豬鏈球菌莢膜多糖抗血清的制備及在血清分型中的應(yīng)用

胡群 肖琦 溫立斌 彭大新 何孔旺

摘要：為獲得豬鏈球菌莢膜多糖及其抗血清，采用高壓破碎法、乙醇分級沉淀法、酶解法以及Sevage法提取純化了豬鏈球菌2、3、7、9型莢膜多糖，采用己二酸二酰肼（ADH）間橋法將莢膜多糖與牛血清蛋白（BSA）偶聯(lián)，將其制備成油乳疫苗免疫BALB/c純系雌性小鼠制備抗血清，同時制備了豬鏈球菌2、3、7、9型全菌滅活苗抗血清進(jìn)行了間接ELISA試驗及玻片試驗檢測。試驗結(jié)果顯示，制備了高純度的莢膜多糖，對莢膜多糖-牛血清白蛋白偶聯(lián)物分析，莢膜多糖偶聯(lián)蛋白后的分子量變大，莢膜多糖與牛血清白蛋白偶聯(lián)比為1 ∶1，免疫小鼠表現(xiàn)出較高的免疫原性。而將單獨的4種莢膜多糖以及莢膜多糖與牛血清白蛋白（牛血清白蛋白）混合作為比較也免疫小鼠不能激活免疫系統(tǒng)產(chǎn)生IgG抗體，不具有免疫原性。莢膜多糖結(jié)合蛋白抗血清與全菌滅活苗抗血清同時進(jìn)行交叉ELISA以及玻片凝集試驗，結(jié)果表明這4型莢膜多糖結(jié)合蛋白抗血清不與其他型菌株發(fā)生反應(yīng)，具有型特異性，而全菌滅活苗抗血清與其他型菌株會發(fā)生一定程度的交叉反應(yīng)。此研究結(jié)果為豬鏈球菌亞單位疫苗的研制以及豬鏈球菌分型試劑的制備提供了試驗依據(jù)。

關(guān)鍵詞：豬鏈球菌；莢膜多糖；抗血清；間接ELISA；玻片凝集試驗

中圖分類號：S852.4? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-1302（2023）13-0189-08

豬鏈球菌（Streptococcus suis，SS）是一種世界范圍內(nèi)危害嚴(yán)重的人畜共患病原體，病豬、健康豬以及臨床康復(fù)豬均可攜帶［1-3］。豬鏈球菌可導(dǎo)致豬出現(xiàn)急性敗血癥、肺炎、腦膜炎和關(guān)節(jié)炎，發(fā)生不可逆轉(zhuǎn)的后遺癥；也會感染人并引起死亡［4］。在過去的20年里，豬鏈球菌是中國大多數(shù)養(yǎng)豬場最常見的病原菌，對許多亞洲國家的養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大損害［5］。

根據(jù)豬鏈球菌莢膜多糖抗原成分的差異性，可分為35個血清型（1～34型、1/2型），但經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)20、22、26、32、34型不屬于豬鏈球菌，因此目前認(rèn)為剩余的29個血清型是真正的豬鏈球菌［6］。具有致病能力的血清型主要集中在1～9血清型，其中2型流行最廣且分離率最高［7］，血清型3、7、9在包括我國在內(nèi)的許多國家都很常見［8］。

豬鏈球菌的主要毒力因子包括莢膜多糖、溶菌酶釋放蛋白、細(xì)胞外因子以及溶血素等［9］。有研究表明，莢膜多糖主要是通過抗吞噬作用保護(hù)豬鏈球菌抵抗免疫反應(yīng)，是豬鏈球菌重要的毒力因子和保護(hù)性抗原［10］，可以作為疫苗開發(fā)的主要靶抗原。但是莢膜多糖抗原免疫原性較差［11］，試驗表明將莢膜多糖與載體蛋白偶聯(lián)后可以大大提高莢膜多糖抗原的免疫原性［12］。根據(jù)偶聯(lián)劑的不同，常用方式有2種：己二酸二酰肼（ADH）間橋法以碳二亞胺（EDAC）作偶聯(lián)劑，以及還原氨基化法用過碘酸鈉（NaIO4）將側(cè)鏈基團(tuán)氧化形成反應(yīng)性醛基基團(tuán)［13］。

由于豬鏈球菌血清型多且分布廣，上世紀(jì)80年代澳大利亞、加拿大、荷蘭等國家就已經(jīng)使用具有完整莢膜多糖的滅活菌作為免疫原制備出豬鏈球菌抗血清，并將其應(yīng)用于玻片凝集試驗、毛細(xì)沉淀試驗等最常見的血清學(xué)方法用于血清型鑒定，隨后又出現(xiàn)了PCR、MLST等檢測方法。目前國內(nèi)最常用的豬鏈球菌檢測方法是PCR檢測。莢膜多糖是分型的依據(jù)，滅活菌體因具有完整的豐富莢膜經(jīng)常被作為免疫原進(jìn)行抗血清的制備，但滅活菌體由于含有多種抗原會導(dǎo)致交叉反應(yīng)的出現(xiàn)，需要通過交叉吸附試驗來去除各血清型之間的交叉反應(yīng)。而本研究采用乙醇分級沉淀法、Sevage法提取純化了豬鏈球菌2、3、7、9型的莢膜多糖，將其與牛血清白蛋白偶聯(lián)制成莢膜多糖亞單位疫苗免疫小鼠制備抗血清，并采用這4種抗血清對實驗室保存的其他已經(jīng)定型的豬鏈球菌進(jìn)行玻片凝集試驗鑒定其特異性。從而為豬鏈球菌不同血清型的鑒定和主要血清型流行情況調(diào)查提供診斷試劑，為豬鏈球菌病的診斷及防控提供支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 試驗所用豬鏈球菌株各血清型菌株由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所分離、鑒定和保存。

1.1.2 主要試劑和耗材 THB培養(yǎng)基購自美國BD公司；溶菌酶購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；蛋白酶K購自上海源葉公司；正丁醇、氯仿、無水乙醇、苯酚、葡萄糖、H2SO4 均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；NaHCO3、Na2CO3購自西隴化工股份有限公司；Bradford蛋白濃度測定試劑盒（去垢劑兼容型）購自碧云天生物技術(shù)有限公司；脫脂奶粉購自伊利公司；明膠購自Amresco公司；牛血清白蛋白購自南京助研生物技術(shù)有限公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記HRP親和純化山羊抗鼠IgG（H+L）二抗購自公司；單組分TMB顯色液購自湖州英創(chuàng)生物科技有限公司；ELISA酶標(biāo)板購自Corning Incorporated公司；弗式完全佐劑和弗式不完全佐劑購自Sigma公司。

1.1.3 試驗動物 4周齡無特定病原體（specific pathogen free，SPF）的BALB/c純系雌性小鼠購自上海實驗動物中心。

1.2 方法

1.2.1 莢膜多糖抗原的制備以及含量的測定 將豬鏈球菌2、3、7、9型菌株置于37 ℃靜止培養(yǎng) 15 h，將上述獲得的菌液4 ℃、6 000 r/min低溫離心 5 min，收集菌體；將菌體用滅菌PBS清洗3次；再加入50 mL滅菌PBS重懸后加入終濃度為 0.25 mg/mL 的溶菌酶，37 ℃裂解過夜；將上述溶液4 ℃、9 000 r/min離心30 min，收集上清，使用 0.22 μm 針頭濾器過濾上清；將上清液加入終濃度為100 μg/mL的蛋白酶K，55 ℃過夜；80 ℃條件下處理30 min滅活酶，冷卻至室溫；將上述處理后的溶液加入CaCl2溶液至終濃度0.1 mol/L，攪拌1 h后，按體積比加入終濃度為25％的無水乙醇充分混合，4 ℃作用12 h去核酸后離心30 min后收集上清液；將上述上清液加入終濃度80%（體積分?jǐn)?shù)）的無水乙醇充分混合后，4 ℃靜置12 h然后離心30 min，收集得到的沉淀為粗多糖；將收集到的粗多糖用蒸餾水溶解，Sevage溶液（正丁醇 ∶氯仿=1 ∶4） ∶多糖水=1 ∶4充分混合后，9 000 r/min低溫離心 10 min，分離得到清液，如此重復(fù)直至看不到中間分層的蛋白，將去蛋白的莢膜多糖液用80％（體積分?jǐn)?shù)）無水乙醇沉淀 9 000 r/min 離心30 min，最后凍干得純化的莢膜多糖抗原。

1.2.2 莢膜多糖質(zhì)量檢測

1.2.2.1 莢膜多糖含量的測定 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：取9個EP管，分別加入0.6 mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0、4.8、9.6、14.4、19.2、24、28.8、33.6、36 μL，各管中加入蒸餾水稀釋到60 μL，再加入 180 μL 顯色液充分混勻，做3個平行，100 ℃金屬浴中加熱25 min并冷卻，用酶標(biāo)儀測定吸光度D490 nm值并作標(biāo)準(zhǔn)曲線。多糖含量的測定：將凍干的莢膜多糖用滅菌蒸餾水進(jìn)行適當(dāng)稀釋后取5 μL樣品后加蒸餾水補至60 μL混勻后加入180 μL顯色液，按苯酚-硫酸法檢測樣品溶液的D490 nm值后將其帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程后所得的濃度，再根據(jù)公式：多糖含量=0.9×C×D/m×100%，計算得出莢膜多糖中多糖含量。其中：C是指莢膜多糖樣品液中單糖的濃度；m是指莢膜多糖樣品液中多糖的質(zhì)量；D是指莢膜多糖樣品液被稀釋的倍數(shù)；0.9是指把葡萄糖換算成多糖后的校正系數(shù)。

1.2.2.2 莢膜多糖中雜蛋白含量的測定 按照Bradford蛋白濃度測定試劑盒（去垢劑兼容型）操作，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和使用的樣品體積計算出樣品中的蛋白濃度。

1.2.2.3 莢膜多糖中核酸含量的測定 利用微量紫外分光光度計測定核酸濃度。

1.2.3 莢膜多糖-蛋白偶聯(lián)物的制備 取莢膜多糖粉末配制成5 mg/mL的溶液，取3 mL多糖溶液與0.15 g ADH振蕩混勻，再加入0.03 g EDAC振蕩混勻，用1 mol/L的HCl調(diào)整pH值為5.6。室溫緩慢振蕩反應(yīng)4 h后，將反應(yīng)混合物裝在透析袋4 ℃條件下，用0.2 mol/L的NaCl透析12 h，多次換液以除去ADH和EDAC。將上述衍生物加入牛血清白蛋白1 ∶1質(zhì)量比，振蕩混勻，用1 mol/L的HCl將混合物的pH值調(diào)節(jié)至5.6，然后再加入終濃度為0.5 mol/L的EDAC振蕩混勻。用1 mol/L的HCl維持pH值，4 ℃條件下緩慢振蕩反應(yīng)12 h，然后將該混合物裝入透析袋中，用0.2 mol/L的NaCl進(jìn)行透析48 h以除去EDAC等小分子。將上述溶液裝入截留分子量300 ku透析袋透析24 h以去掉游離的牛血清白蛋白，將上述溶液凍干最終得到莢膜多糖-蛋白偶聯(lián)物。

1.2.4 莢膜多糖-蛋白偶聯(lián)物的分析

1.2.4.1 偶聯(lián)物的定性分析? 用PBS分別將多糖及莢膜多糖-蛋白偶聯(lián)物稀釋至適宜濃度，使用紫外可見分光光度計對莢膜多糖、牛血清白蛋白以及偶聯(lián)物進(jìn)行全波長紫外掃描，鑒定是否偶聯(lián)成功。

1.2.4.2 偶聯(lián)物的SDS-PAGE分析 將莢膜多糖-蛋白偶聯(lián)物與牛血清白蛋白稀釋至適宜濃度，進(jìn)行SDS-PAGE分析。

1.2.4.3 偶聯(lián)物的定量分析 測定莢膜多糖-蛋白偶聯(lián)物中的多糖含量，同時使用Bradford法對多糖蛋白偶聯(lián)物中蛋白含量進(jìn)行測定，計算偶聯(lián)比。

1.2.5 莢膜多糖抗血清的制備

1.2.5.1 疫苗制備 根據(jù)上述測得的多糖含量，將豬鏈球菌2型莢膜多糖（CP2）、豬鏈球菌3型莢膜多糖（CP3）、豬鏈球菌7型莢膜多糖（CP7）和豬鏈球菌9型莢膜多糖（CP9）多糖偶聯(lián)物進(jìn)行適當(dāng)稀釋，分別與弗氏完全佐劑及弗氏不完全佐劑進(jìn)行等體積混合，使混合物中莢膜多糖達(dá)到50 μg；將CP2、CP3、CP7和CP9多糖進(jìn)行適當(dāng)稀釋，分別與弗氏完全佐劑及弗氏不完全佐劑進(jìn)行等體積混合，使混合物中莢膜多糖達(dá)到50 μg；根據(jù)上述測得的多糖含量和牛血清白蛋白含量，將CP2、CP3、CP7和CP9多糖進(jìn)行適當(dāng)稀釋與牛血清白蛋白混合，分別與弗氏完全佐劑及弗氏不完全佐劑進(jìn)行等體積混合，使混合物中莢膜多糖達(dá)到50 μg。

1.2.5.2 小鼠免疫和采血 小鼠隨機分為13組，每組5只；其中4組分別免疫CP2、CP3、CP7和CP9多糖偶聯(lián)蛋白結(jié)合疫苗；4組分別免疫多糖CP2、CP3、CP7和CP9疫苗；4組分別免疫CP2、CP3、CP7和CP9多糖和牛血清白蛋白混合物；1組為對照組。首免時采用皮下免疫注射3種弗氏完全佐劑混合物，劑量為0.2 mL/只，以PBS為陰性對照；首免后14 d進(jìn)行二次免疫，皮下免疫注射上述弗氏不完全佐劑混合物，劑量0.2 mL/只，陰性對照注射同樣劑量的PBS；首免后28 d，將多糖質(zhì)量同樣為50 μg的偶聯(lián)物不加任何佐劑進(jìn)行腹腔注射，對照注射同樣劑量PBS。分別在免疫后14、28、35 d隨機對3只小鼠進(jìn)行眼眶采血，三免后1周進(jìn)行小鼠摘眼球采血并分離血清。

1.2.6 全菌滅活苗抗血清的制備 將豬鏈球菌2、3、7、9型菌種接種于THB固體培養(yǎng)基37 ℃培養(yǎng) 24 h，挑取單菌落置于5 mL THB液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)至各菌株的平臺期，做菌落平板計數(shù)，同時以終濃度0.3%的甲醛37 ℃ 100 r/min滅活菌體 48 h。無菌條件下制備油苗（油相 ∶水相=2 ∶1），取乳化后的油苗滴入水中不散開則證明乳化結(jié)束，進(jìn)行質(zhì)量檢測。4周齡BALB/C小鼠分為5組，試驗組4組，每組5只小鼠，空白對照組1組，滅活苗終濃度含菌量為4×109 CFU/mL，腹腔注射 0.2 mL，在 14 d 和28 d時按同樣劑量和途徑加強免疫，最后一次免疫后7 d采血分離血清，-20 ℃保存。

1.2.7 間接ELISA檢測抗體水平 將各多糖按照確定的最佳抗原包被濃度包被酶聯(lián)板，每孔 100 μL，4 ℃過夜，用PBST洗滌4次，每次3 min，每孔加入200 μL 1%明膠封閉液，37 ℃封閉2 h，將各組待檢測血清隨機取3份以1 ∶100稀釋，置于37 ℃孵育20 min，用PBST洗滌4次，每孔加1 ∶1 000羊抗鼠IgG-HRP 100 μL，置于37 ℃中反應(yīng)20 min，洗滌4次，避光顯色10 min，加入終止液，測D450 nm。

1.2.8 交叉ELISA 將上述所有分組的抗血清分別與CP2、CP3、CP7和CP9之間交叉孵育進(jìn)行間接ELISA的檢測。

1.2.9 玻片凝集試驗 將筆者所在實驗室保存的豬鏈球菌2、3、7、9型菌種，接種于THB固體培養(yǎng)基上，37 ℃恒溫箱培養(yǎng)24 h后做凝集抗原。將莢膜多糖抗血清與全菌滅活苗抗血清用生理鹽水稀釋2、4、8倍后取10 μL于載玻片上，用接種環(huán)蘸取各型菌株放入血清中涂勻，陰性小鼠血清做對照，2～5 min 觀察有無凝集，每組做3個技術(shù)重復(fù)。按照最佳稀釋度的抗血清取10 μL于載玻片上，用接種環(huán)蘸取豬鏈球菌4、5、6、11、12、13、15、16、17、18、20、21、24、25、26、27、28、29、30、31、33型做玻片凝集試驗，每組做3個技術(shù)重復(fù)。采用2、3、7、9型莢膜多糖抗血清以及全菌滅活苗抗血清鑒定各型菌株放入血清中涂勻，陰性小鼠血清做對照，2～5 min觀察有無凝集，每組做3個技術(shù)重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 莢膜多糖質(zhì)量檢測

2.1.1 莢膜多糖含量的測定 由圖1可見，線性回歸方程為：y=0.01x-0.033 5，r2=0.994 2。根據(jù)公式：多糖含量=0.9×C×D/m×100%，計算得出豬鏈球菌2、3、7、9型中莢膜多糖含量分別為70.1%、72%、80.1%、76.7%。

2.1.2 莢膜多糖中蛋白含量的測定 按照Bradford蛋白濃度測定試劑盒（去垢劑兼容型）操作，結(jié)果如圖2所示。線性回歸方程為：y=0.640 5x+1.162 7，r2=0.995 2。即提取的豬鏈球菌2、3、7、9型莢膜多糖中雜蛋白的濃度各為0.01、0.005、0.012、0.011 mg/mL。

2.1.3 莢膜多糖中核酸含量的測定 提取的豬鏈球菌2、3、7、9型莢膜多糖中核酸的濃度各為0.018、0.04、0.02、0.011 mg/mL。

2.2 莢膜多糖-蛋白偶聯(lián)物的分析

2.2.1 偶聯(lián)物的定性分析 用紫外光分光光度計200～400 nm對CP2、CP2-牛血清白蛋白偶聯(lián)物、牛血清白蛋白掃描，結(jié)果如圖3所示，CP2-BSA從 200 nm 向210 nm偏移，符合偶聯(lián)物的特征。其他3種莢膜多糖-蛋白偶聯(lián)物與CP2相似。

2.2.2 偶聯(lián)物的SDS-PAGE分析 牛血清白蛋白的分子量為66 ku，一般多糖的分子質(zhì)量在400～600 ku之間，SDS-PAGE結(jié)果如圖4所示，可看到4種偶聯(lián)物基本都分布在膠孔處，與牛血清白蛋白相比，4種偶聯(lián)物分子大小顯著增加，符合偶聯(lián)物的特征。

2.2.3 偶聯(lián)物的定量分析 對莢膜多糖蛋白結(jié)合

物中的多糖含量進(jìn)行測定，同時使用 Lowry法對莢膜多糖蛋白結(jié)合物中牛血清白蛋白含量進(jìn)行測定，偶聯(lián)比結(jié)果見表1。

2.2.4 間接ELISA檢測抗體水平

2.2.4.1 多糖結(jié)合蛋白抗血清ELISA檢測抗體IgG水平 試驗結(jié)果（圖5）顯示，只有莢膜多糖結(jié)合蛋白苗抗血清D450 nm可以達(dá)到2左右，單獨的莢膜多糖組以及莢膜多糖與牛血清白蛋白混合組均不能引起IgG抗體的產(chǎn)生。

2.2.4.2 全菌滅活苗抗血清ELISA檢測抗體IgG水平 全菌滅活苗抗血清D450 nm接近1（圖6）。

2.2.5 交叉ELISA 將上述制備的抗血清進(jìn)行交叉ELISA，結(jié)果顯示豬鏈球菌3型全菌滅活苗的抗血清與CP7存在交叉反應(yīng)，而莢膜多糖抗血清均無反應(yīng)，特異性好（表2、表3）。

2.2.6 玻片凝集試驗鑒定豬鏈球菌血清型 莢膜多糖結(jié)合蛋白抗血清稀釋至2倍、全菌滅活苗抗血清原液不稀釋，與不同豬鏈球菌進(jìn)行玻片凝集試驗。結(jié)果（圖7）顯示，各型莢膜多糖結(jié)合蛋白抗血清以及全菌滅活苗抗血清分別與各型凝集原之間發(fā)生強凝集反應(yīng)，陰性對照血清無凝集。2、3、7、9型莢膜多糖結(jié)合蛋白抗血清針對4、5、6、11、12、13、15、16、17、18、20、21、24、25、26、27、28、29、30、31、33型菌株無凝集；21型豬鏈球菌與2、7、9型全菌滅活苗抗血清有少量凝集，29型豬鏈球菌與2、3、9型全菌滅活苗抗血清有少量凝集，30、31、33型菌株與SS3全菌滅活苗抗血清有少量凝集；30、31型菌株與SS7全菌滅活苗抗血清有少量凝集（圖8）。表明各型莢膜多糖結(jié)合蛋白抗血清特異性好，而全菌滅活苗抗血清會有不同程度的交叉反應(yīng)。

3 討論

莢膜多糖結(jié)合蛋白疫苗對莢膜多糖的質(zhì)量要求很高，需要將雜蛋白以及核酸去除，核酸去除方法包括乙醇沉淀法、酶解法、CTAB沉淀法和活性炭吸附法等，蛋白去除方法有酸沉淀法、苯酚抽提法、Sevage法、酶解法、脫氧膽酸鈉法等［14］。張紫恒等發(fā)現(xiàn)采用靜置法培養(yǎng)菌株多糖產(chǎn)量高［15］，故本研究采用靜置法37 ℃培養(yǎng)15 h后通過蛋白酶K初步去除蛋白、使用乙醇分級沉淀法有效去除核酸之后Sevage法進(jìn)一步去除蛋白，成功提取純化了豬鏈球菌2、3、7、9型莢膜多糖，且莢膜多糖雜蛋白濃度均小于0.01 mg/mL，核酸濃度均小于0.04 mg/mL，表明純化后的莢膜多糖中僅有微量核酸殘留，幾乎沒有蛋白殘留。該提取步驟成本低、流程簡單，為豬鏈球菌莢膜多糖提取純化工藝線性放大、工業(yè)化生產(chǎn)提供了試驗數(shù)據(jù)。Goyette-Desjardins G等通過還原氨基化法將豬鏈球菌2型CPS與破傷風(fēng)類毒素偶聯(lián)制備了莢膜多糖結(jié)合蛋白疫苗并在豬體內(nèi)評估了偶聯(lián)后疫苗的免疫學(xué)特性，與滅活苗比較保護(hù)率相差無幾［16］。周琪等利用己二酸二酰肼（ADH）間橋法制備了副豬嗜血桿菌莢膜多糖抗血清，可用于菌種及菌株檢測等［17］。本試驗采用己二酸二酰肼（ADH）間橋法制備了CPS-BSA，將莢膜多糖用作包被抗原采用間接ELISA對小鼠血清抗體進(jìn)行檢測分析，試驗結(jié)果表明單純的莢膜多糖以及莢膜多糖與牛血清白蛋白混合后接種小鼠均不能激活免疫系統(tǒng)產(chǎn)生IgG，而與牛血清白蛋白偶聯(lián)后的油乳劑疫苗接種小鼠后產(chǎn)生了具有特異性的多糖抗體。之后采用全菌滅活苗抗血清與莢膜多糖偶聯(lián)蛋白苗抗血清進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)全菌滅活苗抗血清與其他豬鏈球菌血清型有交叉，可能是由于菌體中有共同抗原導(dǎo)致，而莢膜多糖偶聯(lián)蛋白苗抗血清與豬鏈球菌4、5、6、11、12、13、15、16、17、18、20、21、24、25、26、27、28、29、30、31、33型均無反應(yīng)，特異性好，符合絕大多數(shù)血清使用要求，可用于養(yǎng)殖場、實驗室等菌種及菌株檢測與血清型鑒定，且對其他多種含莢膜多糖的細(xì)菌抗血清制備提供了參考。

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