阿膠肽鐵螯合物微膠囊的制備及其特性表征

李秀,陳昱瑤,管玲娟,宋潔,成向榮

(江南大學(xué) 食品學(xué)院,江蘇 無(wú)錫,214122)

阿膠是馬科動(dòng)物驢(EquusasinusL.)的皮通過(guò)煎煮加工后濃縮制成的固體膠[1],主要成分為蛋白質(zhì)、氨基酸、微量元素、多糖、硫酸軟骨素以及透明質(zhì)酸等[2]。蛋白質(zhì)是阿膠的主要生物活性物質(zhì),其口服后經(jīng)胃腸道消化、降解為小肽,發(fā)揮對(duì)血液的滋補(bǔ)與機(jī)體調(diào)節(jié)作用[3]。微量元素鐵是紅細(xì)胞合成血紅素必不可少的成分[4],人體缺鐵會(huì)造成血紅素合成減少?gòu)亩l(fā)生缺鐵性貧血(iron-deficiency anemia, IDA),同時(shí)引起體內(nèi)含鐵酶活性降低,影響能量代謝,引起精神不振、疲倦[5]。全球疾病負(fù)擔(dān)研究顯示IDA是2013年全球健康壽命減損的前5位病因,鐵的缺乏已經(jīng)成為一個(gè)世界性的營(yíng)養(yǎng)問(wèn)題。補(bǔ)鐵劑前后經(jīng)歷四代發(fā)展,第一代為以FeSO4為代表的無(wú)機(jī)亞鐵鹽補(bǔ)鐵劑,第二代為以乳酸亞鐵為代表的有機(jī)酸鹽補(bǔ)鐵劑,第三代以甘氨酸亞鐵為代表,目前以多肽鐵為代表的第四代補(bǔ)鐵劑因穩(wěn)定性好、生物利用率高、成本低廉已被廣泛應(yīng)用[6-8]。前期研究表明,阿膠肽鐵螯合物(Ejiao peptide-iron chelate,EPI)可以通過(guò)提高鐵的生物利用度,改善膳食缺鐵小鼠貧血癥狀,是阿膠補(bǔ)血的功效成分[9-10]。微膠囊化技術(shù)是用天然或者合成的高分子成膜材料作為壁材,把分散的固態(tài)物質(zhì)、液體甚至氣體作為芯材完全包埋起來(lái),形成具有密封或半透性囊膜的微型顆粒的技術(shù)[11-12]。為了提高穩(wěn)定性、增強(qiáng)緩釋作用以及遮蔽不良風(fēng)味(鐵銹味),本文對(duì)EPI進(jìn)行微膠囊化包埋。通過(guò)對(duì)EPI微膠囊制備工藝優(yōu)化,并對(duì)制得的微膠囊進(jìn)行理化性質(zhì)表征、穩(wěn)定性分析及腸道緩釋行為分析,為新型阿膠補(bǔ)血產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)提供科學(xué)依據(jù),為新型補(bǔ)鐵劑的開(kāi)發(fā)提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

阿膠粉,山東東阿阿膠股份有限公司;102型果膠、D-150型大豆分離蛋白(soy protein isolate,SPI),蘇州賽邁爾生物科技有限公司。

無(wú)水乙醇、FeSO4·7H2O、NaOH、濃鹽酸、Na2CO3、CuSO4·5H2O、四水合酒石酸鉀鈉、抗壞血酸、1,10-鄰菲啰啉、一水合乙酸鈉、三水合乙酸鈉、冰醋酸、一水合檸檬酸、KH2PO4,均為分析純,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;堿性蛋白酶(≥200 U/mg),北京索萊寶科技有限公司;木瓜蛋白酶(BR,800 U/mg)、胃蛋白酶(豬胃黏膜,USP級(jí),1∶30 000)、胰蛋白酶(豬胰,BR,1∶250),上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Centrifuge 5804R臺(tái)式冷凍離心機(jī)、Centrifuge 5430R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī),德國(guó)Eppendorf公司;HH-3A恒溫水浴鍋,常州國(guó)華電器有限公司;SCIENTZ-10N冷凍干燥機(jī),寧波新芝生物股份有限公司;納米粒度及Zeta電位儀,英國(guó)馬爾文公司;冷場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡,日本株式會(huì)社日立高新技術(shù)公司;AR224CN電子天平,奧豪斯儀器有限公司;THZ-C-L臺(tái)式冷凍恒溫振蕩器,金壇榮華公司;電熱鼓風(fēng)干燥箱,上海一恒科學(xué)儀器有限公司;XH-C旋渦混合器,無(wú)錫沃信儀器制造有限公司;AMM系列多點(diǎn)磁力攪拌器9T(加熱),天津奧特賽恩斯儀器有限公司;XH-800B智能溫壓雙控微波消解儀,北京祥鵠科技發(fā)展有限公司產(chǎn)品。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 EPI的制備

根據(jù)實(shí)驗(yàn)室前期研究所建立的方法制備EPI[9-10]。以阿膠為原料,采用胃蛋白酶和胰蛋白酶對(duì)阿膠進(jìn)行酶解,按一定質(zhì)量比與膳食鐵溶液混合,37 ℃恒溫振蕩酶解120 min。采用固定化金屬親和層析方法分離鐵螯合肽,向溶液中加入FeSO4溶液37 ℃振蕩30 min,同時(shí)加入抗壞血酸防止Fe2+氧化,螯合完畢經(jīng)冷凍干燥得EPI。

1.3.2 EPI微膠囊的制備

選用大豆分離蛋白與果膠制備EPI微膠囊,根據(jù)MENDANHA等[13]、李穎杰等[14]的方法稍作改動(dòng),制備流程如下:

EPI→大豆油-螯合物乳液(油∶螯合物=3∶1)→加大豆分離蛋白溶液(pH 8.0)→均質(zhì)得到O/W乳液→加果膠溶液→磁力攪拌→預(yù)冷(-20 ℃,36 h)→冷凍干燥(-65 ℃,24 h)→EPI微膠囊粉末

1.3.3 EPI微膠囊制備單因素試驗(yàn)

以包埋率為指標(biāo),考察壁芯質(zhì)量比、大豆分離蛋白與果膠質(zhì)量比、包埋時(shí)間對(duì)EPI微膠囊工藝的影響,確定最佳微膠囊制備工藝參數(shù)。

壁芯比對(duì)微膠囊工藝的影響:取0.2 g EPI粉末,加入0.6 g大豆油,二檔均質(zhì)5 min。設(shè)計(jì)壁芯質(zhì)量比為3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3,保持壁材中m(SPI)∶m(果膠)=5∶5。向大豆油-螯合物乳液體系中分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的SPI溶液12.0、8.0、4.0、2.0、1.3 g,采用二檔均質(zhì)10 min后得到O/W乳液,轉(zhuǎn)移至磁力攪拌器,分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的果膠溶液12.0、8.0、4.0、2.0、1.3 g,以900 r/min攪拌20 min。將所得產(chǎn)物進(jìn)行冷凍干燥,測(cè)定包埋率。

m(SPI)∶m(果膠)對(duì)微膠囊工藝的影響:取0.2 g EPI粉末,加入0.6 g大豆油,二檔均質(zhì)5 min。設(shè)計(jì)壁材中m(SPI)∶m(果膠)為3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3,保持壁芯質(zhì)量比為2∶1。向大豆油-螯合物乳液體系中分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的SPI溶液4.8、6.4、8.0、9.6、11.0 g,采用二檔均質(zhì)10 min后得到O/W乳液,轉(zhuǎn)移至磁力攪拌器,分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的果膠溶液11.2、9.6、8.0、6.4、4.8 g,以900 r/min的轉(zhuǎn)速包埋20 min。將所得產(chǎn)物進(jìn)行冷凍干燥,測(cè)定包埋率。

包埋時(shí)間對(duì)微膠囊工藝的影響:取0.2 g EPI粉末,加入0.6 g大豆油,二檔均質(zhì)5 min。保持壁芯質(zhì)量比為2∶1,壁材中m(SPI)∶m(果膠)為5∶5。向大豆油-螯合物乳液體系中分別加入8.0 g質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的SPI溶液,采用二檔均質(zhì)10 min后得到O/W乳液,轉(zhuǎn)移至磁力攪拌器,分別加入8.0 g質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的果膠溶液,以900 r/min的轉(zhuǎn)速分別攪拌10、20、30、40、50 min。將所得產(chǎn)物進(jìn)行冷凍干燥,測(cè)定包埋率。

1.3.4 EPI微膠囊制備正交試驗(yàn)

根據(jù)EPI微膠囊單因素試驗(yàn)結(jié)果,考慮適應(yīng)生產(chǎn)需求,以壁芯質(zhì)量比、SPI與果膠質(zhì)量比例、包埋時(shí)間為考察因素(表1),并考慮交互作用,以包埋率作為參考指標(biāo)設(shè)計(jì)三因素三水平正交表L27(313),探究最佳微膠囊化配方。

表1 EPI微膠囊的正交試驗(yàn)因素水平

1.3.5 EPI微膠囊的理化性質(zhì)表征

1.3.5.1 包埋率的測(cè)定與計(jì)算

以Fe2+的含量為指標(biāo),按公式(1)計(jì)算包埋率。

(1)

式中:X,包埋率;x1,1.0 mg EPI總鐵質(zhì)量,μg;x2,1.0 mg EPI微膠囊中鐵質(zhì)量,μg。

鐵含量測(cè)定:取適量樣品與5 mL濃HNO3混合,按照表2的消解程序參數(shù)進(jìn)行消解,將消解后的溶液用10%(體積分?jǐn)?shù))稀HNO3溶液定容,并根據(jù)Fe2+含量稀釋至合適濃度,采用原子吸收法測(cè)定樣品中的鐵含量[15]。

表2 樣品微波消解參數(shù)

1.3.5.2 EPI與微膠囊的形態(tài)與顯微結(jié)構(gòu)對(duì)比

實(shí)物形態(tài)對(duì)比:取在陰涼、密閉條件下儲(chǔ)存的EPI和微膠囊,拍照進(jìn)行形態(tài)對(duì)比分析。

粒徑對(duì)比:參考李穎杰等[14]的方法,使用激光粒度儀分別測(cè)定螯合物與微膠囊的粒徑分布。

顯微結(jié)構(gòu)對(duì)比:采用冷場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡(field emission scanning electron microscopy,FESEM)掃描,分別放大1 000倍、5 000倍對(duì)比觀察螯合物與微膠囊的結(jié)構(gòu)。

1.3.6 EPI微膠囊的穩(wěn)定性分析

消化穩(wěn)定性的測(cè)定方法參考王俊強(qiáng)[16]與胡喬遷[17]的方法并加以改動(dòng),具體方法如下。

分別制備2.0 mg/mL EPI溶液和EPI微膠囊分散體,各取5.0 mL置于50 mL離心管,37 ℃預(yù)熱10 min后加入5.0 mL模擬胃液,模擬胃液、腸液的配制參考《中華人民共和國(guó)藥典》[18],振蕩混勻后置于37 ℃水浴鍋避光保溫2 h,于消化開(kāi)始0、15、30、60、90、120 min時(shí)分別取1.0 mL反應(yīng)液,采用鄰菲羅啉比色法立即對(duì)所取樣品進(jìn)行Fe2+含量測(cè)定。

在上述胃消化2 h后剩余的4.0 mL體系中,加入2.0 mL模擬腸液,振蕩混勻后置于37 ℃水浴鍋避光保溫3 h,每隔30 min分別取0.5 mL反應(yīng)液,采用鄰菲羅啉比色法立即對(duì)所取樣品Fe2+含量進(jìn)行測(cè)定。

熱穩(wěn)定性分析:稱取一定質(zhì)量的EPI加入適量去離子水溶解,分別置于20、30、40、50、60、70和80 ℃水浴2 h,采用鄰菲羅啉法測(cè)量不同溫度條件下EPI的鐵螯合率。

1.3.7 腸道緩釋行為測(cè)定

購(gòu)買SPF級(jí)C57BL/6 J小鼠50只,40只飼喂低鐵飼料建立IDA小鼠模型,10只飼喂正常飼料,從第2周開(kāi)始,每周定期對(duì)小鼠進(jìn)行尾靜脈采血,測(cè)定正常組和模型組小鼠血液中血紅蛋白(hemoglobin,HGB)含量,直至小鼠HGB 含量低于標(biāo)準(zhǔn)濃度(90 g/L)即造模成功。收集小鼠各個(gè)時(shí)段的糞便,并進(jìn)行鐵含量測(cè)定,將小鼠糞便冷凍干燥后分別取50～100 mg轉(zhuǎn)移到聚四氟乙烯消解罐中,加入5 mL濃HNO3按照表2的消解程序進(jìn)行微波消解,得到澄清溶液,轉(zhuǎn)移消解液超純水定容至25 mL,用原子吸收分光光度法測(cè)定小鼠糞便中的鐵合量。分別對(duì)模型組動(dòng)物以中劑量2.0 mg Fe/kg BW對(duì)小鼠灌胃EPI和微膠囊溶液,灌胃后2 h開(kāi)始,每間隔1 h收集小鼠糞便進(jìn)行低溫冷凍干燥,稱量各時(shí)段糞便樣品質(zhì)量并測(cè)定鐵含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素分析

2.1.1 壁芯比對(duì)包埋率的影響

壁材與芯材的比例是決定芯材包埋率的一個(gè)重要因素。本實(shí)驗(yàn)中的壁材為SPI和果膠,芯材為EPI和大豆油。SPI具有較高的電荷性和較多的親水、疏水基團(tuán),在體系中具有強(qiáng)乳化性,能較好地起到穩(wěn)定芯材的作用[19];果膠具有較高的穩(wěn)定性、膠凝性,可以作為乳化穩(wěn)定劑穩(wěn)定水油乳濁液[20]。如圖1-a所示,隨著壁芯比的逐漸增大,芯材的包埋率先增加后減小。當(dāng)壁芯質(zhì)量比為1∶3和1∶2時(shí),芯材的包埋率較低,此時(shí)體系中的SPI與果膠含量過(guò)少,難以形成凝膠網(wǎng)絡(luò)狀體系,因此對(duì)芯材的包覆能力不足。當(dāng)壁芯質(zhì)量比為2∶1時(shí),芯材的包埋率達(dá)最大值74.30%。當(dāng)壁芯比為3∶1時(shí),芯材的包埋率開(kāi)始出現(xiàn)下降,可能因?yàn)榇藭r(shí)SPI與果膠過(guò)多,造成兩者在溶液中凝集,不利于對(duì)芯材的包埋。因此,最適宜的壁芯質(zhì)量比為2∶1。

a-壁芯質(zhì)量比;b-m(SPI)∶m(果膠);c-包埋時(shí)間

壁芯比的變化反映了體系中大豆油的含量變化,隨著壁芯比的增加,大豆油含量也隨之減少。在大豆油含量減少的過(guò)程中,包埋率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì),在大豆油占乳液總含量1/4時(shí)達(dá)到最高包埋率。在包埋過(guò)程中,大豆分離蛋白可以自發(fā)地結(jié)合到油-水界面,通過(guò)非共價(jià)相互作用在油滴周圍形成凝膠狀膜,可抵抗油滴的聚結(jié),使乳液具有優(yōu)秀的穩(wěn)定性[21]。隨著大豆油相對(duì)含量的適度減少與壁材的增多,降低了在乳化過(guò)程中油滴分布不均勻的幾率,避免了油滴聚集,形成了更穩(wěn)定的O/W體系。當(dāng)大豆油含量過(guò)少時(shí),油水比例失衡,包埋率反而下降。

此外,隨著大豆油的增加,經(jīng)冷凍干燥后得到的微膠囊粉末也呈現(xiàn)出表面更濕潤(rùn)的特點(diǎn),可能是大豆油過(guò)多時(shí)油-水比例失衡,導(dǎo)致形成的O/W體系不穩(wěn)定,使部分油滴聚結(jié)、外泄,導(dǎo)致包埋率下降的同時(shí),微膠囊的外觀也受到了較大的影響,表現(xiàn)出不良感官體驗(yàn)。

2.1.2 SPI與果膠比例對(duì)包埋率的影響

如圖1-b所示。當(dāng)m(SPI)∶m(果膠)為3∶7至5∶5之間時(shí),即SPI含量小于果膠時(shí),隨著比例的增大,包埋率上升。當(dāng)m(SPI)∶m(果膠)為5∶5時(shí),芯材包埋率達(dá)最大值73.61%。當(dāng)m(SPI)∶m(果膠)比例繼續(xù)增大時(shí),即SPI含量大于果膠時(shí),隨著比例的增大,包埋率先下降后保持平穩(wěn)。因?yàn)樵诎竦捏w系中,SPI具有強(qiáng)乳化性;而果膠具有較高的穩(wěn)定性、膠凝性。當(dāng)SPI含量過(guò)高時(shí),果膠含量過(guò)低時(shí),體系缺乏穩(wěn)定性,無(wú)法形成足夠穩(wěn)定的凝膠結(jié)構(gòu)將芯材完全包覆,使包埋率下降;當(dāng)SPI含量過(guò)低時(shí),果膠含量過(guò)高時(shí),由于果膠過(guò)于黏稠,無(wú)法使壁材與芯材充分接觸,從而影響包埋率。因此,最適宜的SPI與果膠質(zhì)量比例為5∶5。

2.1.3 包埋時(shí)間對(duì)包埋率的影響

如圖1-c所示,在不改變其他工藝條件時(shí),包埋時(shí)間越長(zhǎng),包埋率逐漸升高后降低,在40 min處達(dá)到最大值78.72%。當(dāng)攪拌時(shí)間<40 min時(shí),隨著攪拌時(shí)間的延長(zhǎng),包埋率逐漸增大。充分的攪拌可以促使體系變得均一穩(wěn)定,讓果膠能夠更好地包覆在芯材和SPI表面,因此包埋率逐漸增大。當(dāng)攪拌時(shí)間足夠充分后,繼續(xù)攪拌,對(duì)包埋率的影響并不明顯,故攪拌時(shí)間50 min處的包埋率與40 min時(shí)未呈現(xiàn)顯著性差異(P>0.05)。因此,最適宜的攪拌時(shí)間在40 min左右。

2.2 正交試驗(yàn)分析

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果得到制備EPI微膠囊適宜的壁芯質(zhì)量比、SPI與果膠的質(zhì)量比例以及包埋時(shí)間。為了進(jìn)一步考察各因素對(duì)EPI微膠囊芯材包埋率影響的主次關(guān)系和交互作用,并得到最優(yōu)的制備工藝條件,以上述指標(biāo)為3個(gè)因素,并選取適當(dāng)水平,進(jìn)行正交試驗(yàn)。對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行極差和方差分析,如表3和表4所示。

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果和極差分析

表4 正交試驗(yàn)結(jié)果的方差分析

由表3可知,正交試驗(yàn)極差的順序比較依次為:A(壁芯比)>B(SPI:果膠)>C(包埋時(shí)間),表明壁芯比為排名第一位的影響因素,第二重要的影響因素是SPI與果膠的比例,最后的影響因素是攪拌時(shí)間。對(duì)正交試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析(表4),當(dāng)各變異來(lái)源的平均偏差平方和大于誤差e△的平均偏差平方和時(shí)即具備F值,當(dāng)F值大于相應(yīng)自由度下的Fα?xí)r表明該因素差異顯著。方差分析結(jié)果顯示,因素A、B具有顯著性(P<0.05),表明壁芯質(zhì)量比、SPI與果膠的質(zhì)量比例對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有重要影響,且A與B條件存在交互作用,而C(攪拌時(shí)間)對(duì)包埋率的影響不顯著(P>0.05)。制備EPI微膠囊的最優(yōu)參數(shù)組合為A3B2C1,即:壁芯質(zhì)量比為3∶1、m(SPI)∶m(果膠)為6∶4、攪拌時(shí)間為30 min,為序號(hào)22的實(shí)驗(yàn)。該組合能使包埋率最高,包埋率達(dá)86.69%,驗(yàn)證后發(fā)現(xiàn)大于表3中各組包埋率,可確定該組合是最優(yōu)工藝參數(shù)。

2.3 理化性質(zhì)表征

2.3.1 EPI微膠囊實(shí)物形態(tài)

對(duì)最優(yōu)工藝參數(shù)制備得到的EPI微膠囊進(jìn)行感官評(píng)價(jià),評(píng)估其色澤、氣味和組織狀態(tài)。品質(zhì)較好的微膠囊具備以下特征:光滑、顆粒均勻、無(wú)異味、呈圓球形且結(jié)構(gòu)緊密[22]。如圖2所示,EPI粉末呈棕褐色,顆粒小,存在輕微鐵銹味,EPI微膠囊呈淺褐色,顆粒變大,外觀蓬松,略帶乳粉香氣。大豆分離蛋白和果膠的包覆使得微膠囊顏色變淺,且包埋掩蓋了EPI的鐵銹味,使其具備更加優(yōu)良的氣味特征。

a-EPI;b-EPI微膠囊

2.3.2 EPI微膠囊粒徑分布

EPI微膠囊的粒度測(cè)定結(jié)果如圖3所示,EPI粒度呈偏態(tài)分布,分布較為分散,推測(cè)可能是樣品在進(jìn)行粒徑測(cè)定時(shí)發(fā)生了聚集,導(dǎo)致粒度分布范圍廣,不均一,平均粒度為89.48 μm。而經(jīng)過(guò)包埋處理后制得的EPI微膠囊粒徑分布范圍變窄,呈正態(tài)分布,平均粒徑為119.50 μm?？梢?jiàn)微膠囊化包埋處理改善了EPI粒徑分布過(guò)于分散的問(wèn)題。

a-EPI;b-EPI微膠囊

2.3.3 EPI微膠囊顯微結(jié)構(gòu)

如圖4所示, EPI呈大小不一的片狀結(jié)構(gòu),表面光滑平整,呈折疊聚集狀,并形成了部分?jǐn)嗔丫奂膱F(tuán)狀顆粒。這是由于Fe2+與多肽鏈中的羧基氧和氨基氮結(jié)合,導(dǎo)致多肽鏈發(fā)生折疊造成的[11]。經(jīng)過(guò)包埋制得的EPI微膠囊形態(tài)上發(fā)生了較明顯的變化,呈凝聚黏連的球狀結(jié)構(gòu),表面致密,無(wú)棱角,表明壁材對(duì)EPI進(jìn)行了完整包覆。但EPI微膠囊并未呈完美的球狀或橢球狀微膠囊形態(tài),推測(cè)這是由于EPI本身的不規(guī)則片狀結(jié)構(gòu),且果膠包埋后相互之間出現(xiàn)了黏連所導(dǎo)致的。

a-EPI 1 000×;b-EPI微膠囊1 000×;c-EPI 5 000×;d-EPI微膠囊5 000×

2.3.4 含水量和吸水性

MENDANHA等[13]的研究顯示含水量和吸水性是顯著評(píng)價(jià)微膠囊效果的參考指標(biāo),也是評(píng)價(jià)微膠囊穩(wěn)定性的指標(biāo)。EPI與EPI微膠囊的含水量和吸水性的測(cè)定結(jié)果表明(表5),兩者含水量相差不大,但EPI的吸水性約為微膠囊產(chǎn)品的2倍,即EPI微膠囊自由狀態(tài)下的吸水性較芯材EPI顯著降低,更便于儲(chǔ)藏。

表5 EPI和EPI微膠囊的含水量和吸水性

2.4 穩(wěn)定性分析

2.4.1 消化穩(wěn)定性

以大豆分離蛋白和果膠包埋EPI的目的在于保護(hù)EPI在胃部免受胃酸破壞,能更穩(wěn)定地到達(dá)腸道吸收部位,并在消化過(guò)程中盡量減少Fe2+的產(chǎn)生。因此對(duì)EPI和EPI微膠囊的胃腸道消化穩(wěn)定性進(jìn)行考察。如圖5-a所示,在胃消化過(guò)程中(0～120 min),EPI及其微膠囊均釋放出Fe2+,但初始狀態(tài)下EPI即釋放出更多Fe2+。在胃消化前60 min,兩者Fe2+含量均顯著升高,胃消化60～120 min,Fe2+升高幅度明顯減緩?？傮w而言,EPI在胃消化過(guò)程中游離Fe2+的濃度均高于EPI微膠囊,表明EPI微膠囊具備更高的胃消化穩(wěn)定性。

a-模擬胃消化;b-模擬腸消化

如圖5-b所示,在腸消化過(guò)程中,EPI與EPI微膠囊消化性能差異顯著。胃消化后進(jìn)入腸消化的過(guò)程中,由于pH的快速改變,EPI及其微膠囊的Fe2+濃度發(fā)生了較大的改變。腸消化初期,EPI溶液中Fe2+依然逐步上升,而EPI微膠囊Fe2+含量發(fā)生了下降。推測(cè)可能是由于本實(shí)驗(yàn)所采用的大豆分離蛋白(等電點(diǎn)pI=8.0)在酸性環(huán)境下更容易溶解釋放出部分EPI,且實(shí)驗(yàn)所采用的低酯果膠在較高pH值條件下更為穩(wěn)定,因此在腸消化段,果膠再次發(fā)生聚集。在腸消化開(kāi)始30 min之后,EPI和EPI微膠囊的Fe2+釋放趨勢(shì)相同,均呈現(xiàn)緩慢增長(zhǎng),但微膠囊釋放的Fe2+顯著低于EPI,表明在腸道消化環(huán)境下,微膠囊比EPI更穩(wěn)定。其原因可能是微膠囊以大豆分離蛋白和果膠作為壁材,對(duì)EPI起到了保護(hù)的作用,從而使Fe2+在消化道中保持結(jié)合形態(tài),便于EPI直接以肽鐵螯合物分子的形式被人體吸收,能夠提高其利用率[23-24]。

有研究表明,果膠的膠鏈之間可通過(guò)作用力形成三維網(wǎng)狀凝膠結(jié)構(gòu)包覆益生菌,其中高酯果膠靠氫鍵連接,低酯果膠靠靜電相互作用連接,包覆后形成的微膠囊可幫助益生菌抵抗胃腸道的強(qiáng)酸性環(huán)境[25]。ZHANG等[26]利用Ca2+交聯(lián)甜菜果膠法提高了唾液乳桿菌在胃腸道模擬消化條件下的存活率。因此包埋有利于保持EPI的螯合率及活性。在腸消化60～90 min過(guò)程中,EPI和EPI微膠囊所釋放的Fe2+濃度均有所下降。氨基酸殘基與金屬相互作用的有效性與pH有關(guān),肽的凈電荷也是如此,它可能變成中性、負(fù)性或正電荷,從而阻礙或促進(jìn)靜電相互作用[27],因此推測(cè)此時(shí)游離Fe2+與肽重新發(fā)生了螯合。

2.4.2 熱穩(wěn)定性

EPI和EPI微膠囊的熱穩(wěn)定性測(cè)定結(jié)果如圖6所示,EPI的鐵螯合率隨著溫度的升高逐漸下降,50 ℃時(shí)螯合率達(dá)到最低值,50 ℃以上趨于穩(wěn)定。EPI微膠囊在所測(cè)定的各個(gè)溫度下,螯合率均高于EPI。表明EPI微膠囊具有更高的熱穩(wěn)定性。陳忠寶[28]利用離子交聯(lián)法,以果膠與殼聚糖作為壁材包埋制備得到的藍(lán)靛果多酚微膠囊,其在 100 ℃下的穩(wěn)定性較芯材多酚提升了27.3%,與本文得出的結(jié)果類似。

圖6 EPI和EPI微膠囊的熱穩(wěn)定性

2.5 腸道緩釋行為分析

灌胃前小鼠各個(gè)時(shí)段的糞便鐵含量測(cè)定結(jié)果如圖7-a所示。由于期間仍攝食低鐵飼料,故IDA小鼠糞便中仍含有微量鐵,鐵含量呈小范圍波動(dòng),總體保持平穩(wěn)。如圖7-b所示,灌胃EPI后4 h,糞便中鐵含量快速上升,在接近6 h時(shí)達(dá)到最高值9.66 μg/h,隨后逐漸下降,8 h處略微升高,之后下降并趨于平緩。灌胃EPI微膠囊后6 h,糞便鐵含量快速上升,在接近8 h時(shí)達(dá)到最高值6.80 μg/h,隨后鐵含量降低,在9～10 h略有上升后趨于平緩。從結(jié)果中可以發(fā)現(xiàn),補(bǔ)充EPI及EPI微膠囊后糞便中的鐵含量都出現(xiàn)了快速上升的高峰,這是由于灌胃補(bǔ)鐵劑引起瞬時(shí)鐵濃度上升,機(jī)體消化吸收后排出的剩余鐵所引起的糞便鐵含量升高。但EPI微膠囊的鐵含量的達(dá)峰時(shí)間較EPI延遲2 h,分析原因可能是微膠囊有壁材包裹,胃腸道中的酶先對(duì)果膠和大豆分離蛋白進(jìn)行酶解消化,故延緩了EPI釋放的時(shí)間,表明EPI微膠囊達(dá)到了緩釋的效果。

a-灌胃前;b-灌胃后

分別計(jì)算EPI鐵含量曲線4～7 h和EPI微膠囊鐵含量曲線6～9 h下的面積(最高峰出現(xiàn)時(shí)段),其面積大致可以反映糞便排出的最大鐵量,結(jié)果表明,攝入EPI曲線面積為37.67 μg,EPI微膠囊的曲線面積為26.92 μg,未被吸收的鐵越多,表明機(jī)體吸收利用越少。以上結(jié)果顯示EPI微膠囊可以降低糞便中殘余鐵的含量,并降低鐵排出瞬時(shí)濃度,提高鐵的吸收利用度,達(dá)到緩釋效果。徐軍等[29]研究表明,口服琥珀酸亞鐵緩釋片可以降低鐵的釋放速率和鐵吸收進(jìn)入機(jī)體的速率,避免胃腸道Fe2+峰濃度過(guò)大,與本研究結(jié)果相似。此外,相較于緩釋處理前的藥物,該緩釋片減小了對(duì)妊娠期IDA女性的胃腸道刺激性,極大減少惡心嘔吐、胃疼、腹瀉等不良反應(yīng)。故EPI微膠囊有望更好地調(diào)控IDA小鼠的腸道健康,但其功效仍需進(jìn)一步研究。

3 結(jié)論

本研究采用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)方法探究EPI微膠囊化最優(yōu)工藝,通過(guò)單因素試驗(yàn)分別考察壁芯質(zhì)量比、SPI與果膠質(zhì)量比例、攪拌時(shí)間對(duì)包埋率的影響,得到最適宜的壁芯質(zhì)量比為2∶1,SPI與果膠質(zhì)量比為5∶5,攪拌時(shí)間為40 min。通過(guò)正交試驗(yàn)進(jìn)一步考察各因素影響EPI微膠囊芯材包埋率的主次關(guān)系,并得到最優(yōu)參數(shù)組合:壁芯質(zhì)量比3∶1、SPI與果膠質(zhì)量比6∶4、攪拌時(shí)間30 min,包埋率達(dá)86.69%。對(duì)最優(yōu)條件下制得的EPI微膠囊進(jìn)行理化性質(zhì)的表征,結(jié)果表明EPI微膠囊的粒徑分布更窄,平均粒徑為119.50 μm;吸水性顯著降低至(25.64±0.97)%。EPI微膠囊在胃腸道模擬消化過(guò)程中釋放的Fe2+含量顯著低于EPI(P<0.05),在20～80 ℃下的鐵螯合量顯著高于EPI(P<0.05),表明其消化穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性提高。此外,EPI微膠囊還可以降低糞便中殘余鐵的含量,將腸道鐵含量達(dá)峰時(shí)間延遲2 h。研究結(jié)果為阿膠產(chǎn)品開(kāi)發(fā)的多樣化提供了科學(xué)基礎(chǔ)。