一株耐單寧酵母菌的篩選、鑒定及發(fā)酵特性

譚川川,何勁*,魏雨萌,辛文燕,姚蜜,岑順友

1(貴陽學(xué)院 食品與制藥工程學(xué)院,貴州 貴陽,550005)2(貴州省果品加工工程技術(shù)研究中心,貴州 貴陽,550005)3(貴州宏財(cái)聚農(nóng)投資有限責(zé)任公司,貴州 六盤水,553537)

單寧,又稱鞣酸,多酚類化合物,源于植物的次級(jí)代謝產(chǎn)物,多分布于葉、種子、果肉、表皮等,主要形式為黃烷-3-醇與兒茶素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯等以C4～C6或C4～C8鍵構(gòu)成的聚合物[1],具有抗氧化、降血糖、抗腫瘤、修復(fù)口腔黏膜、提高免疫力等功效[2-3],已被廣泛用于食品、醫(yī)藥等方面。單寧廣泛存在于刺梨、石榴等多種水果中,具有保護(hù)花色苷、提高色素附著,抑制微生物侵染等作用[4-5]。單寧較高的水果,一般富含維生素類、多糖類、皂苷類等多種活性物質(zhì),是良好的釀造原料[6]。單寧在果酒中作為非揮發(fā)性成分,有助于感知口感、平衡酒體、沉淀蛋白、影響發(fā)酵過程香氣物質(zhì)的轉(zhuǎn)化及釋放[7-8]。過高的單寧含量會(huì)使酵母細(xì)胞壁蛋白的黏附性降低,導(dǎo)致發(fā)酵遲緩或菌體死亡,減弱發(fā)酵能力[9]。此外,部分微生物會(huì)分泌單寧酶,以降低單寧對(duì)自身的損害。目前,商業(yè)酵母在高單寧水果發(fā)酵中存在發(fā)酵不徹底、酯香不足、口味不佳等問題。國內(nèi)外企業(yè)一般采用降低單寧以適應(yīng)發(fā)酵,使得果酒品質(zhì)不穩(wěn)定。因此,從高單寧水果篩選耐受性好的野生酵母,延長(zhǎng)酵母在釀造中的作用時(shí)間,對(duì)更好地開發(fā)高單寧水果資源具有實(shí)際意義。

本研究以單寧脅迫策略從高單寧水果(刺梨、石榴、青李)中特異性分離、篩選得到貝氏酵母1株,對(duì)其最適生長(zhǎng)溫度、最適生長(zhǎng)pH及耐單寧、耐乙醇、耐葡萄糖、耐SO2性能進(jìn)行檢測(cè),并對(duì)其發(fā)酵性能及風(fēng)味組成進(jìn)行評(píng)估,旨在獲得適合高單寧水果發(fā)酵的酵母菌株,為豐富酵母資源及提升果酒釀造品質(zhì)提供支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

刺梨、石榴、青李,貴州、四川等地區(qū);釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)SY,安琪酵母股份有限公司;2,3,5-三苯基氯化四氮唑(2,3,5-triphenyl tetrazolium chloride,TTC)、單寧酸,Solarbio公司;WL營(yíng)養(yǎng)瓊脂,杭州百思生物科技有限公司;纖維二糖、棉子糖、松三糖,杭州濱和微生物試劑有限公司;2-酮基-D-葡萄糖酸半鈣、甲基-α-D-葡萄糖苷,上海源葉生物科技有限公司;焦亞硫酸鉀,上海麥克林生化科技有限公司。

YPD培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖20、蛋白胨20、酵母浸膏10、瓊脂20,液體不加瓊脂;TTC培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖5、瓊脂15、TTC 0.5;果酒發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):刺梨渣60、拐棗渣20、水150、焦亞硫酸鉀0.08,調(diào)整至糖度為20 °Brix,pH為4.6。以上培養(yǎng)基配制完成后,均于105 ℃滅菌10 min。

MHP-160霉菌培養(yǎng)箱,上海精其儀器有限公司;DH5000B高壓蒸汽滅菌鍋,上海申安醫(yī)療器械廠;SHZ-S2氣浴恒溫振蕩器,常州金壇良友儀器有限公司;PEN3型電子鼻,德國AIRSENSE公司;PYL-3糖度計(jì),日本ATAGO公司;PHS-3C型pH計(jì),上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 酵母菌的分離純化

挑取刺梨、脆青李、石榴腐爛部位劃線到Y(jié)PD培養(yǎng)基中,28 ℃培養(yǎng),挑選形態(tài)類似酵母的菌落,多次純化得到單一菌落,編號(hào)斜面保藏。

1.2.2 耐單寧酵母的篩選

將上述保藏菌株,以4 g/L單寧的YPD培養(yǎng)基,結(jié)合WL(wallerstein laboratory)培養(yǎng)基顯色法、TTC顯色法、杜氏小管產(chǎn)氣法、嗅聞法、顯微鏡法篩選優(yōu)良性能的菌株。

1.2.3 耐單寧酵母N1的鑒定

形態(tài)學(xué)觀察:將N1菌株劃線于含有4 g/L單寧的YPD培養(yǎng)基上培養(yǎng)48 h,觀察酵母菌落特征;并挑取酵母菌體制片,在100倍油鏡下觀察酵母微觀形態(tài)。

生理生化鑒定:參考TheYeasts,aTaxonomicStudy手冊(cè),進(jìn)行糖發(fā)酵、碳源同化、氮源同化、37 ℃生長(zhǎng)、無維生素生長(zhǎng)、酸性環(huán)境生長(zhǎng)、重氮基藍(lán)B等試驗(yàn)。

分子生物學(xué)鑒定:采用通用引物ITS1/ITS4擴(kuò)增ITS并測(cè)序,序列經(jīng)GenBank數(shù)據(jù)庫比對(duì),采用MAGE-7軟件以鄰接(neighbor-joining, NJ)法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.4 耐單寧酵母N1的生長(zhǎng)及耐受特性

1.2.4.1 生長(zhǎng)特性

種子液制備:挑取斜面菌株接入YPD液體培養(yǎng)基中,28 ℃,150 r/min搖床培養(yǎng),使OD600在0.5～0.6之間。

最適生長(zhǎng)溫度、最適pH的確定:分別設(shè)置溫度為16、20、24、28、32、36、40 ℃;pH為3、4、5、6、7、8,接種量2%(體積分?jǐn)?shù),下同),150 r/min培養(yǎng)24 h,測(cè)定其OD600值。

生長(zhǎng)曲線測(cè)定:按最適生長(zhǎng)溫度、最適pH重新制備種子液,接種量2%,150 r/min搖床培養(yǎng)。每4 h取樣,測(cè)定其OD600值。以未接種培養(yǎng)基為空白對(duì)照,繪制生長(zhǎng)曲線。

1.2.4.2 耐受性

耐單寧試驗(yàn):參考KANPIENGJAI等[10]的方法,分別配制單寧濃度為0、2、4、8、16、32 g/L的YPD培養(yǎng)基,以牙簽穿刺接種,28 ℃培養(yǎng)48 h,記錄生長(zhǎng)狀況及菌落直徑。

耐葡萄糖試驗(yàn):以2%接種量分別接種于200、250、300、350、400 g/L不同葡萄糖質(zhì)量濃度的YPD液體培養(yǎng)基,28 ℃培養(yǎng)24 h,測(cè)定其OD600值。

耐乙醇試驗(yàn):以2%接種量分別接種于4%、8%、12%、16%、20%、24%不同乙醇體積的YPD液體培養(yǎng)基,28 ℃培養(yǎng)24 h,測(cè)定其OD600值。

耐SO2試驗(yàn):以K2S2O5調(diào)節(jié)SO2濃度,以2%接種量分別接種于50、100、150、200、250 mg/L不同SO2質(zhì)量濃度的YPD液體培養(yǎng)基,28 ℃培養(yǎng)24 h,測(cè)定其OD600值。

1.2.5 耐單寧酵母N1的單寧降解轉(zhuǎn)化試驗(yàn)

參考丁棟等[11]的方法,以單寧濃度為橫坐標(biāo),OD530值為縱坐標(biāo),構(gòu)建單寧標(biāo)準(zhǔn)曲線。取10 g刺梨干粉加50 g水,高溫高壓滅菌備用。以2 mL接種量接種,2 mL無菌水為空白對(duì)照,28 ℃發(fā)酵處理5 d,測(cè)定單寧含量。單寧降解率的計(jì)算如公式(1)所示:

(1)

1.2.6 耐單寧酵母N1的果酒發(fā)酵試驗(yàn)

1.2.6.1 發(fā)酵力

按8%的接種量于刺梨果酒發(fā)酵培養(yǎng)基,22 ℃發(fā)酵。每24 h測(cè)定質(zhì)量損失以監(jiān)測(cè)發(fā)酵,發(fā)酵15 d。

1.2.6.2 發(fā)酵指標(biāo)測(cè)定

發(fā)酵結(jié)束后測(cè)定發(fā)酵液中酒精度、總酯、殘?zhí)恰⒖偹?、干浸出物含量。參照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[12]及GB/T 10345—2022《白酒分析方法》[13]測(cè)定。

1.2.7 耐單寧酵母N1的發(fā)酵果酒風(fēng)味成分分析

采用PEN3型電子鼻進(jìn)行果酒風(fēng)味成分測(cè)定。方法參照CAO等[14]修改,樣品重復(fù)測(cè)定5次;將WinMuster數(shù)據(jù)用SPSS軟件、Origin 2021進(jìn)行雷達(dá)圖響應(yīng)值分析、傳感器貢獻(xiàn)率分析(loadings analysis)、主成分分析(principal component analysis, PCA)。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母菌形態(tài)及培養(yǎng)特征

經(jīng)分離純化,初步得到45株耐單寧酵母菌株,11株來自刺梨,11株來自脆青李,23株來自石榴。經(jīng)篩選,獲得1株性能良好的耐單寧酵母菌N1,見圖1。酵母在4 g/L單寧的YPD培養(yǎng)基上呈乳白色,圓形凸起,表面濕潤(rùn),黏稠,有光澤,有強(qiáng)烈的果香味,酒精味;顯微鏡下呈圓形,出芽生殖。

a-在YPD培養(yǎng)基上菌落形態(tài);b-顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)

2.2 耐單寧酵母N1的鑒定

由圖2可知,菌株N1,與貝氏酵母(Saccharomycesbayanus×Saccharomycescerevisiae)(LT577618.1)聚于一個(gè)分支,具有100%的相似度;生理生化特征也一致,見表1。最終鑒定菌株N1為貝氏酵母(Saccharomycesbayanus)。

表1 菌株N1生理生化鑒定試驗(yàn)結(jié)果

圖2 基于ITS序列菌株N1系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 生長(zhǎng)及耐受性試驗(yàn)

2.3.1 最適生長(zhǎng)溫度、最適pH及生長(zhǎng)曲線

N1最適生長(zhǎng)溫度、最適pH及生長(zhǎng)曲線見圖3。溫度能影響酵母對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的代謝轉(zhuǎn)化速率,影響發(fā)酵的整體風(fēng)味[15]。N1受溫度影響較大,吸光值呈先增加后下降的顯著趨勢(shì)(P<0.05),28 ℃有最大吸光值,為最適生長(zhǎng)溫度;pH能影響酵母原生質(zhì)膜電荷轉(zhuǎn)移,改變離子滲透性,進(jìn)而影響生長(zhǎng)[16]。N1在pH 3～8時(shí)吸光值呈先增加后下降的顯著趨勢(shì)(P<0.05),在pH 6時(shí)有最大吸光值,且酸性條件生長(zhǎng)良好,能夠適應(yīng)低pH環(huán)境;由生長(zhǎng)曲線可知,N1在0～8 h處于延遲期,生長(zhǎng)緩慢;8 h后進(jìn)入對(duì)數(shù)期,繁殖旺盛,24 h時(shí)增速減緩;36 h后進(jìn)入穩(wěn)定期,菌體密度穩(wěn)定;72 h后進(jìn)入衰亡期。

a-最適溫度;b-最適pH;c-生長(zhǎng)曲線

2.3.2 耐受性試驗(yàn)

糖類是酵母增殖發(fā)酵所必需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[17]。如圖4-a所示,隨著葡萄糖的增加,N1的吸光值呈先增加后減小趨勢(shì)(P<0.05)。N1在質(zhì)量濃度為400 g/L時(shí)仍有較好的耐受,滿足果酒發(fā)酵要求。

a-葡萄糖耐受性;b-乙醇耐受性;c-SO2耐受性;d-單寧耐受性

醇類會(huì)影響酵母相關(guān)膜及代謝通路的穩(wěn)定性,阻礙酵母生長(zhǎng)和糖利用能力[18-19]。隨著乙醇濃度的增加,N1的吸光值逐漸降低,在16%后受到明顯抑制(圖4-b),符合低度果酒發(fā)酵。

SO2在果酒中可以提高澄清率、防止酸敗,但SO2殘留會(huì)影響果酒品質(zhì)。如圖4-c所示,SO2濃度與N1生長(zhǎng)呈負(fù)相關(guān)性;N1在250 mg/L SO2下仍可正常生長(zhǎng),具有一定的SO2耐受能力。

單寧可與酵母蛋白質(zhì)和相關(guān)酶系反應(yīng),從而阻礙生長(zhǎng)[20]。隨著單寧濃度的升高,N1生長(zhǎng)受到抑制導(dǎo)致菌落直徑減小;N1在單寧質(zhì)量濃度為32 g/L時(shí)仍能生長(zhǎng),屬于高耐單寧酵母(圖4-d)。

2.4 單寧降解試驗(yàn)

部分微生物可在含有單寧的環(huán)境中穩(wěn)定增殖,并分泌單寧酶將單寧降解,包括細(xì)菌、霉菌、酵母等[21]。依照單寧標(biāo)準(zhǔn)曲線及降解率公式計(jì)算,結(jié)果見圖5。

a-單寧標(biāo)準(zhǔn)曲線;b-單寧含量及降解率

隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng),樣品中單寧含量先上升后下降(P<0.05)。相比對(duì)照組,處理組N1在發(fā)酵第2天單寧含量開始下降,這與發(fā)酵前期N1迅速增殖有關(guān)。發(fā)酵第5天時(shí),單寧含量降至最低,降解率達(dá)到最高為40.01%。

2.5 刺梨果酒發(fā)酵試驗(yàn)

2.5.1 發(fā)酵力測(cè)定

酵母的發(fā)酵性能與起酵速率有關(guān),起酵速度越快,酵母轉(zhuǎn)化能力越強(qiáng)[22]。以SY(釀酒酵母)為對(duì)照,繪制發(fā)酵時(shí)間與質(zhì)量損失的關(guān)系曲線,結(jié)果見圖6。N1起酵速率快,在24 h進(jìn)入發(fā)酵旺盛期。發(fā)酵后總失重量為20.15 g,質(zhì)量損失主要集中在前期,這與蒲鵬飛[23]對(duì)海紅果酒發(fā)酵分析結(jié)果一致。在發(fā)酵10 d時(shí)失重趨于穩(wěn)定,在15 d時(shí)發(fā)酵基本結(jié)束。

圖6 各菌株發(fā)酵過程失重曲線

2.5.2 理化指標(biāo)分析

發(fā)酵指標(biāo)測(cè)定結(jié)果見表2。N1發(fā)酵液酒精度為9.23%vol低于SY,這與一般認(rèn)為非釀酒酵母產(chǎn)酒能力普遍低于釀酒酵母的結(jié)論一致。酯類物質(zhì)是果酒重要的風(fēng)味物質(zhì)[24]。N1總酯更高,為1.36 g/L,含有更多的香味物質(zhì);酸類物質(zhì)在果酒中可以豐富果酒品質(zhì),提升口感。N1總酸為6.02 g/L,發(fā)酵液整體總酸偏高,這可能與刺梨維生素C含量高有關(guān)。對(duì)糖的利用能力能夠反映菌種的發(fā)酵效能,殘?zhí)窃降?效能越高[25]。N1殘?zhí)橇繛?.31 g/L,發(fā)酵效能良好;干浸出物與果酒原料及發(fā)酵方式有關(guān),干浸出物含量越高則果酒品質(zhì)越高[26]。N1干浸出物質(zhì)量濃度為57.1 g/L,符合高品質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)合酒精產(chǎn)量、產(chǎn)酯及糖利用率等情況可知,N1發(fā)酵性能良好。

表2 菌株N1發(fā)酵第10天理化指標(biāo)

2.6 刺梨果酒電子鼻風(fēng)味分析

2.6.1 電子鼻風(fēng)味物質(zhì)的響應(yīng)雷達(dá)圖與傳感器貢獻(xiàn)率分析

非釀酒酵母與釀酒酵母相比,參與發(fā)酵會(huì)分泌各種脂肪酶、蛋白酶、糖苷酶等酶系,產(chǎn)生各種高級(jí)代謝產(chǎn)物,提高果酒風(fēng)味的復(fù)雜性[24]。由圖7可知,N1在傳感器W1W、W1S、W5S響應(yīng)值明顯高于SY,產(chǎn)生更多烯烴類、甲基烷烴類、氮氧化合物等成分。N1雷達(dá)圖整體類似SY,與KB有明顯差異。載荷圖中總貢獻(xiàn)率為99.5%。W1S傳感器對(duì)第一主成分的貢獻(xiàn)率最大,為甲基烷烴類物質(zhì);W2S傳感器對(duì)第二主成分的貢獻(xiàn)率最大,為醇類物質(zhì)。傳感器W1S、W1C、W3C的敏感性高,風(fēng)味貢獻(xiàn)率較大,表明發(fā)酵液主要風(fēng)味為烷烴類、芳香苯類、芳香胺類。

a-響應(yīng)雷達(dá)圖;b-傳感器載荷分析圖

2.6.2 主成分分析法

利用PCA表示各樣品風(fēng)味與電子鼻結(jié)果的關(guān)系,結(jié)果見圖8。第一主成分和第二主成分貢獻(xiàn)率分別達(dá)到了90.6%和8.9%。N1分布于第四象限,SY分布于第一象限。N1與SY在第二主成分呈負(fù)相關(guān),風(fēng)味占比不同,具有一定的差異性。表明電子鼻可以有效區(qū)分不同菌株的風(fēng)味物質(zhì)組成,具有可靠性。

圖8 N1、SY、KB電子鼻數(shù)據(jù)PCA圖

3 討論

傳統(tǒng)酵母資源庫已無法滿足各類特色果酒開發(fā),酵母選育已是果酒發(fā)酵最重要的環(huán)節(jié)之一。目前,從水果發(fā)酵液中篩選野生酵母,提高果酒的發(fā)酵品質(zhì),依然是主要的篩選方式。吳德光等[25]從三華李中分離出釀酒酵母,具有高產(chǎn)酒精的發(fā)酵潛力。杜亞軍等[27]從紅棗中分離出一株釀酒酵母,發(fā)酵酸度低且產(chǎn)香豐富,解決了棗酒殘?zhí)禽^高、缺少風(fēng)味等共性問題。大部分水果中含有酸類、酚類、皂苷類等各種抑菌類活性物質(zhì),傳統(tǒng)酵母缺乏一定的耐受能力,從而影響酵母增殖致使發(fā)酵效果降低。目前,對(duì)于高耐受性酵母的選育,提高水果的開發(fā)潛力,對(duì)產(chǎn)業(yè)升級(jí)改革具有實(shí)際意義。

貝氏酵母(Saccharomycesbayanus)是一種常用于果酒發(fā)酵的非釀酒酵母菌,通過釋放酶和香氣成分來增強(qiáng)果酒的多樣性和復(fù)雜性[28]。LIU等[29]發(fā)現(xiàn),貝氏酵母不僅可提高辛酸乙酯和己酸乙酯的氣味活性值,還可與釀酒酵母共培養(yǎng)增加癸醇和萜烯-4-醇等特征風(fēng)味含量。JANUSZEK等[30]利用貝氏酵母發(fā)酵蘋果白蘭地,產(chǎn)生更多高級(jí)酯類、β-葡萄糖苷酶等活性成分。KANPIENGJAI等[10]研究表明,非釀酒酵母在單寧質(zhì)量濃度≥30 g/L時(shí)生長(zhǎng)狀態(tài)優(yōu)于釀酒酵母,表現(xiàn)出更高的單寧耐受能力,與本研究結(jié)果一致。賀紅早等[31]利用貝氏酵母進(jìn)行刺梨果酒發(fā)酵,整體評(píng)價(jià)高于釀酒酵母、孢圓酵母。本研究也發(fā)現(xiàn),N1在總酯、干浸出物含量等方面均優(yōu)于釀酒酵母,風(fēng)味組成更加豐富。KELLY等[32]利用貝氏酵母和釀酒酵母發(fā)酵脫水葡萄發(fā)現(xiàn),2種酵母產(chǎn)醇水平相似,貝氏酵母可減少酒中的氧化物,提高色素濃度。本研究也發(fā)現(xiàn),貝氏酵母雖屬非釀酒酵母,也具有較好的產(chǎn)醇能力。

4 結(jié)論

本研究從高單寧水果中分離篩選獲得一株發(fā)酵良好、風(fēng)味突出的酵母菌株N1,經(jīng)鑒定為貝氏酵母。N1能夠耐受32 g/L單寧和降解40.01%的單寧,具有良好的高單寧水果利用能力;N1發(fā)酵刺梨酒酒精度9.23%vol,總酯質(zhì)量濃度為1.36 g/L,具有良好的產(chǎn)酒產(chǎn)香能力;對(duì)刺梨酒進(jìn)行電子鼻風(fēng)味測(cè)定,烷烴類、芳香苯類、芳香胺類物質(zhì)貢獻(xiàn)主要風(fēng)味。N1具有發(fā)酵高單寧水果的潛能,但仍需要進(jìn)行大量的基礎(chǔ)與應(yīng)用研究,進(jìn)一步驗(yàn)證N1菌株產(chǎn)酯能力和產(chǎn)香機(jī)制,或進(jìn)一步馴化、育種提高發(fā)酵能力。此外,N1與釀酒酵母混菌發(fā)酵具有可實(shí)踐性,是否適用于其他高單寧水果發(fā)酵還有待研究。對(duì)于耐單寧酵母的篩選,既豐富了酵母資源庫,也為后續(xù)的實(shí)際工業(yè)生產(chǎn)提供了可靠思路。