菠蘿SLF/SFB基因家族全基因組鑒定與表達(dá)分析

井敏敏 李小針 李棟梁 戴小紅 顧帥磊 馬朝明 陳志輝 陳晶晶

摘 要：自交不親和性是高等植物通過(guò)抑制自花授粉來(lái)阻止近親繁殖的一種繁殖機(jī)制。在以茄科、薔薇科、車前草科為代表的配子體自交不親和機(jī)制中，花粉和雌蕊之間的自我/非自我識(shí)別由多態(tài)性S 位點(diǎn)決定，其中SLF（S-locus F-box）/SFB（S-haplotype-specific F-box）基因是配子體自交不親和花粉S 決定因子。本研究通過(guò)生物信息學(xué)方法從菠蘿基因組中篩選鑒定出21 個(gè)SLF/SFB 家族基因（AcSLF1～AcSLF21），各AcSLF 基因在N 端具有F-box 保守結(jié)構(gòu)域，其氨基酸長(zhǎng)度、理論等電點(diǎn)、分子量存在較大差異，編碼氨基酸序列大小范圍為242～612 aa，分子量為27.778～69.070 kDa，其中18 個(gè)AcSLFs 蛋白偏堿性，總體蛋白穩(wěn)定性較差，預(yù)測(cè)18 個(gè)AcSLFs 蛋白亞細(xì)胞定位于細(xì)胞核中，蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)60%以上由α-螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲組成。通過(guò)染色體定位分析發(fā)現(xiàn)其不均勻地分布在14 條染色體上，其中AcSLF21 未定位到具體染色體位置，并發(fā)現(xiàn)AcSLF4、AcSLF5、AcSLF6、AcSLF8、AcSLF14 和AcSLF15 與菠蘿RNase T2 家族基因發(fā)生連鎖。從進(jìn)化關(guān)系中發(fā)現(xiàn)，菠蘿SLF/SFB 家族與薔薇科、車前科、茄科植物SLF/SFB 進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn)。利用qRT-PCR對(duì)AcSLFs 基因在菠蘿雌蕊、雄蕊、葉片、果肉、莖和根的表達(dá)量進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)AcSLFs 基因在菠蘿不同組織中具有明顯的表達(dá)差異性，其中AcSLF1、AcSLF2、AcSLF4、AcSLF9、AcSLF10、AcSLF11、AcSLF15、AcSLF19、AcSLF20、AcSLF21 基因在菠蘿雄蕊中呈高表達(dá)量，AcSLF3、AcSLF7 在果肉中表達(dá)量最高，AcSLF5、AcSLF12、AcSLF18 在根中表達(dá)量顯著高于其他組織，總體來(lái)說(shuō)，大部分菠蘿AcSLFs 基因主要在菠蘿雄蕊或葉片中高表達(dá)。同時(shí)分析了雌蕊自花、異花授粉前后的表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)AcSLF1、AcSLF2、AcSLF15 三個(gè)基因在授粉雌蕊中的表達(dá)量較未授粉顯著上調(diào)，尤其在授粉6 h 表達(dá)量急劇上調(diào)，隨著花粉管的伸長(zhǎng)其表達(dá)量降低，但在授粉24 h 仍具有較高的表達(dá)量，推測(cè)這些基因可能在菠蘿自交不親和中起到重要作用。該研究為菠蘿SLF/SFB 家族基因的克隆提供參考，并為菠蘿自交不親和機(jī)制研究奠定良好基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：菠蘿；SLF/SFB 基因家族；生物信息學(xué)；表達(dá)量分析

中圖分類號(hào)：S668.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

植物自交不親和性（self-incompatibility， SI）是指綠色開(kāi)花植物能產(chǎn)生正常的配子，但自花不能正常授粉或授粉后不能正常結(jié)籽的一種生殖隔離現(xiàn)象[1]。菠蘿屬于典型的自交不親和植物，除了部分野生種外，多數(shù)菠蘿品種自交不親和，無(wú)法產(chǎn)生種子，而菠蘿類群Ananas comosus var.Comosus（主要是栽培菠蘿）自交不親和表現(xiàn)尤為突出。目前普遍認(rèn)為菠蘿屬于配子體自交不親和類型[2-3]，配子體自交不親和是植物界分布最廣泛的自交不親和調(diào)控機(jī)制，目前在薔薇科、玄參科、茄科、罌粟科等配子體自交不親和類型植物的研究中表明，花柱自交不親和的決定因子被確定為S-RNase 基因，花粉決定因子為編碼F-box蛋白的SLF（S-locus F-box）/SFB（S-haplotype-specificF-box）基因[4-5]?；ㄖ置诘腟-RNase 可進(jìn)入花粉管，通過(guò)自身的核糖核酸酶活性降解自花花核糖核酸酶活性降解自花花粉管中的rRNA，造成花粉管細(xì)胞骨架解體[6-7]，從而抑制花粉管生長(zhǎng)，造成自交不親和，與S-RNase 互作的SLF/SFB 可通過(guò)形成SCF 復(fù)合體泛素化非自我S-RNase，泛素化的S-RNase 最終被26S 蛋白酶體降解[8]，從而消除了S-RNase 的細(xì)胞毒性作用，花粉管可在花柱中繼續(xù)生長(zhǎng)。

迄今為止，已經(jīng)從茄科、薔薇科和玄參科等多種配子體型自交不親和植物中分離出近百個(gè)花柱關(guān)鍵基因S-RNase[9]，且其作用機(jī)制已研究較深入，但花粉關(guān)鍵控制基因研究稍滯后。LAI 等[10]通過(guò)對(duì)金魚(yú)草S 基因座進(jìn)行長(zhǎng)片段測(cè)序，首次發(fā)現(xiàn)了1 個(gè)與S2-RNase 緊密連鎖的編碼F-box 蛋白的基因AhSLF-S2，該基因在花粉中特異性表達(dá)。

薔薇科植物梅、扁桃中也鑒定出多個(gè)在花粉中特異性表達(dá)，同時(shí)具有較高序列多態(tài)性的編碼F-box蛋白的基因[11-12]。在金魚(yú)草及矮牽牛中利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)證實(shí)了S 基因座中的F-box 基因決定了花粉自交不親和特異性反應(yīng)，并命名為S-locus F-box（SLF）[13]。在薔薇科植物中，花粉S 決定因子缺乏統(tǒng)一的命名，蘋果亞科花粉S 候選基因被命名為S-locus F-box Brothers（SFBB）[14]，李屬植物被命名為S-haplotype-specific F-box（SFB）[15]。

目前，關(guān)于菠蘿自交不親和的研究主要集中在組織細(xì)胞學(xué)和田間雜交試驗(yàn)上，菠蘿自交不親和的主要控制基因尚不明確。本研究利用生物信息學(xué)技術(shù)在菠蘿基因組中分離出21 個(gè)SLF/SFB家族成員，并對(duì)其理化特性、基因結(jié)構(gòu)、染色體分布、保守結(jié)構(gòu)域以及系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系進(jìn)行詳細(xì)分析，并對(duì)各基因在菠蘿不同組織中的表達(dá)模式進(jìn)行分析，同時(shí)對(duì)雌蕊授粉前后AcSLF 基因的表達(dá)變化進(jìn)行分析，以期為菠蘿自交不親和機(jī)制等方面研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料金菠蘿（MD2）、巴厘菠蘿（ComteDe Paris）種植于廣東省湛江市南亞熱帶作物研究所國(guó)家熱帶果樹(shù)種質(zhì)資源圃，2 種材料均為自交不親和材料，且巴厘菠蘿授粉金菠蘿為親和可育。

收集金菠蘿、巴厘菠蘿成熟花粉至離心管，用小毛刷蘸取花粉授于金菠蘿柱頭，分別于授粉2、6、24 h 后取花柱，立即液氮冷凍，同時(shí)采集金菠蘿葉片、雄蕊、未授粉雌蕊、果肉、莖、根組織樣品進(jìn)行冷凍，于–80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 菠蘿SLF/SFB 基因全基因組鑒定及理化特性分析 菠蘿基因組數(shù)據(jù)從Pineapple GenomicsDatabase（http：//pineapple.zhangjisenlab.cn/pineapple/html/index.html）[16]下載。從NCBI 中下載已報(bào)道的SLF/SFB 序列，采用MEGA 5 軟件[17]進(jìn)行ClustalW 核苷酸序列比對(duì)，然后利用HMMER 軟件的Hmmbuild 生成SLF/SFB 的HMM 種子文件，基于此種子文件，篩選菠蘿SLF/SFB 基因。

利用Expasy（https：//web.expasy.org/protparam/）在線軟件進(jìn)行理論等電點(diǎn)、蛋白分子量、不穩(wěn)定指數(shù)、脂溶系數(shù)、疏水指數(shù)等分析。利用Cell-PLoc2.0（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/）在線軟件預(yù)測(cè)亞細(xì)胞定位。利用SOPMA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html）在線軟件分析蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)。

1.2.2 菠蘿AcSLF 基因染色體定位 利用TBtools[18]軟件對(duì)菠蘿AcSLF 基因進(jìn)行染色體定位作圖。

1.2.3 菠蘿AcSLF 系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建 利用MEGA5.0軟件構(gòu)建菠蘿AcSLF 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建方法為鄰接法（Neighbor-joining method），bootstrap 值設(shè)置為1000。

1.2.4 菠蘿AcSLF 基因結(jié)構(gòu)及蛋白結(jié)構(gòu)域分析從菠蘿基因組數(shù)據(jù)庫(kù)獲得21 個(gè)AcSLFs 的基因組和CDS 序列， 使用GSDS （ http：//gsds. cbi.pku.edu.cn/）[19]在線軟件繪制各基因的內(nèi)含子–外顯子結(jié)構(gòu)圖。蛋白結(jié)構(gòu)域采用SMART（http：//www.smart.embl-heidelberg.de/）在線軟件進(jìn)行分析，并由TBtools 軟件進(jìn)行可視化作圖。

1.2.5 菠蘿AcSLF 基因表達(dá)分析 利用OMGARNA 提取試劑盒從菠蘿不同組織（葉片、雄蕊、雌蕊、果肉、莖、根以及授粉后雌蕊）中提取總RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。利用SYBRGreen qPCR Master Mix 在Quant StudioTM 6 FlexSystem 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 系統(tǒng)進(jìn)行qRT-PCR 分析，內(nèi)參基因?yàn)镻P2A[20]（引物序列信息見(jiàn)表1）。

使用2–ΔΔCT 方法[21]計(jì)算各基因的相對(duì)表達(dá)水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 菠蘿SLF/SFB 基因鑒定與理化特性分析

通過(guò)對(duì)菠蘿基因組檢索和鑒定，共獲得21 個(gè)SLF/SFB 基因， 按照其在染色體位置命名為AcSLF1～AcSLF21。對(duì)21 個(gè)菠蘿AcSLFs 進(jìn)行理化特性分析，結(jié)果顯示，AcSLFs 在氨基酸長(zhǎng)度、理論等電點(diǎn)、分子量有較大差異，AcSLFs 的氨基酸序列大小范圍為242～612 aa，分子量介于27.778～69.070 kDa 之間，預(yù)測(cè)的AcSLFs 的理論等電點(diǎn)（pI）為5.70～9.57，除AcSLF1、AcSLF5、AcSLF10、AcSLF15 外，其他蛋白偏堿性（pI>7）?？傮wAcSLFs 蛋白穩(wěn)定性較差，僅AcSLF19、AcSLF21較穩(wěn)定（表2）。

利用Cell-PLoc 2.0 軟件預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位，預(yù)計(jì)有18 種AcSLFs 蛋白只定位于細(xì)胞核，AcSLF4 定位在葉綠體，AcSLF7、AcSLF17 在細(xì)胞核與葉綠體中均有分布。通過(guò)分析AcSLFs 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)由α-螺旋（alpha helix）、延伸鏈（extended strand）、β-轉(zhuǎn)角（beta turn）和無(wú)規(guī)則卷曲（random coil）4 種構(gòu)型組成，其中α-螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲占60%以上，延伸鏈和β-轉(zhuǎn)角占30%左右，無(wú)規(guī)則卷曲占比最大約50%（表3）。

2.2 菠蘿AcSLFs 基因染色體定位

為明確菠蘿AcSLFs 基因在染色體上的分布，利用菠蘿基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中的基因位置信息，使用Tbtools 軟件對(duì)基因在染色體上位置進(jìn)行可視化（圖1）。結(jié)果顯示，AcSLF21 位于scaffold_1507，尚未定位到具體染色體位置，其余染色體不均勻地分布在14 條染色體上，其中AcSLF3、AcSLF4、AcSLF5、AcSLF6 位于LG02 號(hào)染色體，大部分基因位于染色體兩端。同時(shí)發(fā)現(xiàn)部分AcSLFs 基因與菠蘿RNase T2 家族基因發(fā)生連鎖，其中AcSLF4、AcSLF5、AcSLF6 與Aco001100 緊密連鎖，AcSLF8與Aco004758 連鎖，AcSLF14、AcSLF15 與Aco00-4148 連鎖。

2.3 菠蘿AcSLFs 進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建

為了解菠蘿AcSLFs 蛋白之間進(jìn)化關(guān)系，將21 個(gè)AcSLFs 蛋白序列與蘋果、梅、櫻桃等薔薇科植物、金魚(yú)草車前科植物、番茄、矮牽牛等茄科植物的SLF/SFB 蛋白序列進(jìn)行多重序列比對(duì)，通過(guò)NJ 的方法使用MEGA 6.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果如圖2 所示（藍(lán)色表示茄科植物，紅色表示金魚(yú)草車前科植物，綠色表示薔薇科植物，黃色表示菠蘿）。通過(guò)進(jìn)化樹(shù)分支聚類關(guān)系可以看出，番茄、多毛番茄和矮牽牛的SLF、SLFL 聚為一類，蘋果、梨、甜櫻桃的SLFL、FBX 和SFBB聚為一類，甜櫻桃、扁桃、梅的SFB 聚為一類，而菠蘿AcSLFs 與已報(bào)道的SLF/SFB 蛋白均未聚類到一起，說(shuō)明菠蘿AcSLFs 與薔薇科、車前科、茄科植物SLF/SFB 進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn)，在進(jìn)化樹(shù)分支上聚類程度較低，這也說(shuō)明了單子葉植物菠蘿與雙子葉植物親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

2.4 菠蘿AcSLFs 基因結(jié)構(gòu)及蛋白結(jié)構(gòu)域分析

在21 個(gè)SLF/SFB 家族成員中，11 個(gè)AcSLFs基因均含有內(nèi)含子，其中AcSLF3 含有4 個(gè)內(nèi)含子，其他10 個(gè)基因只包含1～2 個(gè)內(nèi)含子（圖3A），不同的AcSLFs 基因含有內(nèi)含子數(shù)量不同，而內(nèi)含子與基因分類無(wú)顯著相關(guān)性。對(duì)21 個(gè)菠蘿AcSLFs基因進(jìn)行蛋白結(jié)構(gòu)域分析，結(jié)果表明各AcSLFs基因在N 端具有F-box 保守結(jié)構(gòu)域， 其中AcSLF17、AcSLF19、AcSLF21、AcSLF3 只含有F-box 結(jié)構(gòu)域， 不含其他結(jié)構(gòu)域， AcSLF13、AcSLF16 在C 端具有F-box 關(guān)聯(lián)的FBA 結(jié)構(gòu)，另外AcSLF20、AcSLF4、AcSLF15、AcSLF5、AcSLF8基因含有Kelch 結(jié)構(gòu)域（圖3B）。

2.5 菠蘿AcSLFs 基因組織表達(dá)分析

為了研究菠蘿AcSLFs 基因組織表達(dá)模式，通過(guò)qRT-PCR 技術(shù)對(duì)21 個(gè)AcSLFs 基因在菠蘿雄蕊、雌蕊、葉片、果肉、莖和根不同組織的表達(dá)量進(jìn)行分析。結(jié)果顯示（圖4），不同的AcSLFs基因在菠蘿不同組織中表現(xiàn)出明顯的表達(dá)差異，其中，AcSLF1、AcSLF4、AcSLF13、AcSLF14、AcSLF15、AcSLF16 和AcSLF17 在葉片中呈最高表達(dá)量，AcSLF3、AcSLF7 在果肉中表達(dá)量最高，AcSLF5、AcSLF12、AcSLF18 在根中表達(dá)量高于其他組織，AcSLF6 在6 個(gè)組織部位表達(dá)量均較低，AcSLF1、AcSLF2、AcSLF4、AcSLF9、AcSLF10、AcSLF11、AcSLF15、AcSLF19、AcSLF20、AcSLF21在雄蕊中呈高表達(dá)量?？傮w來(lái)說(shuō)，大部分菠蘿AcSLFs 基因主要在菠蘿雄蕊或葉片中表達(dá)量高。

2.6 菠蘿AcSLFs 基因授粉前后的表達(dá)差異分析

通過(guò)對(duì)21 個(gè)AcSLFs 基因在未授粉金菠蘿雌蕊、自花授粉2、6、24 h 以及巴厘菠蘿授金菠蘿雌蕊2、6、24 h 的表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，AcSLF1、AcSLF2、AcSLF15 三個(gè)基因在授粉后表達(dá)顯著上調(diào)，尤其是異花授粉后6 h，表達(dá)量顯著高于未授粉雌蕊，在授粉后24 h 同樣具有較高表達(dá)量，同時(shí)異花授粉表達(dá)量高于自花授粉（圖5）。AcSLF5 在自花授粉后表達(dá)上調(diào)，而異花授粉后幾乎無(wú)表達(dá)，AcSLF10、AcSLF11、AcSLF17、AcSLF19、AcSLF20和AcSLF21 在異花授粉6 h 稍上調(diào)表達(dá)。在配子體自交不親和植物中，親和與不親和花粉均可在柱頭上萌發(fā)生長(zhǎng)，并伸入花柱，S-RNase 主要聚集在花柱上端， 當(dāng)花粉管受到雌蕊分泌的S-RNase 脅迫時(shí)，會(huì)啟動(dòng)相應(yīng)保護(hù)機(jī)制，花粉管編碼多個(gè)識(shí)別非自我S-RNase 的SLF 蛋白，SLF蛋白可識(shí)別并泛素化非自我S-RNase，使S-RNase喪失毒性，從而花粉管可繼續(xù)生長(zhǎng)，而“自身”花粉管在S-RNase 的毒性下喪失活性停止生長(zhǎng)[22-23]。

在菠蘿授粉后，AcSLF1、AcSLF2、AcSLF15 基因異花授粉顯著高于自花授粉，這說(shuō)明“非自我”花粉SLF 基因的高表達(dá)，有助于其更好地發(fā)揮解毒作用，暗示這3 個(gè)基因在菠蘿自交不親和中發(fā)揮重要作用。

3 討論

本研究通過(guò)全基因組檢索鑒定了21 個(gè)菠蘿AcSLFs，與矮牽牛16～20 個(gè)SLF 基因數(shù)目相當(dāng)[24]，與柑橘中報(bào)道113 個(gè)SLF/SLFL 基因相差較多[25]。

AcSLFs 在氨基酸長(zhǎng)度、理論等電點(diǎn)、分子量有較大差異，且絕大多數(shù)AcSLFs 蛋白為堿性蛋白，總體AcSLFs 蛋白穩(wěn)定性較差，僅AcSLF19、AcSLF21 較穩(wěn)定?；赟-RNase 介導(dǎo)的自交不親和反應(yīng)，雌蕊S 基因S-RNase 周圍存在多個(gè)SLF/SFB 共同行使花粉S 基因功能，通過(guò)形成SCF復(fù)合體泛素化非自我S-RNase，從而S-RNase 被26S 蛋白酶體降解，而SLF/SFB 無(wú)法識(shí)別降解自我S-RNase，導(dǎo)致自交不親和性[26-27]。通過(guò)染色體定位分析，發(fā)現(xiàn)20 個(gè)AcSLFs 基因定位在14 條染色體上，AcSLF21 未定位到具體染色體位置，同時(shí)發(fā)現(xiàn)AcSLF4、AcSLF5、AcSLF6、AcSLF8、AcSLF14、AcSLF15 與菠蘿RNase T2 家族基因連鎖，ZHAO 等[28]在菠蘿LG15 染色體上發(fā)現(xiàn)存在RNase T2 家族基因與F-box 基因緊密連鎖。

WILLIAMS 等發(fā)現(xiàn)矮牽牛SLF 基因均位于S-RNase 基因序列的下游，且與S-RNase 具有相反的轉(zhuǎn)錄方向[29-31]，目前尚不清楚是否所有配子體自交不親和植物的S 基因均具有此特性，在菠蘿中與S-RNase 連鎖的SLF 基因AcSLF6 、AcSLF15 位于S-RNase 基因下游，其余幾個(gè)基因位于上游，且在菠蘿中發(fā)現(xiàn)與S-RNase 連鎖的F-Box基因較少，遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于矮牽牛、柑橘等其他配子體自交不親和物種。

菠蘿AcSLFs 基因組織表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)AcSLF1、AcSLF2、AcSLF4、AcSLF8、AcSLF9、AcSLF10、AcSLF11、AcSLF15、AcSLF19、AcSLF20、AcSLF21在雄蕊中具有較高表達(dá)量，其中AcSLF1、AcSLF2、AcSLF15 基因在授粉后的花柱中表達(dá)顯著上調(diào)，且異花授粉顯著高于自花授粉，尤其在異花授粉6 h 表達(dá)量急劇升高，這說(shuō)明異花授粉誘導(dǎo)了其表達(dá)，隨著花粉管在雌蕊中的伸長(zhǎng)其表達(dá)量降低，但在授粉24 h 后仍然具有較高的表達(dá)量。張偉等[32]研究發(fā)現(xiàn)神灣與親和性不同的父本進(jìn)行授粉7 h后，親和性強(qiáng)的花粉管已伸長(zhǎng)至花柱中部。本研究前期利用苯胺藍(lán)染色發(fā)現(xiàn)親和花粉管在授粉24 h已達(dá)到花柱底端，異花授粉后AcSLF1、AcSLF2、AcSLF15 的表達(dá)趨勢(shì)與花粉管的生長(zhǎng)相吻合，其表達(dá)模式表明AcSLF1、AcSLF2、AcSLF15 可能是調(diào)控菠蘿自交不親和反應(yīng)的重要因子。本研究只分析了AcSLFs 在授粉后花柱包含花粉管一起的表達(dá)模式，還需進(jìn)一步建立體外花粉管培養(yǎng)及誘導(dǎo)不親和反應(yīng)，分析其在花粉管中的表達(dá)模式及作用機(jī)制。本研究對(duì)菠蘿SLF/SFB 家族成員進(jìn)行鑒定和表達(dá)分析，有助于進(jìn)一步尋找菠蘿自交不親和花粉S 決定因子，為研究菠蘿自交不親和機(jī)制研究提供良好的理論基礎(chǔ)。

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