基于原位培養(yǎng)和傳統(tǒng)培養(yǎng)分析比較不同儲存期醬香大曲的細(xì)菌群落

鄒云曼,邱樹毅,鄭佳,戴怡鳳,韋朝陽,閆巖,曾祥勇*

1(貴州大學(xué) 釀酒與食品工程學(xué)院,貴州 貴陽,550025)2(貴州省發(fā)酵與生物制藥重點實驗室,貴州 貴陽,550025)3(中國輕工業(yè)濃香型白酒固態(tài)發(fā)酵重點實驗室,四川 宜賓,644000)

醬香白酒是中國三大香型白酒之一,具有獨(dú)特的釀造工藝。其中高溫大曲是醬香白酒最鮮明的特點之一。高溫大曲可為白酒生產(chǎn)提供豐富的前體物質(zhì)、微生物及酶類,對白酒品質(zhì)和風(fēng)味產(chǎn)生重大影響[1]。醬香大曲的生產(chǎn)工藝包括制作、發(fā)酵和儲存3個階段。即將曲料混合后制成曲塊,入倉發(fā)酵40～50 d,再經(jīng)過數(shù)月的儲存才能投入生產(chǎn)[2]。在儲存過程中,大曲微生物會進(jìn)一步優(yōu)化,形成穩(wěn)定的利于生產(chǎn)的微生物群落結(jié)構(gòu)[3]。其中,細(xì)菌在醬香大曲中的主要功能是“生香”,是形成醬香型白酒典型香氣特征的主要菌群[4]。因此,對醬香大曲可培養(yǎng)細(xì)菌進(jìn)行篩選鑒定及功能性研究具有重要意義。

近幾十年來,對可培養(yǎng)白酒發(fā)酵細(xì)菌的分離、篩選和分子生物學(xué)特性研究絕大多數(shù)基于傳統(tǒng)培養(yǎng)法[4-5]。但由于自然界大多都是未培養(yǎng)微生物(占99%),通過傳統(tǒng)培養(yǎng)方法無法分離得到的[6],從發(fā)酵過程中分離活性顯著、結(jié)構(gòu)新穎的微生物越來越困難。盡管越來越多的釀酒微生物通過克隆文庫技術(shù)[7]、變性梯度凝膠電泳(denatured gradient gel electrophoresis, DGGE)[8]、高通量測序[9]、多組學(xué)技術(shù)[10]等免培養(yǎng)技術(shù)被發(fā)現(xiàn)、評估和鑒定,但分子生物學(xué)技術(shù)提出的各種功能假說以及微生物的生物學(xué)特性只有在純培養(yǎng)物中才能得到真正的驗證[11]。因此,在發(fā)展分子生物學(xué)的基礎(chǔ)上,除了利用培養(yǎng)基優(yōu)化手段提高微生物的可培養(yǎng)性以外[12-13],一些新型培養(yǎng)技術(shù),包括原位培養(yǎng)、共培養(yǎng)、微流控培養(yǎng)技術(shù)和細(xì)胞分選技術(shù)等,逐漸被開發(fā)用于培養(yǎng)和捕獲微生物[14-15]。其中原位培養(yǎng)就是在人工培養(yǎng)條件下,將樣品置于模擬自然環(huán)境的條件下進(jìn)行分離。原位培養(yǎng)裝置中的微生物細(xì)胞無法向外擴(kuò)散,在原生態(tài)環(huán)境中獲得天然的營養(yǎng)物質(zhì)、信號分子或其他生長因子,將“未培養(yǎng)微生物”轉(zhuǎn)變?yōu)榭膳囵B(yǎng)的菌種而加以研究,從而實現(xiàn)對微生物生長的控制[16]。原位培養(yǎng)解決了傳統(tǒng)培養(yǎng)法因培養(yǎng)基富營養(yǎng)化[17]、生長因子缺乏[18]等原因而無法分離培養(yǎng)部分功能微生物的問題,在增加微生物的可培養(yǎng)率、理解微生物功能以及實現(xiàn)資源利用方面具有重要意義。

原位培養(yǎng)中分離芯片法(isolation chip,Ichip)[19]具備裝置簡單,可高通量操作,工作原理清晰明了等特點。Ichip原位培養(yǎng)法已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于土壤、海洋、口腔等環(huán)境中微生物的分離篩選[20],但迄今為止,還未見食品中特別是白酒發(fā)酵領(lǐng)域中利用原位培養(yǎng)法篩選釀酒微生物的相關(guān)報道。本課題組率先利用Ichip原位培養(yǎng)技術(shù)來篩選釀酒微生物,以不同儲存期的醬香大曲為篩選源,對比分析原位培養(yǎng)和傳統(tǒng)培養(yǎng)中大曲細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)組成的差異,同時探究儲存過程中群落結(jié)構(gòu)特點和動態(tài)變化規(guī)律。這項研究有助于難培養(yǎng)釀酒細(xì)菌的分離篩選,使它們能夠從釀造環(huán)境中被提取并在實驗室中得到有效地馴化和培養(yǎng),以期為醬香型白酒大曲中細(xì)菌的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 細(xì)菌原位培養(yǎng)裝置

本研究用于細(xì)菌分離的原位培養(yǎng)裝置由兩部分構(gòu)成,200 μL槍頭板和孔徑為0.03 μm的聚碳酸酯徑跡蝕刻濾膜(polycarbonate track etched,PCTE)[20]。此板本質(zhì)上是一個有96個通孔的塑料板,能高通量并行操作,且孔與孔之間互不干擾。任何帶有這種通孔的塑料板都可以替代它。

1.2 樣品采集

本試驗高溫大曲樣品取自貴州省茅臺鎮(zhèn)某酒廠。從塊狀大曲不同層次中取樣并研細(xì)成粉,等量混合后分裝于無菌取樣袋,于4 ℃保存?zhèn)溆谩?個月、4個月、5個月、6個月、8個月高溫大曲用于原位培養(yǎng)的編號為Y1、Y2、Y3、Y4、Y5;用于傳統(tǒng)培養(yǎng)的編號分別為CY1、CY2、CY3、CY4、CY5。

1.3 培養(yǎng)基

營養(yǎng)瓊脂(nutrient agar,NA)培養(yǎng)基(g/L):牛肉膏5,蛋白胨10,NaCl 5,瓊脂20,pH 7.0～7.2,121 ℃滅菌20 min。

LB肉湯培養(yǎng)基(g/L):牛肉膏5,蛋白胨 10,NaCl 5,pH 7.0～7.2,121 ℃滅菌20 min。

改良R2A瓊脂培養(yǎng)基[21]:瓊脂15～20 g、NH4Cl 0.8 g、KNO30.5 g、酪蛋白水解物0.5 g、葡萄糖0.5 g、蛋白胨0.5 g、丙酮酸鈉0.5 g、可溶性淀粉0.5 g、酵母浸出粉0.5 g、K2HPO40.4 g、KH2PO40.25 g、MgCl2·6H2O 20.0 mg、CaCl2·2H2O 15.0 mg、FeSO4·7H2O 7.0 mg、MnCl2·4H2O 5.0 mg、Na2SO45.0 mg、CoCl2·6H2O 0.5 mg、H3BO30.5 mg、NiSO4·6H2O 0.5 mg、ZnCl20.5 mg、CuCl2·2H2O 0.3 mg和Na2MoO4·2H2O 10.0 μg、用蒸餾水定容至1.0 L,pH 7.0±0.2,121 ℃滅菌15 min。

大曲浸出液(Daquextract,DE):曲樣1.00 g,加入99 mL無菌水,加玻璃珠搖床振蕩4～5 h后用0.2 μm膜過濾除菌。

R2A-DE培養(yǎng)基:90%體積的改良R2A培養(yǎng)基和10%體積的DE浸出液混勻,即為R2A-DE培養(yǎng)基。

1.4 樣品分離及培養(yǎng)

1.4.1 傳統(tǒng)培養(yǎng)法分離純化細(xì)菌

在無菌環(huán)境下,各儲存期大曲樣品分別稱取1.00 g,用無菌水進(jìn)行濃度梯度稀釋(10-2、10-3、10-4)。各濃度梯度菌懸液分別取100 μL涂布于R2A-DE培養(yǎng)基平板上,37 ℃倒置培養(yǎng)24 h,每個濃度梯度各做3個平行。挑取平板上不同形態(tài)的菌株,將獲得的單菌落進(jìn)行平板劃線處理,多次純化。觀察純化后的細(xì)菌菌落形態(tài),去掉重復(fù)的細(xì)菌。轉(zhuǎn)移至25%甘油管中,于-80 ℃保藏,用于后續(xù)鑒定。

1.4.2 原位培養(yǎng)法分離純化細(xì)菌

原位培養(yǎng)法分離純化細(xì)菌的操作流程見圖2。在超凈工作臺中將PCTE膜覆蓋在200 μL槍頭板底側(cè),并用有機(jī)硅膠密封,放置2 h以上使膠完全凝固。

圖2 原位培養(yǎng)法分離純化細(xì)菌流程圖

在無菌環(huán)境下,各儲存期大曲樣品分別稱取1.00 g,用無菌水進(jìn)行濃度梯度稀釋。為了保證每孔均有合適數(shù)量的細(xì)胞,本研究選取10-5和10-6梯度菌懸液各5 mL加入45 mL熔融的R2A-DE培養(yǎng)基中混勻后,用排槍吸取250 μL分別加入Ichip板96孔中,待瓊脂凝固后,將PCTE膜覆蓋在200 μL槍頭板頂部并用防水有機(jī)硅膠密封,于超凈工作臺放置2 h以上使膠完全凝固。將Ichip放回發(fā)酵糟醅中原位培養(yǎng),在窖池內(nèi)的放置位置見圖3。

圖3 Ichip板在窖池中原位培養(yǎng)時放置情況示意圖

原位培養(yǎng)1個月后取回實驗室馴化。在無菌條件下,擦拭Ichip板表面雜物后用鑷子輕輕剝下頂膜,取出富集物。用滅菌牙簽取出 Ichip 板中富集物,LB培養(yǎng)基搖床培養(yǎng)6 h。之后進(jìn)行梯度稀釋(10-2、10-3、10-4),各濃度梯度菌懸液分別取100 μL涂布于NA培養(yǎng)基平板上,37 ℃倒置培養(yǎng)24 h,每個濃度梯度各做3個平行。挑取平板上不同形態(tài)的菌株,將獲得的單菌落進(jìn)行平板劃線處理,多次純化。觀察純化后的細(xì)菌菌落形態(tài),去掉重復(fù)的細(xì)菌。轉(zhuǎn)移至25%甘油管中,于-80 ℃保藏,用于后續(xù)鑒定。

1.5 分子生物學(xué)鑒定

將純化菌種接入LB肉湯培養(yǎng)基中活化,37 ℃、200 r/min培養(yǎng)24 h。取1 mL菌液12 000 r/min離心1 min,棄清液,按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]提取DNA。擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA序列,擴(kuò)增引物為27f (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492r (5′-GGT-TACCTTGTTACGAC TT-3′)。PCR擴(kuò)增條件:94 ℃預(yù)變性10 min,94 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸90 s,共33個循環(huán);72 ℃再延伸10 min,4 ℃下保存。PCR擴(kuò)增體系(50.0 μL)為:2×TaqPCR MasterMix Ⅱ 25.0 μL,上下游引物(1.0 μmol/L)各1.0 μL,DNA 模板2.0 μL,雙蒸水(ddH2O)21.0 μL。

PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后,送至上海生物工程有限公司測序。將測序所得的特定細(xì)菌菌株序列結(jié)果,在NCBI上經(jīng)BLAST進(jìn)行同源性比較,對菌株進(jìn)行菌種鑒定。

1.6 數(shù)據(jù)處理

采用分離頻率(isolation frequency, IF)比較判斷優(yōu)勢菌群[22]。IF:分離到的某一指定類型微生物的菌株數(shù)占該樣品分離總微生物菌株數(shù)的百分比。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌的分離純化和菌落形態(tài)觀察

從5個儲存期的醬香型高溫大曲樣品中共分離純化出679株細(xì)菌,其中原位培養(yǎng)法471株,傳統(tǒng)培養(yǎng)法208株,部分細(xì)菌菌落形態(tài)如圖4所示。從菌落特征來看,相同培養(yǎng)條件下,不同細(xì)菌菌落形態(tài)、顏色、質(zhì)地、邊緣等特征略有不同。菌落形狀多為圓形;顏色多為白色,兼有米色和黃色;質(zhì)地有的濕潤、黏稠、有光澤,有的干燥、有褶皺,邊緣大多不規(guī)則。根據(jù)菌落形態(tài)特征進(jìn)行感官性初篩,原位培養(yǎng)和傳統(tǒng)培養(yǎng)分別選擇296株和96株進(jìn)行后續(xù)分子生物學(xué)鑒定。

2.2 菌株分子生物學(xué)鑒定

細(xì)菌16S rRNA序列擴(kuò)增,部分菌株瓊脂糖凝膠結(jié)果見圖5,都得到1 400 bp大小片段,與預(yù)期產(chǎn)物大小一致。根據(jù)所得的基因序列,在NCBI上通過BLAST程序進(jìn)行同源序列比較與分析。每種細(xì)菌的參考菌株編號及具體分離情況見表1和表2。結(jié)果表明這些菌株與各自的參考菌株的相似度都是100%,說明是同一種。

表1 高溫大曲細(xì)菌基于原位培養(yǎng)法的分離情況

表2 高溫大曲細(xì)菌基于傳統(tǒng)培養(yǎng)法的分離情況

圖5 部分細(xì)菌瓊脂糖凝膠電泳圖

2.3 傳統(tǒng)培養(yǎng)和原位培養(yǎng)法細(xì)菌多樣性分析

如圖6所示,原位培養(yǎng)在3、4、5、6個月儲存期大曲中獲得的細(xì)菌屬都比傳統(tǒng)培養(yǎng)多。在種水平上,原位培養(yǎng)在5個儲藏期大曲中獲得的細(xì)菌物種數(shù)分別為13、15、14、16、12;傳統(tǒng)培養(yǎng)獲得的細(xì)菌物種數(shù)分別為8、6、8、7、10。統(tǒng)計分析表明,原位培養(yǎng)和傳統(tǒng)培養(yǎng)在種水平上獲得的菌種數(shù)量存在極顯著差異(P<0.01;Fcalculated=22.09>Fcritical;df=1)。因此,本研究的原位培養(yǎng)裝置適用于細(xì)菌培養(yǎng),這種Ichip原位培養(yǎng)方法在醬香大曲細(xì)菌分離培養(yǎng)中是有效的。另外,隨著儲存時間的增加,傳統(tǒng)培養(yǎng)細(xì)菌屬和種數(shù)量呈現(xiàn)先降低后增加的整體趨勢;原位培養(yǎng)呈現(xiàn)先增加后降低的整體趨勢,這與2種培養(yǎng)法整合后的趨勢基本吻合,同時與本課題組對同批次醬香大曲的高通量測序結(jié)果相符。這可能是因為原位培養(yǎng)裝置被置于窖池糟醅中,糟醅中的信號分子和關(guān)鍵營養(yǎng)因子等被細(xì)菌利用,因此原位培養(yǎng)細(xì)菌變化趨勢更接近于實際醬香大曲的細(xì)菌多樣性,在實驗室研究中具有較高的參考價值。

a-屬水平;b-種水平

2種培養(yǎng)法從不同儲存期大曲中共分離獲得17個細(xì)菌屬,其中原位培養(yǎng)獲得15個屬;傳統(tǒng)培養(yǎng)獲得5個屬(圖7)。比較2種培養(yǎng)法的屬級細(xì)菌多樣性,原位培養(yǎng)獲得特有屬10個,傳統(tǒng)培養(yǎng)獲得特有屬1個。原位培養(yǎng)獲得的10個特有屬中,大多都只基于高通量測序等分子生物學(xué)技術(shù)檢測到豐度及功能預(yù)測,但未見從白酒發(fā)酵環(huán)境中分離出它們相關(guān)物種的報道。SUN等[23]通過高通量測序揭示了濃香型白酒糟醅中之前未發(fā)現(xiàn)的Alcaligenes。基于高通量測序技術(shù),Citrobacter和Paenibacillus被證明是醬香白酒主要優(yōu)勢菌屬[24-25]。Citrobacter分泌的水解酶可降解酒中氨基甲酸乙酯,保障食品安全性[26]。Paenibacillus對醬香型糟醅的香氣成分影響較為顯著[27]。Paenibacillussp.中克隆出的β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因能有效降解釀酒谷物中β-葡聚糖,降低啤酒糟黏度和濁度,促進(jìn)優(yōu)質(zhì)啤酒生產(chǎn)[28]。母應(yīng)春等[29]利用高通量測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)Acinetobacter和Ralstonia與貴州酒曲酸度變化呈正相關(guān)。因此,在基于免培養(yǎng)技術(shù)和認(rèn)識微生物的基礎(chǔ)上,利用原位培養(yǎng)分離得到發(fā)酵功能菌以研究其生理生化以及發(fā)酵特性,為提高白酒品質(zhì)做出重要貢獻(xiàn)。

a-屬水平;b-種水平

2種培養(yǎng)法從不同儲存期大曲中共分離獲得46個細(xì)菌種,其中原位培養(yǎng)獲得36個種;傳統(tǒng)培養(yǎng)獲得17個種(圖7)。比較2種培養(yǎng)法的種級細(xì)菌多樣性。原位培養(yǎng)獲得特有種28個,傳統(tǒng)培養(yǎng)獲得特有種9個。原位培養(yǎng)的28個特有細(xì)菌種中,Bacillusparamycoides、Bacillusvallismortis、Staphylococcusxylosus、Brevibacillusborstelensis等在白酒發(fā)酵環(huán)境中鮮有報道,這些微生物大多在醬香白酒中首次報道或者分離。其中,B.paramycoides分泌耐堿耐熱的木聚糖酶證明了其在酒精飲料和發(fā)酵工業(yè)的應(yīng)用潛力[30]。B.vallismortis已經(jīng)被報道對提高芝麻香型白酒中含硫風(fēng)味成分的重要性[31]。S.xylosus是常見的食品發(fā)酵物種[32],但在白酒領(lǐng)域深入研究較少。高亦豹等[33]利用DGGE檢測到了傳統(tǒng)方法未能分離鑒定的S.xylosus。B.borstelensis被報道能產(chǎn)生一種類似細(xì)菌素的抗菌物質(zhì),對Listeriamonocytogenes、Staphylococcusaureus等常見食品腐敗致病菌具有抑制作用[34]。原位培養(yǎng)法提高了對醬香型白酒中潛在功能菌種的認(rèn)識。

原位培養(yǎng)和傳統(tǒng)培養(yǎng)共有優(yōu)勢屬中,Bacillus是2種培養(yǎng)法的絕對優(yōu)勢屬。原位培養(yǎng)中Bacillus在5個儲存期總的IF為86.15%,共分離出Bacillus屬下的15個種;傳統(tǒng)培養(yǎng)中Bacillus在5個儲存期總的IF為58.95%,只分離出Bacillus屬下6個種(表1和表2)。除了5個共有種,原位培養(yǎng)獲得Bacillus獨(dú)有種10個。結(jié)果表明,原位培養(yǎng)分離出的Bacillus屬不僅優(yōu)勢度大且種類多,體現(xiàn)了原位培養(yǎng)相較于傳統(tǒng)培養(yǎng)的分離優(yōu)勢。Bacillus是醬香白酒的核心物種,具有產(chǎn)蛋白酶、淀粉酶、吡嗪和有機(jī)酸的功能,對白酒的生產(chǎn)和風(fēng)味有重要影響[35-37]。基于原位培養(yǎng)法,人們將進(jìn)一步加強(qiáng)對醬香型白酒絕對優(yōu)勢功能屬Bacillus的認(rèn)識,為改善白酒品質(zhì)和風(fēng)味提供參考。

本課題組研究發(fā)現(xiàn)同批次醬香大曲的高通量測序顯示絕對優(yōu)勢菌屬并不是Bacillus,而是Kroppenstedtia。然而,本試驗原位培養(yǎng)法中卻未分離出Kroppenstedtia,這可能是由于Kroppenstedtia是一種高溫放線菌,而原位培養(yǎng)膜PCTE的孔徑只有0.03 μm,高溫放線菌的菌絲不能探出膜孔吸收外界營養(yǎng)物質(zhì)。未來可將孔徑為0.22 μm的無菌生物濾膜應(yīng)用到絲狀真菌及高溫放線菌的原位培養(yǎng)中[38]。

為全面探究3～8個月儲藏期大曲可培養(yǎng)細(xì)菌的菌群結(jié)構(gòu)多樣性,分析了2種培養(yǎng)法整合后的大曲菌群數(shù)量變化(圖6),結(jié)果顯示6個月儲存期大曲中分離到的物種在種屬水平上均最豐富,但是整體上菌種數(shù)量波動較小。同時,5個儲藏期的大曲主要優(yōu)勢菌群相似且穩(wěn)定(表1和表2),可以投入生產(chǎn)使用。梁晨等[39]利用高通量測序發(fā)現(xiàn)貯存4～6個月大曲微生物群落結(jié)構(gòu)及風(fēng)味成分更有利于白酒的釀造。XI等[2]基于高通量測序發(fā)現(xiàn)春季醬香大曲的有效儲存期為6個月,夏季為2個月,秋季為6個月以上。本研究結(jié)果與上述研究基本吻合,因此,可選用3～8個月儲存期的陳曲釀酒。值得注意的是,有些菌屬在儲存后期的IF較高。原位培養(yǎng)和傳統(tǒng)培養(yǎng)法中Bacillus分別在8個月和6個月儲存期達(dá)到最大IF,分別為89.9%和78.9%(表1和表2)。Staphylococcus屬所有的種都在6～8個月儲存期才篩選到(表1和表2)。Bacillus是醬香白酒生產(chǎn)的核心物種[37]。WANG等[40]證明Staphylococcus是3種不同類型(白大曲、黑大曲和黃大曲)高溫大曲的主要細(xì)菌屬。這種高IF現(xiàn)象可能是因為儲存到后期的醬香大曲溫度和濕度比較適合這些菌的生長。醬香大曲在發(fā)酵結(jié)束后,需要在干燥環(huán)境下儲存并降低濕度,進(jìn)一步優(yōu)化大曲微生物菌系,從而積累大曲的酶系、香氣和風(fēng)味[3]。因此,從微生物的菌屬特性、平衡角度分析,6個月儲存期的陳曲更適合投入生產(chǎn)。

3 結(jié)論

本研究首次采用原位培養(yǎng)法和傳統(tǒng)培養(yǎng)法技術(shù)對比分析不同儲存期茅臺鎮(zhèn)醬香型高溫大曲的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)。與傳統(tǒng)培養(yǎng)法相比,原位培養(yǎng)能培養(yǎng)出更多種類的細(xì)菌,分離效率是傳統(tǒng)培養(yǎng)法的2倍。同時,原位培養(yǎng)基于高通量測序可篩選得到、難培養(yǎng)的功能微生物。盡管本研究只選取了不同陳化期的高溫大曲,樣品數(shù)較少,但研究結(jié)果較好地體現(xiàn)了原位培養(yǎng)技術(shù)在傳統(tǒng)釀造環(huán)境中分離培養(yǎng)功能微生物、挖掘豐富的微生物資源所具有的技術(shù)優(yōu)勢和良好應(yīng)用前景。本課題組接下來將繼續(xù)利用原位培養(yǎng)技術(shù)分離篩選糟醅和窖泥中的釀酒微生物,并進(jìn)一步研究功能微生物。