氮化鈦鍍層和鎳鍍層釹鐵硼磁環(huán)的生物相容性實驗研究

張苗苗，任宇翔，王伊睿，孫宛婧，白紀(jì)剛，呂 毅，嚴(yán)小鵬*

（1.西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院肝膽外科，西安 710061；2.西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院精準(zhǔn)外科與再生醫(yī)學(xué)國家地方聯(lián)合工程研究中心，西安 710061；3.西安交通大學(xué)宗濂書院，西安 710061；4.西安交通大學(xué)啟德書院，西安 710061）

0 引言

磁吻合是利用特殊設(shè)計的磁性裝置，借助磁體間的磁場力來實現(xiàn)空腔臟器吻合重建的方法。由于磁吻合形式的特殊性而被稱為繼手工縫線吻合和機械釘式吻合之后的第三種吻合模式，又因磁吻合與內(nèi)鏡技術(shù)和介入技術(shù)相結(jié)合可實現(xiàn)常規(guī)方法無法實現(xiàn)的吻合，因此又被譽為“智慧吻合”[1]。消化道是磁吻合基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用最廣泛的領(lǐng)域，相關(guān)研究涉及食管磁吻合[2-4]、食管胃磁吻合[5]、胃空腸磁吻合[6-7]、小腸磁吻合[8-9]、結(jié)腸磁吻合[10-11]等。磁吻合裝置也可用于泌尿系統(tǒng)如輸尿管膀胱吻合[12]，還可用于氣管食管瘺病理動物模型的建立[13-14]以及治療性造瘺[15-16]等領(lǐng)域。

利用磁吻合裝置實現(xiàn)消化系統(tǒng)和泌尿系統(tǒng)管腔吻合重建時，受壓組織發(fā)生缺血—壞死—脫落，而受壓旁組織則發(fā)生粘連—修復(fù)—愈合的病理變化過程[17]，在吻合口建立后磁吻合裝置可經(jīng)消化系統(tǒng)或泌尿系統(tǒng)的自然腔道排出體外[18-21]。當(dāng)利用磁吻合裝置進行血管吻合時，不管是端端吻合還是側(cè)側(cè)吻合，磁吻合裝置可能需要永久留置體內(nèi)，因此血管磁吻合對吻合裝置的生物相容性提出了更高的要求。血管端端吻合時，磁環(huán)位于血管外，不與血液接觸，因此做好磁體的防腐蝕即可滿足應(yīng)用需求。血管側(cè)側(cè)吻合時，磁環(huán)位于血管內(nèi)，與血液直接接觸，因此磁環(huán)需要有良好的血液相容性。

電鍍鎳是目前釹鐵硼材料最常見的表面改性方法，能夠滿足工業(yè)和日常生活環(huán)境下的防腐蝕需求，但在胃液環(huán)境下抗腐蝕能力較差[22]。有研究顯示，氮化鈦鍍層后的釹鐵硼磁體抗體液腐蝕能力優(yōu)于鎳鍍層[23]。但有關(guān)氮化鈦鍍層和鎳鍍層釹鐵硼磁體生物相容性的評價較少，尤其是當(dāng)其應(yīng)用場景為血管側(cè)側(cè)吻合時。因此，本文通過體內(nèi)外實驗對課題組自行設(shè)計的用于血管側(cè)側(cè)吻合的氮化鈦鍍層和鎳鍍層的2 種釹鐵硼磁環(huán)的生物相容性進行測試和評價。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本實驗所用儀器有超聲清洗儀（SB5200DT，寧波新芝生物科技股份有限公司）、視頻光學(xué)接觸角測量儀（OCA-20，德國Dataphsics 公司）、酶標(biāo)儀（Multiskan Skyhigh，美國Thermo Fisher Scientific 公司）、掃描電鏡（KYKY-2000，日本HITCH 公司）；試劑有戊巴比妥鈉（美國Sigma）、無菌生理鹽水（陜西華山制藥廠）、無菌雙蒸水（實驗室自制）、稀釋的抗凝健康人全血（新鮮人血∶生理鹽水=4∶5）、富血小板血漿（PRP）（健康人全血提取而成）、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）（上海研拓生物科技有限公司）、2.5%戊二醛（上海源葉生物科技有限公司）、1%鋨酸（上海雅吉生物公司）、100%乙酸異戊酯（上海百舜生物科技有限公司）。

本實驗所用磁環(huán)由N45 燒結(jié)型釹鐵硼永磁材料加工而成，其中氮化鈦鍍層磁環(huán)為跑道型，長16 mm、寬9 mm，寬度和厚度均為1 mm，單個磁環(huán)質(zhì)量為0.215 g；鎳鍍層磁環(huán)為橢圓形，長軸10 mm、短軸4 mm，寬度和厚度均為1mm，單個磁環(huán)質(zhì)量為0.186 g。上述磁環(huán)由陜西金山電器有限公司加工，實物圖如圖1 所示。

圖1 磁環(huán)實物圖

1.2 實驗方法

1.2.1 接觸角測試

各取3 枚氮化鈦鍍層和鎳鍍層磁環(huán)經(jīng)超聲清洗儀清洗后利用OCA-20 視頻光學(xué)接觸角測量儀測量接觸角。測量時先設(shè)置電荷耦合器（charge couple device，CCD）的亮度，并調(diào)節(jié)載物套和針頭使之處于合適的位置。然后調(diào)節(jié)鏡頭進行對焦并設(shè)定標(biāo)尺，進一步調(diào)節(jié)基線的位置。設(shè)定液體體積為0.5 L 后開始進行試驗，待液滴滴落后再一次調(diào)節(jié)基線和液滴輪廓線，然后即可畫出接觸角。

1.2.2 組織相容性測試

該實驗經(jīng)西安交通大學(xué)生物醫(yī)學(xué)倫理委員會審批通過。選取SD 大鼠12 只（購于西安交通大學(xué)實驗動物中心），體質(zhì)量為180～220 g，雌雄各半，并隨機分為2 組，每組6 只。一組置入氮化鈦鍍層磁環(huán)作為實驗組，另一組置入鎳鍍層磁環(huán)作為對照組，另以正常大鼠作為空白對照，僅僅獲取正常的肌肉組織和大網(wǎng)膜組織。實驗方法如下[24]：氮化鈦鍍層和鎳鍍層磁環(huán)經(jīng)超聲清洗儀清洗后用環(huán)氧乙烷滅菌備用。所有大鼠采用3%戊巴比妥鈉（0.1 mL/100 g）腹腔注射麻醉，麻醉生效后仰臥位固定，用剃毛器剃除右后肢股部及腹部體毛，并于術(shù)區(qū)消毒鋪無菌巾。用組織剪剪開大鼠右后肢股內(nèi)側(cè)皮膚，長約10 mm，避開大血管及神經(jīng)，鈍性分離肌肉將磁環(huán)埋于肌肉組織間，之后縫合皮膚。取大鼠腹部正中切口，長約10 mm，將磁環(huán)置入大網(wǎng)膜處，關(guān)閉腹腔。術(shù)后3 個月，再次麻醉大鼠，探查磁環(huán)包埋部位的組織粘連情況并獲取磁環(huán)周圍肌肉組織和大網(wǎng)膜行HE 及Masson 染色。以大鼠正常肌肉組織及大網(wǎng)膜病理切片為對照，觀察炎性細胞浸潤及膠原纖維沉積情況。

1.2.3 溶血實驗

溶血實驗參照劉敬肖等[25]的實驗方法。取6 支無菌試管分別裝入預(yù)先用環(huán)氧乙烷滅菌處理的氮化鈦鍍層磁環(huán)和鎳鍍層磁環(huán)作為實驗組和對照組，每支試管內(nèi)加入10 mL 無菌生理鹽水，氮化鈦鍍層磁環(huán)編號為A 組，鎳鍍層磁環(huán)編號為B 組。另取6 支試管，其中3 支內(nèi)加入10 mL 無菌生理鹽水作為陰性對照組（C 組）；剩余3 支試管內(nèi)加入10 mL 無菌雙蒸水作為陽性對照組（D 組）。將上述試管置入37 ℃恒溫水浴箱內(nèi)預(yù)熱30 min，在每支試管內(nèi)加入0.2 mL稀釋的抗凝健康人全血（新鮮人血∶生理鹽水=4∶5），繼續(xù)置于37 ℃恒溫水浴箱內(nèi)。60 min 后取出試管，然后以3000 r/min 離心5 min。對每支試管取離心后的上清液3 份，每份100 μL，加入到96 孔培養(yǎng)板中，用酶標(biāo)儀測量每份樣本在540 nm 處的吸光度。根據(jù)以下公式計算溶血率：

式中，Dt為待測樣品吸光度；Dnc為陰性對照組吸光度；Dpc為陽性對照組吸光度。

1.2.4 血小板黏附實驗

血小板黏附實驗參照吳勃等[26]文獻中介紹的實驗方案：（1）在12 孔培養(yǎng)板中分別放置預(yù)處理過的氮化鈦鍍層磁環(huán)和鎳鍍層磁環(huán)，緩慢加入3 mL 事先制備的PRP，PRP 的制備參照文獻[27]的方法，然后放入CO2培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)0.5 h 和3 h；（2）預(yù)定培養(yǎng)時間結(jié)束后，去除PRP 后用PBS 反復(fù)緩慢漂洗3次，每次1 min，棄去漂洗液，加入2.5%戊二醛使磁環(huán)完全被浸泡，然后在4 ℃冰箱中固定12 h；（3）棄去戊二醛固定液，用PBS 漂洗后加入1%鋨酸使磁環(huán)完全被浸泡，然后置于4 ℃冰箱中固定1 h；（4）棄去鋨酸，加入蒸餾水進行漂洗，然后依次加入體積百分比為50%、60%、70%、80%、90%、100%的乙醇溶液進行梯度脫水10 min；（5）用100%乙酸異戊酯浸泡樣品10 min，之后用臨界點干燥儀進行干燥；（6）對經(jīng)上述處理后的樣品進行噴金，用掃描電鏡觀察樣品表面的血小板黏附數(shù)量和聚集狀態(tài)。

2 結(jié)果

2.1 接觸角測試

測試結(jié)果顯示，3 枚氮化鈦鍍層磁環(huán)接觸角分別為98°、99°、100°，3 枚鎳鍍層磁環(huán)接觸角分別為100°、101°、106°，均＞90°，提示磁環(huán)表面為疏水性，說明液體不易在其表面浸潤吸附。

2.2 組織相容性測試

磁環(huán)置入過程順利，所有大鼠均存活至觀察終點。磁環(huán)周圍肌肉組織及大網(wǎng)膜的HE 及Masson 染色可見肌肉組織形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，以正常肌肉組織及大網(wǎng)膜組織病理為參照，未見明顯的炎性細胞浸潤和組織異物反應(yīng)（如圖2、3 所示）。

圖2 磁環(huán)留置后肌肉組織學(xué)觀察結(jié)果

圖3 磁環(huán)留置后大網(wǎng)膜組織學(xué)觀察結(jié)果

2.3 溶血實驗

各組吸光度測試結(jié)果見表1。根據(jù)公式計算氮化鈦鍍層磁環(huán)的溶血率為0.23%，鎳鍍層磁環(huán)的溶血率為0.84%?？梢姷佸儗哟怒h(huán)的溶血性能優(yōu)于鎳鍍層磁環(huán)。

表1 各組上清液在540 nm 處的吸光度測試結(jié)果

2.4 血小板黏附實驗

2 種磁環(huán)分別與PRP 共培養(yǎng)0.5 h 后，掃描電鏡顯示氮化鈦鍍層磁環(huán)表面未見明顯血小板黏附，而鎳鍍層磁環(huán)表面可見少量血小板黏附（如圖4 所示）；當(dāng)磁環(huán)與PRP 共培養(yǎng)3 h 后，氮化鈦鍍層磁環(huán)表面有散在血小板黏附，并且可見偽足生長，鎳鍍層磁環(huán)表面黏附的血小板數(shù)量明顯增多并呈聚集性黏附，偽足生長明顯（如圖5 所示）。

圖4 磁環(huán)與PRP 共培養(yǎng)0.5 h 后掃描電鏡觀察結(jié)果

圖5 磁環(huán)與PRP 共培養(yǎng)3 h 后掃描電鏡觀察結(jié)果

3 討論

血管磁吻合包括血管端端磁吻合和血管側(cè)側(cè)磁吻合。與血管端端磁吻合不同，血管側(cè)側(cè)磁吻合時磁環(huán)位于血管腔內(nèi)，與血液直接接觸，因此對磁環(huán)的生物相容性要求極高。既往有研究報道利用釹鐵硼磁環(huán)進行冠狀動脈搭橋手術(shù)，術(shù)后磁環(huán)留置在人體內(nèi)，該磁環(huán)使用氮化鈦鍍層，在患者服用抗凝藥的情況下吻合口可獲得良好的長期通暢性[28]，但也有個別患者因停用抗凝藥而導(dǎo)致吻合口閉塞的發(fā)生[29]。本研究團隊前期首次提出血管側(cè)側(cè)吻合用于門靜脈高壓的限制性分流，并設(shè)計了用于血管側(cè)側(cè)吻合的磁環(huán)[30]。在本團隊前期研究過程中發(fā)現(xiàn)，磁吻合門腔分流術(shù)后，與血液接觸的磁環(huán)表面將形成一層薄的血管內(nèi)膜覆蓋整個磁環(huán)[31]，這樣的病理變化提示，磁環(huán)早期需要具備較高的血液相容性，避免短期內(nèi)形成大量附壁血栓，為血管內(nèi)膜的覆蓋創(chuàng)造條件。

釹鐵硼磁體表面改性方案多樣，在具體應(yīng)用時根據(jù)不同的環(huán)境可選擇最適宜的表面改性方案。血管磁吻合裝置的磁體表面改性方法研究較少，尚無公認(rèn)的最優(yōu)化表面改性方案，這是導(dǎo)致血管磁吻合裝置臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用較慢的重要原因之一。因此對不同表面改性方案的釹鐵硼磁環(huán)的生物相容性進行比較，對血管磁吻合裝置的設(shè)計、加工具有重要的參考價值。

生物相容性評價包括組織相容性和血液相容性2 個方面。磁外科技術(shù)中磁體的體內(nèi)留置分為暫時留置、短期留置、中-長期留置、長期-永久留置等類型[32]，根據(jù)留置部位可分為器官組織內(nèi)留置如磁性水凝膠輔助內(nèi)鏡黏膜下剝離術(shù)[33-34]、器官腔隙內(nèi)留置如磁錨定輔助腹腔鏡手術(shù)[35-36]，不同留置類型和留置部位下對磁體的表面改性要求差異巨大。本研究中磁環(huán)的留置屬于器官腔隙內(nèi)的永久留置。本研究通過SD 大鼠肌肉和大網(wǎng)膜包埋評價了氮化鈦鍍層和鎳鍍層磁環(huán)的組織相容性，大體標(biāo)本及組織學(xué)觀察未見明顯組織粘連、異物肉芽腫形成及炎性細胞浸潤。溶血實驗顯示氮化鈦鍍層磁環(huán)優(yōu)于鎳鍍層磁環(huán)。血小板黏附實驗結(jié)果也表明磁環(huán)與PRP 共培養(yǎng)0.5 h和3 h 后，氮化鈦鍍層磁環(huán)的血小板黏附少于鎳鍍層磁環(huán)。本文從接觸角、組織相容性、溶血率及體外血小板黏附等多維度評價了氮化鈦鍍層與鎳鍍層釹鐵硼磁環(huán)的生物相容性，但缺乏在體的血液相容性評價，下一步研究中可考慮將磁環(huán)置入大動物血管內(nèi)評價其血栓形成情況。

綜上所述，氮化鈦鍍層釹鐵硼磁環(huán)與鎳鍍層釹鐵硼磁環(huán)相比在接觸角、組織相容性指標(biāo)上相近，但在溶血率和血小板黏附指標(biāo)方面，氮化鈦鍍層磁環(huán)明顯優(yōu)于鎳鍍層磁環(huán)，這提示磁外科體內(nèi)置入裝置應(yīng)將氮化鈦鍍層作為優(yōu)先考慮的表面改性方案。