Bacillus stearothermophilus NO2環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶Leu277突變提高α-環(huán)糊精產(chǎn)量

孔德民,左方圓,吳敬,王蕾*

1(食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(江南大學(xué)),江蘇 無錫,214122)2(工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(江南大學(xué)),江蘇 無錫,214122)

環(huán)糊精(cyclodextrin, CD)是一種由環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(cyclodextrin glucosyltransferase, CGTase)以淀粉為底物合成的環(huán)狀低聚糖[1],一般由6～8個(gè)吡喃葡萄糖單元構(gòu)成,根據(jù)糖單元數(shù)量可分為α-環(huán)糊精(6)、β-環(huán)糊精(7)及γ-環(huán)糊精(8)。環(huán)糊精具有內(nèi)部疏水及外部親水的空腔結(jié)構(gòu),可以和客體分子形成包合物進(jìn)而增加其溶解性或穩(wěn)定性[2]。因此環(huán)糊精被廣泛應(yīng)用于制藥、化妝品、食品、紡織、污水處理等領(lǐng)域[3]。在3種環(huán)糊精中,α-環(huán)糊精水溶性高且具有抗消化酶水解特性,因此還可以作為可溶性膳食纖維促進(jìn)腸道蠕動(dòng)、調(diào)節(jié)腸道菌群。然而制備α-環(huán)糊精時(shí)合成和降解同時(shí)存在限制了產(chǎn)量的進(jìn)一步提升,甚至存在明顯的產(chǎn)量下降趨勢(shì)[4],這些問題導(dǎo)致α-環(huán)糊精價(jià)格昂貴。因此提高α-環(huán)糊精產(chǎn)量是一項(xiàng)極有意義的研究。

CGTase的分子改造是一種提高α-環(huán)糊精產(chǎn)量的方法[3]。CGTase屬于α-淀粉酶家族[5],含有5個(gè)結(jié)構(gòu)域[4]。催化中心由TIM(α/β)8結(jié)構(gòu)組成,存在9個(gè)糖分子結(jié)合位點(diǎn)(-7～+2亞位點(diǎn))用于結(jié)合供體分子及受體分子[4]。根據(jù)受體分子的不同,CGTase催化的反應(yīng)被分為環(huán)化反應(yīng)、歧化反應(yīng)、偶聯(lián)反應(yīng)及水解反應(yīng)[6]。環(huán)化反應(yīng)是CGTase生產(chǎn)環(huán)糊精的關(guān)鍵反應(yīng)。然而由于存在多個(gè)底物結(jié)合亞位點(diǎn),CGTase的環(huán)化產(chǎn)物是3種環(huán)糊精的混合物[4, 7]。部分來源的CGTase在合成α-環(huán)糊精上占據(jù)一定的優(yōu)勢(shì),如KlebsiellapneumoniaeM5a1 CGTase的環(huán)化產(chǎn)物中α-環(huán)糊精質(zhì)量分?jǐn)?shù)為73%,Thermococcussp.B1001 CGTase的環(huán)化產(chǎn)物中α-環(huán)糊精質(zhì)量分?jǐn)?shù)為51%[4],Paenibacillussp.602-1 CGTase的環(huán)化產(chǎn)物中α-環(huán)糊精質(zhì)量分?jǐn)?shù)為83%[8]。但是它們對(duì)底物的利用率均較低[4]。

此外,有研究報(bào)道指出了底物結(jié)合亞位點(diǎn)附近的氨基酸殘基位點(diǎn)對(duì)CGTase催化反應(yīng)的影響,如-7亞位點(diǎn)主要影響環(huán)化反應(yīng)特異性[4,7,9],-3亞位點(diǎn)影響環(huán)化活性[10],+1/+2亞位點(diǎn)主要影響受體分子的結(jié)合[6,11]等。近些年,一些研究者展示了定向進(jìn)化或定點(diǎn)突變改造CGTase,從而提高α-環(huán)糊精占比的相關(guān)報(bào)道[3]。如LI等[12]構(gòu)建PaenibacillusmaceransJFB05-01 CGTase突變體D372K/Y89R的產(chǎn)物中α-環(huán)糊精占比提高23.2%,WANG等[13]構(gòu)建PaenibacillusmaceransJFB05-01的突變體Y89D的產(chǎn)物中α-環(huán)糊精占比提高7.6%,CHAO等[14]構(gòu)建Bacillussp.602-1 CGTase的突變體Y167H/V536A產(chǎn)物中α-環(huán)糊精占比提高5.4%,WANG等[9]構(gòu)建PaenibacillusmaceransJFB05-01 CGTase突變體R146P/D147A的產(chǎn)物中α-環(huán)糊精占比提高12.9%。

本研究選擇了表達(dá)水平較高[15]、總轉(zhuǎn)化率較高且穩(wěn)定性較好[4]的B.stearothermophilusNO2 CGTase進(jìn)行研究。參照之前的研究成果[7,11],本研究在CGTase的-7亞位點(diǎn)構(gòu)建突變體E142P以提高CGTase的α-環(huán)糊精合成特異性,+1/+2亞位點(diǎn)構(gòu)建突變體L277M、L277F及N353A以提高轉(zhuǎn)糖苷反應(yīng)特異性。最終,通過檢測(cè)它們的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物,E142P/L277M是最優(yōu)的生產(chǎn)α-環(huán)糊精的突變體,其產(chǎn)量為10.15 g/L,較野生型提高1.7 g/L,并且α-環(huán)糊精占比較野生型提高14.3%。本研究為α-環(huán)糊精的工業(yè)化提供了新的思路,具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試劑、菌株及質(zhì)粒

酵母粉、蛋白胨、瓊脂粉、甲基橙、酚酞、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、鹽酸、咪唑、3,5-二硝基水楊酸(3,5-dinitrosalicylic acid,DNS)、α-環(huán)糊精、β-環(huán)糊精等,上海國(guó)藥生物科技有限公司;2×Phanta Max Master Mix,南京諾唯贊生物科技股份有限公司;DpnI,大連TaKaRa生物科技有限公司。

EscherichiacoliJM109作為重組DNA操作的宿主菌。E.coliBL21作為CGTase表達(dá)的宿主菌。pET20b(+)/cgtase質(zhì)粒參照TAO等[15]構(gòu)建。

1.2 CGTase突變體質(zhì)粒構(gòu)建

使用pET20b(+)/cgtase作為模板質(zhì)粒,使用表1中的引物1～4構(gòu)建突變體L277M及L277F的質(zhì)粒。

表1 定點(diǎn)突變引物

使用pET20b(+)/L277M及pET20b(-)/L277F作為模板質(zhì)粒,使用表1中的引物5～8構(gòu)建突變體E142P/L277M、E142P/L277F、L277M/N353A及L277F/N353A的質(zhì)粒。同時(shí),所有質(zhì)粒在目的基因的C端均含有His-tag標(biāo)簽,可用于蛋白純化。在PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增后,產(chǎn)物使用DpnI處理。最終轉(zhuǎn)化到E.coliJM109,提取質(zhì)粒并測(cè)序。測(cè)序正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到E.coliBL21(DE3)中用于后續(xù)目標(biāo)蛋白的表達(dá)。

1.3 CGTase野生型及突變體的表達(dá)

將構(gòu)建好的E.coliBL21(DE3)挑至LB(Luria-Bertani)液體培養(yǎng)基(含100 μg/mL的卡那抗生素)中,37 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)10 h作為種子液。按照體積分?jǐn)?shù)5%的轉(zhuǎn)接量將種子液轉(zhuǎn)接至TB(Terrific-Broth)培養(yǎng)基(含100 μg/mL的卡那抗生素)中,37 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)2 h后調(diào)至25 ℃繼續(xù)培養(yǎng)48 h后終止發(fā)酵培養(yǎng)。將獲得的發(fā)酵液于8 000 r/min離心20 min后取上清液獲得粗酶液。

1.4 CGTase的酶活力測(cè)定

1.4.1 CGTase環(huán)化反應(yīng)活性檢測(cè)

1.4.1.1 CGTase生成α-環(huán)糊精的酶活力檢測(cè)條件

反應(yīng)條件為50 ℃及25 mmol/L、pH 5.5的磷酸鹽緩沖液。酶反應(yīng)體系包括2 mL上述緩沖液配制的1%可溶性淀粉及0.1 mL的適量稀釋的酶液。精確反應(yīng)10 min后加入0.2 mL的3 mol/L HCl溶液終止反應(yīng),之后加入0.2 mL的0.44 mmol/L甲基橙溶液進(jìn)行顯色。生成的α-環(huán)糊精能夠包埋甲基橙,使溶液在505 nm的吸光值降低,依照此制作標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算α-環(huán)糊精的產(chǎn)量。α-環(huán)化反應(yīng)酶活力定義為在上述反應(yīng)條件下1 min內(nèi)催化可溶性淀粉生成1 μmol α-環(huán)糊精所需要的酶量為1 U。

1.4.1.2 CGTase生成β-環(huán)糊精的酶活力檢測(cè)條件

反應(yīng)條件為50 ℃及25 mmol/L、pH 5.5的磷酸鹽緩沖液。酶反應(yīng)體系包括2 mL上述緩沖液配制的1%可溶性淀粉及0.1 mL的適量稀釋的酶液。精確反應(yīng)10 min后加入0.2 mL的0.6 mol/L HCl溶液終止反應(yīng),之后加入0.5 mL的0.6 mol/L的Na2CO3溶液并加入0.2 mL的1.2 mmol/L酚酞溶液顯色。生成的β-環(huán)糊精能夠包埋酚酞,使溶液在550 nm的吸光值降低,依照此制作標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算β-環(huán)糊精的產(chǎn)量。β-環(huán)化反應(yīng)酶活力定義為在上述反應(yīng)條件下1 min內(nèi)催化可溶性淀粉生成1 μmol β-環(huán)糊精所需的酶量為1 U。

1.4.2 CGTase水解反應(yīng)活性檢測(cè)

水解反應(yīng)酶活力主要指CGTase降解可溶性淀粉生成小分子糖的能力。反應(yīng)條件為50 ℃及50 mmol/L、pH 5.5的磷酸鹽緩沖液。酶反應(yīng)體系包括1 mL上述緩沖液配制的1%可溶性淀粉、0.9 mL上述緩沖液及0.1 mL適量稀釋的酶液。精確反應(yīng)10 min后加入3 mL DNS溶液終止反應(yīng),使用去離子水定容至15 mL。CGTase水解可溶性淀粉生成的小分子糖均為還原糖,能夠與DNS反應(yīng)并顯色,依照此制作標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算小分子糖的產(chǎn)量,最終檢測(cè)540 nm的吸光值確定小分子糖的生成量。水解反應(yīng)酶活力定義:在上述反應(yīng)條件下1 min內(nèi)催化可溶性淀粉生成1 μmol麥芽糖當(dāng)量所需的酶量為1 U。

1.5 α-環(huán)糊精的制備

在50 ℃及50 mmol/L、pH 5.5的磷酸鹽緩沖液條件下進(jìn)行CGTase的催化反應(yīng)制備α-環(huán)糊精。使用上述緩沖液配制5%可溶性淀粉作為底物,按照1 g底物5 U環(huán)化反應(yīng)活性的加酶量添加CGTase,反應(yīng)24 h并固定時(shí)間點(diǎn)取樣。取樣后煮沸滅活用于檢測(cè)。

1.6 HPLC檢測(cè)環(huán)糊精方法

使用HPLC檢測(cè)環(huán)糊精產(chǎn)量,色譜柱使用Aps-2 Hypersil(4.6 mm×250 mm),柱溫40 ℃,流動(dòng)相為體積分?jǐn)?shù)75%的乙腈,流速0.8 mL/min,檢測(cè)器為2414型(示差折光檢測(cè)器)。分別使用2、10、2 g/L的α-環(huán)糊精、β-環(huán)糊精及γ-環(huán)糊精作為標(biāo)準(zhǔn)品。按照1∶1的體積比添加乙腈至樣品中沉淀1 h后于12 000 r/min、2 min離心去除大分子底物,用0.22 μm有機(jī)相微孔濾膜過濾后即可使用。

1.7 分子動(dòng)力學(xué)(molecular dynamics, MD)結(jié)構(gòu)模擬分析

以野生型B.stearothermophilusNO2 CGTase(PDB ID:1CYG)的三維結(jié)構(gòu)作為模板,利用SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/)[16]模擬突變體E142P/L277M及L277M/N353A的三維結(jié)構(gòu)。利用Amber18進(jìn)行MD模擬,分別采用ff14SB(蛋白殘基)以及TIP3P(水分子)力場(chǎng),在300 K的溫度下模擬10 ns。得到的軌跡利用AMBER18的capptraj分析其均方根偏差(root mean square deviation,RMSD)、均方根波動(dòng)(root mean square fluctuation,RMSF)、關(guān)鍵氨基酸殘基Cα距離、回旋半徑(radius of gyration,Rg)及溶劑可及表面積(solvent accessible surface area, SASA)。

2 結(jié)果與分析

2.1 突變體質(zhì)粒的構(gòu)建及異源表達(dá)

參照KONG等[11]對(duì)CGTase的Leu277位點(diǎn)轉(zhuǎn)苷水解反應(yīng)的研究結(jié)果,因其具有提高歧化反應(yīng)并降低水解反應(yīng)的作用,本文研究L277M及L277F突變體對(duì)α-環(huán)糊精產(chǎn)量的影響。同時(shí),參照ZUO等[7]對(duì)α-環(huán)糊精產(chǎn)量的研究,在L277M及L277F突變體的基礎(chǔ)上組合E142P及N353A突變體進(jìn)行研究。

使用E.coliJM109作為宿主,構(gòu)建突變體L277M、L277F、E142P/L277M、E142P/L277F、L277M/N353A及L277F/N353A的質(zhì)粒。使用E.coliBL21(DE3)作為表達(dá)宿主表達(dá)上述突變體。野生型及相關(guān)突變體CGTase的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)分析如圖1所示,均在60 kDa附近有可溶性條帶。環(huán)化反應(yīng)活力檢測(cè)如表2所示,所有突變體的環(huán)化反應(yīng)活力均比野生型低。此外,突變體E142P/L277M及E142P/L277F的α/β值分別提高至野生型的2.52及2.07倍,說明這2個(gè)突變體的環(huán)化反應(yīng)特異性向合成α-CD方向偏移。此外,由于Leu277及Gln353位點(diǎn)相關(guān)突變體對(duì)CGTase水解反應(yīng)的抑制,所有突變體的水解反應(yīng)活力均低于野生型,其中L277M/N353A及L277F/N353A組合突變體的水解活力不足野生型的50%。

M-markers;1-野生型CGTase;2-L277M突變體;3-L277F突變體;4-E142P/L277M突變體;5-E142P/L277F突變體;6-L277M/N353A突變體;7-L277F/N353A突變體

表2 野生型與L277相關(guān)突變體CGTase的環(huán)化及水解活性

2.2 L277M及L277F突變體制備α-環(huán)糊精的應(yīng)用

為了確定單突變體對(duì)環(huán)糊精產(chǎn)量的影響,使用5%可溶性淀粉作為底物進(jìn)行酶轉(zhuǎn)化反應(yīng)。L277M、L277F催化生成α-環(huán)糊精的最高產(chǎn)量分別為8.97和8.39 g/L(圖3),相較于野生型(8.45 g/L,圖2)均無明顯增加。同時(shí),2種突變體在α-環(huán)糊精占比方面也未體現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢(shì),均為35%左右,較野生型下降3%(表3)。參照KONG等[11]對(duì)Leu277相關(guān)突變體的分析,該位點(diǎn)影響受體亞位點(diǎn)附近的疏水性以及提高受體底物的親和力。根據(jù)之前的CGTase突變體的相關(guān)研究[4]:影響環(huán)糊精比例的氨基酸殘基位點(diǎn)位于供體位點(diǎn),特別是—7亞位點(diǎn)。因此,L277M及L277F突變體可能并不能明顯提高α-環(huán)糊精的產(chǎn)量及占比。但是,由于2個(gè)突變體均降低了水解反應(yīng)(表2),這導(dǎo)致反應(yīng)體系中小分子糖的減少,從而能夠降低α-環(huán)糊精的降解。雖然單突變體L277M及L277F能夠減弱α-環(huán)糊精的降解,但由于其并未從根本改變?chǔ)?環(huán)糊精的產(chǎn)量,因此并不能展現(xiàn)其優(yōu)勢(shì),進(jìn)而導(dǎo)致突變體的α-環(huán)糊精產(chǎn)量及占比與野生型相當(dāng)。

圖2 24 h內(nèi)野生型CGTase合成環(huán)糊精的產(chǎn)量變化

a-L277M合成環(huán)糊精的產(chǎn)量變化;b-L277F合成環(huán)糊精的產(chǎn)量變化

表3 野生型及突變體CGTase的環(huán)糊精產(chǎn)物比較

2.3 E142P/L277M及E142P/L277F制備α-環(huán)糊精的應(yīng)用

為了更好地利用L277M及L277F降低水解反應(yīng)的優(yōu)勢(shì),本研究引入了突變體E142P。該位點(diǎn)能夠有效地提高產(chǎn)物中α-環(huán)糊精的占比(比野生型高9.65%[7]),但在反應(yīng)后期存在嚴(yán)重的α-環(huán)糊精降解現(xiàn)象[4,7,9]。酶轉(zhuǎn)化結(jié)果顯示(圖4),E142P/L277M最高催化產(chǎn)生了10.15 g/L的α-環(huán)糊精,而E142P/L277F最高催化產(chǎn)生了9.63 g/L的α-環(huán)糊精。相較于野生型,兩者的產(chǎn)量均有提高。同時(shí),對(duì)比ZUO等[7]報(bào)道的E142P最高催化產(chǎn)生約9.4 g/L的α-環(huán)糊精,該研究中的雙突變體的α-環(huán)糊精產(chǎn)量出現(xiàn)了小幅的提升。同時(shí),相較于E142P突變體,E142P/L277M及E142P/L277F在催化反應(yīng)后期較為穩(wěn)定,α-環(huán)糊精未出現(xiàn)顯著的降解,這可能是由于Leu277突變體降低了水解的作用。

a-E142P/L277M合成環(huán)糊精的產(chǎn)量變化;b-E142P/L277F合成環(huán)糊精的產(chǎn)量變化

2.4 L277M/N353A及L277F/N353A制備α-環(huán)糊精的應(yīng)用

為了進(jìn)一步降低CGTase的水解反應(yīng),本研究引入了突變體N353A。該位點(diǎn)同樣能夠有效降低CGTase的水解反應(yīng),約為野生型的21.3%[7]。將其與L277M或L277F組合,嘗試以組合突變體制備α-環(huán)糊精。結(jié)果如圖5所示,L277M/N353A及L277F/N353A最高催化產(chǎn)生α-環(huán)糊精分別為7.12及8.21 g/L,較野生型更低。同時(shí)α-環(huán)糊精占比也比野生型更低(表3)。這可能是由于Asn353和Leu277在空間結(jié)構(gòu)上距離較近,同時(shí)突變2個(gè)氨基酸殘基位點(diǎn)時(shí),該處存在的疏水簇結(jié)構(gòu)[11]或電荷平衡[7]可能遭到破壞,導(dǎo)致CGTase的結(jié)構(gòu)較野生型更不穩(wěn)定。

a-L277M/N353A;b-L277F/N353A

2.5 MD結(jié)構(gòu)模擬分析

為解析突變體E142P/L277M的優(yōu)勢(shì)所在以及L277M/N353A轉(zhuǎn)化率降低的原因,本研究使用MD結(jié)構(gòu)模擬分析了野生型及2個(gè)突變體在10 ns內(nèi)的軌跡變化。RMSD結(jié)果如圖6-a所示,3個(gè)結(jié)構(gòu)在10 ns內(nèi)均達(dá)到平衡狀態(tài),其中L277M/N353A較其他2種結(jié)構(gòu)更晚達(dá)到平衡。RMSF結(jié)果如圖6-b所示,L277M/N353A的RMSF在300位氨基酸殘基附近波動(dòng)較大。此外,圖6-c顯示2個(gè)突變體中L277與N353之間的Cα距離高于野生型。上述結(jié)果表明L277M/N353A結(jié)構(gòu)波動(dòng)更大。針對(duì)L277及N353所在疏水簇[11]分析SASA,結(jié)果如圖6-d所示,L277M/N353A的SASA明顯增大,這可能是因?yàn)殡p突變體破壞了疏水簇結(jié)構(gòu)所致。此外,L277位點(diǎn)突變后自旋半徑增大(圖6-e),這與甲硫氨酸(M)側(cè)鏈長(zhǎng)度增大有關(guān);N353位點(diǎn)突變后自旋半徑降低,這與丙氨酸(A)側(cè)鏈長(zhǎng)度降低有關(guān)。MD結(jié)果說明E142P/L277M突變體由于突變位點(diǎn)相互影響并不大,因此對(duì)α-環(huán)糊精的轉(zhuǎn)化產(chǎn)生了正向效應(yīng)。與之相反,L277M/N353A突變體由于突變位點(diǎn)均位于疏水簇,對(duì)該區(qū)域影響較大,導(dǎo)致酶催化活力降低,因此對(duì)α-環(huán)糊精的轉(zhuǎn)化產(chǎn)生了負(fù)向效應(yīng)。

a-野生型及突變體RMSD的結(jié)果;b-野生型及突變體RMSF的結(jié)果;c-L277與N353A的Cα距離;d-突變體及野生型的SASA變化;e-L277位點(diǎn)的自旋半徑;f-N353位點(diǎn)的自旋半徑

3 結(jié)論

本研究從降低CGTase水解反應(yīng)及提高環(huán)化反應(yīng)活力對(duì)其進(jìn)行分子改造。L277M、L277F及N353A突變體雖然降低了CGTase的水解反應(yīng)活力,但其本身對(duì)α-環(huán)糊精的特異性生產(chǎn)無明顯影響。L277M/N353A及L277F/N353A則導(dǎo)致CGTase的α/β值明顯降低,因此α-環(huán)糊精轉(zhuǎn)化率明顯降低。最終的優(yōu)勢(shì)突變體為E142P/L277M,在24 h內(nèi)最高催化生成了10.15 g/L的α-環(huán)糊精,較野生型α-環(huán)糊精產(chǎn)量提高1.7 g/L。此外突變體E142P/L277M生成的α-環(huán)糊精占比較野生型提高14.3%。整體而言,該研究為α-環(huán)糊精的生產(chǎn)應(yīng)用提供了新的思路。