā)現(xiàn)表明,接枝到CS上的PA對DPPH自由基清除能力具有協(xié)同作用。這可能是由于接枝后CS分子間和分子內(nèi)氫鍵被破壞,導致接枝產(chǎn)物有能力提供更多的氫原子。這與上述PA-g-CS的結(jié)晶度降低的結(jié)果相符。同時,PA部分的電子轉(zhuǎn)移能力也可能是接枝物清除DPPH自由基能力增強的原因。

圖7 CS、PA-g-CS(Ⅰ～Ⅲ)和PA的DPPH自由基清除活性

2.8 抑菌活性

用2種常見的致病菌大腸桿菌(G-)和金黃色葡萄球菌(G+)對各種膜的抗菌性能進行了評價,結(jié)果如表1所示。與CS膜相比,PA-g-CS膜具有更強的抗菌活性(P<0.05),這表明PA接枝CS膜的抗菌性能得到了提高,PA和CS的協(xié)同作用可以增強其抗菌作用。與大腸桿菌相比,CS膜和PA-g-CS膜對金黃色葡萄球菌均表現(xiàn)出更強的抗性。CS和PA-g-CS膜對金黃色葡萄球菌的抗菌活性高于對大腸桿菌的抗菌活性,這可能與革蘭氏陰性菌細胞膜上的脂多糖層能有效阻止抗菌物質(zhì)穿透細胞膜,從而具有一定的耐藥性有關[30]。

表1 CS和PA-g-CS(Ⅰ～Ⅲ)的抑菌圈直徑 單位:mm

3 結(jié)論

紫外-可見光譜和FTIR圖譜分析都表明PA與CS之間形成了共價鍵。XRD和TGA圖譜表明,與CS相比,PA-g-CS的結(jié)晶度和熱穩(wěn)定性降低。掃描電鏡圖譜表明,PA-g-CS的微觀化學結(jié)構(gòu)的改變導致宏觀表面形態(tài)從光滑變?yōu)榇植?。接枝度越?表面越粗糙且多孔,這使得通過控制接枝度來控制PA-g-CS的表面形態(tài)成為可能?？寡趸鸵志鷾y試表明,CS和PA的共價結(jié)合增強了PA-g-CS的生物學特性,接枝度相對較高的產(chǎn)品表現(xiàn)出更強的抑菌和抗氧化活性。因此,有望將PA-g-CS開發(fā)為新型防腐劑、抗氧化劑和可降解活性包裝材料。