歐亞類(lèi)禽H1N1豬流感病毒抗原性變異關(guān)鍵氨基酸的鑒定與分析

張乃心，許程志，楊玉瑩，張亞萍，萬(wàn)云飛，喬傳玲，陳化蘭

歐亞類(lèi)禽H1N1豬流感病毒抗原性變異關(guān)鍵氨基酸的鑒定與分析

張乃心，許程志，楊玉瑩，張亞萍，萬(wàn)云飛，喬傳玲，陳化蘭

中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所/動(dòng)物疫病防控全國(guó)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150069

【背景】流感病毒的抗原性主要是由病毒的表面糖蛋白HA決定的，前期利用歐亞類(lèi)禽型H1N1豬流感病毒（EA H1N1 SIV）HA蛋白單克隆抗體（mAb）篩選抗原逃逸株發(fā)現(xiàn)，HA蛋白190、230和269位（H3編碼）氨基酸的改變能夠?qū)е虏《景l(fā)生抗原逃逸，并發(fā)現(xiàn)在新近分離的EA H1N1 SIV HA蛋白廣泛存在這3個(gè)氨基酸的變異?！灸康摹窟M(jìn)一步探索哪些氨基酸對(duì)病毒的抗原性具有關(guān)鍵作用，為流感的防控提供科學(xué)依據(jù)?！痉椒ā窟x取一株病毒A/swine/Liaoning/SY72/2018（H1N1） SY72為模式病毒，建立該病毒的反向遺傳系統(tǒng)（RGS），又以SY72為骨架，拯救含有HA基因190、230和269單點(diǎn)突變重組病毒；利用rSY72病毒制備滅活疫苗，分別免疫SPF雞和非免疫豬制備其相應(yīng)的血清，通過(guò)中和試驗(yàn)和血凝抑制（HI）試驗(yàn)分析病毒的抗原性，確定影響病毒抗原性的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)；繼而評(píng)估HA蛋白不同位點(diǎn)氨基酸的改變對(duì)病毒復(fù)制特性及受體結(jié)合特性等的影響。【結(jié)果】分析SY72病毒的HA氨基酸序列發(fā)現(xiàn)，該病毒HA蛋白分別含有190D、230M和269R。利用反向遺傳技術(shù)，分別拯救了病毒rSY72及單點(diǎn)突變病毒rSY72HA/D190N、rSY72HA/M230I和rSY72HA/R269M；中和試驗(yàn)結(jié)果表明，與rSY72相比較，3株突變病毒均能夠與兩株mAbs發(fā)生一定反應(yīng)；HI試驗(yàn)結(jié)果顯示，與rSY72相比較，突變病毒rSY72HA/D190N與rSY72免疫雞血清和豬血清的反應(yīng)減弱，HI抗體效價(jià)分別出現(xiàn)了4倍和8倍的差異，而病毒rSY72HA/M230I和rSY72HA/R269M與兩種血清的反應(yīng)差異不明顯，表明HA蛋白190位氨基酸改變對(duì)病毒的抗原性影響最為明顯；病毒蝕斑測(cè)定及復(fù)制動(dòng)力學(xué)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)D190N 的氨基酸替換導(dǎo)致病毒rSY72HA/D190N在MDCK細(xì)胞上形成的蝕斑減小，而R269M的氨基酸替換導(dǎo)致病毒rSY72HA/R269M在MDCK細(xì)胞上的復(fù)制能力下降；3個(gè)位點(diǎn)的氨基酸替換均未影響病毒的受體結(jié)合特性?！窘Y(jié)論】HA蛋白190位氨基酸對(duì)EA H1N1 SIV抗原性具有決定作用，269位氨基酸突變使得病毒在MDCK細(xì)胞上的復(fù)制能力降低。這提示在后續(xù)開(kāi)展的病原學(xué)監(jiān)測(cè)中要密切關(guān)注這些氨基酸的變異情況，提高對(duì)動(dòng)物流感的預(yù)警預(yù)報(bào)。

豬流感病毒；HA蛋白；抗原性

0 引言

【研究意義】豬作為A型流感病毒感染的重要宿主，一直以來(lái)在流感病毒的進(jìn)化及新型流感病毒的產(chǎn)生過(guò)程中扮演著重要角色[1-2]。近年來(lái)開(kāi)展的豬流感（swine influenza，SI）監(jiān)測(cè)結(jié)果表明歐亞類(lèi)禽型H1N1 （Eurasian avian-like H1N1，EA H1N1）豬流感病毒（swine influenza virus，SIV）在豬群中廣泛流行，而且出現(xiàn)了對(duì)人的零星感染[3-9]。尤其是2009 /H1N1流感病毒出現(xiàn)以后，它作為流感病毒內(nèi)部基因的供體，持續(xù)地與豬群中早先流行的H1N1、H3N2及H1N2 流感病毒發(fā)生新的重組[8,10]。同時(shí)，已有研究發(fā)現(xiàn)新型重組EA H1N1 SIV存在抗原漂移的現(xiàn)象。這些不斷出現(xiàn)的新毒株給疫苗研制及疫情防控帶來(lái)了新挑戰(zhàn)[11-13]。因此，開(kāi)展流感病毒抗原變異分析，探索其分子基礎(chǔ)，將為EA H1N1 SIV的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和有效防控提供重要的科學(xué)依據(jù)。【前人研究進(jìn)展】流感病毒依賴(lài)于其持續(xù)的抗原性變異不斷突破宿主界限和逃避宿主的免疫保護(hù)，抗原漂移和抗原轉(zhuǎn)變是流感病毒抗原性變異的兩種主要方式[14-16]。流感病毒的各個(gè)基因中發(fā)生持續(xù)性變異的是血凝素（hemagglutinin，HA）基因，其次為神經(jīng)氨酸酶（neuraminidase，NA）基因[17]。前期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)HA 158位氨基酸的改變能夠顯著影響EA H1N1 SIV的抗原性[18]。筆者所在實(shí)驗(yàn)室前期利用EA H1N1 SIV A/swine/Henan/11/2005（簡(jiǎn)稱(chēng)HeN11）HA蛋白單克隆抗體（monoclonal antibody，mAb）篩選了兩株抗原逃逸株，HeN11-2B6-P5逃逸株在190和230位同時(shí)發(fā)生氨基酸改變，HeN11-4C7-P8逃逸株在269位發(fā)生氨基酸改變。通過(guò)對(duì)SIV HA 基因系統(tǒng)的序列分析也發(fā)現(xiàn)新近分離的EA H1N1 SIV毒株大多數(shù)攜帶HA 190D、230M和269R[13,19]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】本研究擬借助反向遺傳系統(tǒng)（reverse genetics system，RGS）構(gòu)建單點(diǎn)突變病毒，并制備相關(guān)病毒的免疫血清，利用HI試驗(yàn)測(cè)定病毒的抗原性，進(jìn)一步分析決定病毒抗原性變異的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)，同時(shí)測(cè)定HA蛋白相關(guān)突變位點(diǎn)對(duì)病毒生物學(xué)特性的影響?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】明確近年來(lái)導(dǎo)致我國(guó)H1N1 SIV抗原漂移的重要氨基酸突變，確定影響病毒抗原性的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)。研究結(jié)果將有助于加深對(duì)流感病毒抗原性變異規(guī)律的了解，為流感病毒的監(jiān)測(cè)與防控提供重要依據(jù)和參考。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2021年5月至2022年7月在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所動(dòng)物疫病防控全國(guó)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成。

1.1 病毒、抗體、質(zhì)粒、細(xì)胞和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

一株H1N1亞型SIV A/swine/Liaoning/ SY72/2018（簡(jiǎn)稱(chēng)SY72）為中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所動(dòng)物疫病防控全國(guó)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離、鑒定并保存；兩株HeN11 HA蛋白的mAbs（2B6和4C7）為該試驗(yàn)室制備和保存[19]；雙向表達(dá)質(zhì)粒pHW2000由美國(guó)St. Jude兒童醫(yī)院Richard Webby教授惠贈(zèng)；MDCK細(xì)胞和293T細(xì)胞均由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所動(dòng)物疫病防控全國(guó)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存；9—11日齡無(wú)特定病原體（specific pathogen-free，SPF）雞胚及8周齡SPF雞均購(gòu)自哈爾濱獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，6周齡非免疫豬（經(jīng)HI試驗(yàn)檢測(cè)H1和H3亞型SIV抗體陰性）購(gòu)自哈爾濱市郊農(nóng)場(chǎng)。

1.2 試劑和試劑盒

TIANamp病毒RNA提取試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒購(gòu)自天根生物公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Invitrogen 公司；PrimeSTAR? Max DNA 聚合酶購(gòu)自大連寶生物公司；限制性?xún)?nèi)切酶BsmBⅠ購(gòu)自NEB公司；同源重組試劑盒Clon Express? II One Step Cloning Kit購(gòu)自南京諾唯贊生物公司；Gene color II非EB熒光染料購(gòu)自北京金博益生物公司；膠回收試劑盒購(gòu)自O(shè)MEGA公司；DNA測(cè)序試劑購(gòu)自Applied Biosystems公司；轉(zhuǎn)染試劑盒LipofectamineTMLTX and Plus Reagent購(gòu)自Invitrogen公司；培養(yǎng)基Opti-MEM、DMEM購(gòu)自 Gibco 公司；受體實(shí)驗(yàn)一抗為SY72病毒的雞血清，二抗兔抗雞IgG-HRP 購(gòu)自Sigma-Aldrich公司；受體破壞酶（receptor destroying enzyme，RDE）購(gòu)自日本生物科技株式會(huì)社。

1.3 病毒拯救

1.3.1 引物設(shè)計(jì) 依據(jù)毒株 SY72序列及文獻(xiàn)[20]分別設(shè)計(jì)PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M 和 NS 8個(gè)基因片段的上、下游擴(kuò)增引物（引物序列略）。反轉(zhuǎn)錄引物為 Uni-12 ：5'-AGCRAAAGCAGG-3'，均由吉林庫(kù)美生物科技有限公司合成。

1.3.2 病毒SY72反向遺傳系統(tǒng)的建立 重組質(zhì)粒的構(gòu)建按照文獻(xiàn)[21-22]的方法進(jìn)行，獲得重組質(zhì)粒后通過(guò)測(cè)序進(jìn)行鑒定。依據(jù)LipofectamineTMLTX and Plus Reagent說(shuō)明書(shū)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，將8個(gè)重組質(zhì)粒各取250 ng共轉(zhuǎn)染于混合培養(yǎng)的293T細(xì)胞和MDCK細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48 h后，收取細(xì)胞培養(yǎng)物經(jīng)尿囊腔接種于SPF雞胚增殖病毒。對(duì)救獲病毒進(jìn)行全基因組序列測(cè)定，與野生型病毒基因序列分別進(jìn)行比對(duì)，確定拯救病毒與親本病毒的核苷酸序列完全一致。

1.3.3 SY72單點(diǎn)突變病毒的拯救 針對(duì)190、230和269等3個(gè)差異位點(diǎn)設(shè)計(jì)相應(yīng)的點(diǎn)突變引物（表1），以質(zhì)粒pHW-SY72 HA為模版，通過(guò)PCR分別構(gòu)建含有HA基因190、230和269等3個(gè)單點(diǎn)突變的質(zhì)粒。將制備的HA突變質(zhì)粒與病毒其他7個(gè)基因的重組質(zhì)粒各取250 ng共轉(zhuǎn)染于混合培養(yǎng)的293T和MDCK細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48 h后，收取細(xì)胞培養(yǎng)物經(jīng)尿囊腔接種于SPF雞胚增殖病毒。對(duì)救獲病毒進(jìn)行全基因組序列測(cè)定，與野生型病毒基因序列分別進(jìn)行比對(duì)，確保所拯救病毒僅HA基因含有目標(biāo)位點(diǎn)的突變，其他基因片段無(wú)突變。將病毒分裝、保存于-80℃，用于后續(xù)試驗(yàn)。

表1 差異位點(diǎn)的點(diǎn)突變引物

1.4 免疫血清的制備

分別將拯救的重組病毒接種10日齡SPF 雞胚，收獲尿囊液，β-丙內(nèi)酯滅活，佐劑乳化后制備滅活疫苗，接種8周齡SPF雞，0.3 mL/只，免疫后3周，采血分離血清，用于HI試驗(yàn)，與此同時(shí)，將制備的滅活疫苗接種于非免疫豬，2 mL/頭，免疫后2周采血分離血清，血清經(jīng)RDE處理后用于HI檢測(cè)。

1.5 病毒的復(fù)制特性測(cè)定

將1.3.3中所述各病毒分別以感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection，MOI）為0.001的病毒量接種于85%鋪滿的MDCK細(xì)胞板，37℃孵育1 h后，更換為含有1 μg·mL-1的TPCK-胰酶的DMEM培養(yǎng)基，并于感染后12、24、36和48 h收集上清，將所獲上清于-80℃保存?zhèn)溆?。待所有樣品收集完成后，在MDCK細(xì)胞中用終點(diǎn)滴定法測(cè)定病毒滴度，以平均log10TCID50/mL±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

1.6 蝕斑測(cè)定

分別將拯救的重組病毒進(jìn)行10倍倍比稀釋后接種于85%鋪滿的MDCK細(xì)胞板，37 ℃孵育1 h后，棄去病毒液，將2×MEM（0.6% BSA, 1 μg·mL-1TPCK-胰酶）與2%低熔點(diǎn)瓊脂糖等體積混合后加入細(xì)胞孔中，室溫放置20 min待瓊脂糖完全凝固后，倒置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，用福爾馬林固定細(xì)胞，0.1%結(jié)晶紫染色觀察并計(jì)數(shù)斑塊。

1.7 病毒受體結(jié)合特性的測(cè)定

1.7.1 病毒蛋白純化 將1.4中所述增殖滅活后的尿囊液進(jìn)行蔗糖密度梯度離心。首先8 000 r/min、4 ℃高速離心30 min后取上清。其次將上清30 000 r/min、4 ℃超速離心2 h后棄上清取沉淀并用磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffered saline，PBS）溶解。在超速離心管中分別加入20%、40%、60%蔗糖，將上述病毒液緩慢置于頂層。 28 000 r/min、4 ℃超速離心2 h后取40%—60%濃度梯度之間的白色絮狀物。最后加入適量PBS進(jìn)行脫糖，30 000 r/min 、4 ℃超速離心2 h后棄上清取沉淀，將病毒用適量PBS重新懸浮后測(cè)定病毒濃度及效價(jià)。

1.7.2 病毒受體結(jié)合特性檢測(cè) 將SA α-2，3 Gal和SA α-2，6 Gal兩種糖鏈?zhǔn)褂肞BS稀釋至100 ng，倍比稀釋至第10孔包被于96孔板中，置于紫外下交聯(lián)10 min；棄上清，用300 μL冰上預(yù)冷的PBS洗滌4遍。用含0.5% BSA的0.05% PBST（PBS中含0.05% Tween 20）稀釋純化的病毒至HA效價(jià)為6 HAU，每孔加入100 μL，4℃包被過(guò)夜，棄上清，用冰上預(yù)冷的0.5% PBST清洗3遍，再用冰上預(yù)冷的PBS清洗1遍。加入4%多聚甲醛滅活NA，之后用PBST 清洗3遍，PBS清洗1遍。按照1﹕600的比例稀釋抗rSY72的雞血清作為一抗，每孔100 μL，37℃孵育1 h；棄上清，PBST清洗3遍，PBS清洗1遍。每孔加入100 μL 1﹕1 000 稀釋兔抗雞 IgG-HRP作為二抗，37℃孵育1 h；PBST清洗3遍，PBS清洗1遍。OPD顯色后用0.5 mol·L-1H2SO4終止顯色，490 nm讀取數(shù)值。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

應(yīng)用GraphPad Prism 8.0軟件對(duì)病毒在細(xì)胞上的復(fù)制滴度及受體結(jié)合特性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析（Two-way ANOVA法）并作圖。＜0.05表示統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著，＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 病毒SY72 HA蛋白氨基酸序列的分析

將病毒SY72 與HeN11 HA基因的序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩株病毒HA蛋白氨基酸序列共存在16個(gè)氨基酸的差異（H3編碼），SY72病毒HA蛋白分別攜帶190D、230M、269R（表2）。

表2 SY72和HeN11病毒 HA 蛋白氨基酸差異位點(diǎn)

2.2 重組病毒的拯救

以SY72病毒為骨架，分別獲得了SY72重組病毒和含有其HA基因190、230和269位單點(diǎn)突變的3株重組病毒，分別命名為rSY72、rSY72HA/D190N、rSY72HA/M230I和rSY72HA/R269M。通過(guò)復(fù)制動(dòng)力學(xué)和蝕斑試驗(yàn)驗(yàn)證了重組病毒rSY72和野生型病毒SY72的部分生物學(xué)特性是否一致。結(jié)果顯示兩株病毒在MDCK細(xì)胞中保持相同復(fù)制特性，形成蝕斑的大小和形態(tài)類(lèi)似，兩者部分生物學(xué)特性一致（圖1）。

2.3 病毒與mAbs和多克隆血清的反應(yīng)性

中和試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩株mAbs對(duì)rSY72病毒均不具有中和活性。為進(jìn)一步確定導(dǎo)致病毒抗原性發(fā)生變化的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)，測(cè)定了3株單點(diǎn)突變病毒與mAbs的反應(yīng)性。結(jié)果rSY72HA/D190N病毒與2B6的反應(yīng)性明顯提高，中和效價(jià)為320；rSY72HA/ R269M病毒與4C7的反應(yīng)性也有所提升，中和效價(jià)為160；rSY72HA/M230I病毒也獲得了一定的反應(yīng)性。

以rSY72病毒和3株單點(diǎn)突變重組病毒為抗原，利用rSY72病毒制備的雞血清和RDE處理后的豬血清進(jìn)行HI試驗(yàn)。結(jié)果顯示親本病毒rSY72與血清的HI效價(jià)均較高，分別為512、2 560；rSY72HA/D190N病毒與血清進(jìn)行反應(yīng)，HI效價(jià)分別為128、320，而rSY72HA/M230I病毒和rSY72HA/ R269M病毒與血清進(jìn)行反應(yīng)，雞血清的HI效價(jià)分別為256和512，豬血清HI效價(jià)均為2 560（表3）。

表3 利用兩株mAbs和rSY72的多克隆血清檢測(cè)氨基酸突變對(duì)病毒抗原變異的影響

*NT, 未檢測(cè) Not tested

2.4 突變氨基酸對(duì)病毒復(fù)制特性的影響

測(cè)定rSY72病毒和3株單點(diǎn)突變重組病毒（rSY72HA/D190N、rSY72HA/M230I和rSY72HA/ R269M）在MDCK細(xì)胞中的復(fù)制能力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與rSY72病毒相比，rSY72HA/R269M病毒在感染MDCK細(xì)胞后的36和48 h復(fù)制滴度均有所下降（＜0.01、＜0.05），190和230位點(diǎn)的氨基酸改變并未對(duì)病毒在各檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)的復(fù)制滴度產(chǎn)生明顯影響（圖2）。

2.5 蝕斑測(cè)定

對(duì)rSY72病毒和3株單點(diǎn)突變重組病毒（rSY72HA/ D190N、rSY72HA/M230I和rSY72HA/R269M）進(jìn)行蝕斑試驗(yàn)，測(cè)定病毒在MDCK細(xì)胞中形成蝕斑的能力。結(jié)果與rSY72病毒相比，rSY72HA/D190N病毒形成的蝕斑明顯減小且蝕斑空洞不明顯，rSY72HA/ M230I和rSY72HA/R269M病毒形成的蝕斑經(jīng)觀察未見(jiàn)明顯變化（圖3）。

*: P＜0.05; **: P＜0.01

2.6 受體結(jié)合特性的分析

通過(guò)測(cè)定rSY72病毒和3株單點(diǎn)突變重組病毒（rSY72HA/D190N、rSY72HA/M230I和rSY72HA/ R269M）的受體結(jié)合特性，確定氨基酸改變是否對(duì)結(jié)合特性產(chǎn)生影響。結(jié)果3株單點(diǎn)突變重組病毒與rSY72保持相同的受體結(jié)合特性，同時(shí)具有對(duì)禽型受體SA α-2,3 Gal和人型受體SA α-2,6 Gal的結(jié)合（圖4）。

3 討論

3.1 HA蛋白190位氨基酸是決定病毒抗原性的關(guān)鍵位點(diǎn)

在本研究團(tuán)隊(duì)前期的研究中，我們利用mAb篩選抗原逃逸株的方法獲得了兩株逃逸株HeN11-2B6-P5和HeN11-4C7-P8，其HA蛋白190、230和269位氨基酸發(fā)生了改變。為了進(jìn)一步確定導(dǎo)致抗原性變異的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)及抗原逃逸發(fā)生的機(jī)制，本研究選取病毒SY72作為模式毒株通過(guò)反向遺傳技術(shù)拯救了rSY72重組病毒和3株單點(diǎn)突變重組病毒，在保證rSY72與親本病毒SY72 具有相同生物學(xué)特性的前提下進(jìn)行了后續(xù)試驗(yàn)。

A：rSY72；B：rSY72HA/D190N；C：rSY72HA/M230I；D：rSY72HA/R269M

利用中和試驗(yàn)和HI試驗(yàn)分析病毒的抗原性變化，中和試驗(yàn)結(jié)果表明rSY72病毒與兩株mAbs均不具有中和活性，但rSY72HA/D190N病毒與2B6的中和反應(yīng)性較rSY72增強(qiáng)；HI試驗(yàn)結(jié)果表明，rSY72HA/D190N病毒與rSY72病毒制備的雞血清和豬血清的反應(yīng)性減弱，HI抗體效價(jià)分別出現(xiàn)4倍和8倍的差異。因此rSY72HA/D190N病毒與rSY72病毒具有較大抗原差異，表明190位氨基酸突變對(duì)抗原性變異影響較大。

3.2 HA蛋白上突變位點(diǎn)對(duì)病毒生物學(xué)特性的影響不同

流感病毒的抗原漂移常產(chǎn)生伴隨效應(yīng)，導(dǎo)致部分生物學(xué)特性發(fā)生改變[23]。為驗(yàn)證3個(gè)氨基酸改變是否影響抗原表位的部分生物學(xué)特性，測(cè)定重組病毒在MDCK細(xì)胞上的復(fù)制能力、蝕斑形態(tài)大小和受體結(jié)合特性。結(jié)果表明rSY72HA/D190N病毒形成的蝕斑明顯減小，因此該位點(diǎn)的改變會(huì)使病毒對(duì)細(xì)胞的毒力產(chǎn)生變化。rSY72HA/R269M病毒在感染該細(xì)胞后的36和48 h的復(fù)制能力降低，表明其體外復(fù)制能力在MDCK細(xì)胞的不同感染階段可能減弱。據(jù)報(bào)道，受體結(jié)合位點(diǎn)區(qū)域的各種氨基酸突變會(huì)影響HA對(duì)唾液酸受體的親和力，受體親和力的改變也可能是HA發(fā)生抗原性變異的重要原因[24-26]。其中190位點(diǎn)在1918/H1N1、禽H1N1和2009/H1N1病毒的受體結(jié)合特性中發(fā)揮重要作用[27-30]。在本研究中，我們通過(guò)對(duì)rSY72及其3株單點(diǎn)突變病毒的受體結(jié)合特性測(cè)定，發(fā)現(xiàn)HA蛋白190、230和269位點(diǎn)氨基酸的改變均沒(méi)有對(duì)病毒的受體結(jié)合特性產(chǎn)生影響。

圖4 病毒的受體結(jié)合特性

3.3 抗原性差異分析具有重要公共衛(wèi)生學(xué)意義

由于EA H1N1 SIV可在豬群體內(nèi)廣泛存在和持續(xù)零星的感染人類(lèi)，又因流感病毒通過(guò)改變其HA頭部結(jié)構(gòu)域的氨基酸殘基，不斷逃逸抗體的中和作用，從而誘導(dǎo)抗原漂移[31-34]。因此對(duì)HA蛋白的氨基酸突變進(jìn)行密切監(jiān)測(cè)是必要的，從而預(yù)測(cè)具有流行潛力的抗原變異位點(diǎn)，保障公共安全。

4 結(jié)論

進(jìn)一步確定了EA H1N1 SIV HA蛋白所發(fā)生的3個(gè)氨基酸的變異中190位氨基酸的改變對(duì)抗原性影響最大，并影響病毒形成蝕斑的能力。269位氨基酸的改變使得病毒在MDCK細(xì)胞上的復(fù)制滴度有所下降。3個(gè)變異位點(diǎn)均未改變病毒的受體結(jié)合特性。這也提示在密切關(guān)注這些氨基酸位點(diǎn)的變異情況可以更好地防控監(jiān)測(cè)動(dòng)物流感甚至人流感的大流行。

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Identification of Key Amino Acids in the Antigenic Variation of Eurasian Avian-Like H1N1 Swine Influenza Viruses

ZHANG NaiXin, XU ChengZhi, YANG YuYing, ZHANG YaPing, WAN Yunfei, QIAO ChuanLing, CHEN HuaLan

Harbin Veterinary Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences/State Key Laboratory of Animal Disease Control and Prevention, Harbin 150069

【Background】The antigenicity of influenza virus is mainly determined by the hemagglutinin (HA), a surface glycoprotein of the virus. Our previous study indicated that amino acid changes at positions 190, 230 and 269 (H3 numbering) of HA protein resulted in antigenic escape by using the monoclonal antibody (mAb) against the HA protein of Eurasian avian-like H1N1 swine influenza virus (EA H1N1 SIV). These three amino acid substitutions widely existed in the HA protein of the recentlyisolated EA H1N1 SIVs. 【Objective】This study aimed to explore which amino acids played a key role in the antigenicity of the virus, and further provide scientific basis for the control of influenza. 【Method】In this study, A/swine /Liaoning /SY72/2018 (H1N1) (SY72) was selected as the model virus, and its reverse genetic system (RGS) was established. Then, using SY72 virus as backbone, three reassortant viruses were rescued by introducing the respective single amino acid mutation at position 190, 230, and 269 into HA protein. Antisera were raised by inoculating the rSY72-inactivated vaccine into specific-pathogen-free (SPF) chickens and non-immunized pigs. The effects of each of these substitutions on viral antigenicity were determined by measuring the neutralization and hemagglutination inhibition (HI) titers with mAbs and polyclonal sera raised against the rSY72 virus. Then their effects on viral replication capacities and receptor binding properties were further evaluated. 【Result】Sequence analysis showed that the HA of SY72 virus carried 190D, 230M, and 269R, respectively. The viruses, including rSY72, rSY72HA/D190N, rSY72HA/M230I, and rSY72HA/R269M, were rescued by RGS. The results of neutralization test showed that all the three mutant viruses could react with two mAbs, to some extent, compared with the rSY72 virus. The HI results indicated that the HI antibody titers of the rSY72HA/D190N reacted with the rSY72–immunized chicken and pig sera were 4- and 8-fold lower than those of the rSY72 virus with the respective sera. However, the rSY72HA/M230I and rSY72HA/R269M virus reacted well with these two sera. The results indicated that residue 190 in the HA had the important effects on the viral antigenicity. Results of the viral plaque assay and growth curve experiments demonstrated that plaque sizes generated by the rSY72HA/D190N virus were smaller than those by the rSY72 virus in MDCK cells. The replication ability of the rSY72HA/R269M virus was significantly decreased in MDCK cells, compared with that of the rSY72 virus. Furthermore, the three amino acid mutations had no impact on the viral receptor-binding preference. 【Conclusion】 The amino acid at position 190 of HA protein played an important role in determining the antigenicity of EA H1N1 SIV. The mutation of amino acid at position 269 reduced the viral replication ability in MDCK cells. These results suggested that more attentions should be paid for monitoring these residue changes in the influenza surveillance, so as to improve early warning of influenza in animals.

swine influenza virus; HA protein; antigenicity

10.3864/j.issn.0578-1752.2023.14.016

2022-12-06；

2023-02-13

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31872472）

張乃心，Tel：0451-51051684；E-mail：1246665754@qq.com。通信作者喬傳玲，Tel：0451-51051686；E-mail：qiaochuanling@caas.cn

（責(zé)任編輯 林鑒非）